Методическая статья

Количественный Glycomics и протеомикс Комбинированная стратегия очистки

16.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53735

⸱

8 марта 2016 г.

 ,  , 
1Department of Chemistry, North Carolina State University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Был разработан протокол с высокой пропускной способностью для комбинированной очистки протеомики и гликомики, а также количественного определения ЖХ-МС/МС в плазме. Анализ деамидационных мотивов N-связанного гликозилирования был специфичен для дегликозилированных сайтов. Точное количественное определение N-гликанов было достигнуто путем сопряжения разделения N-гликанов с помощью фильтра с нормализацией индивидуальности при мечении с помощью стратегии меток гликангидразидов.

Аннотация

В биологических и клинических науках растет желание интегрировать и коррелировать несколько классов биомолекул для разгадки биологии, определения путей, улучшения лечения, понимания болезней и помощи в открытии биомаркеров. N-связанное гликозилирование является одной из наиболее важных и надежных посттрансляционных модификаций белков и регулирует важнейшие функции клеток, такие как передача сигналов, адгезия и ферментативная функция. Аналитические методы очистки и анализа N-гликанов оставались относительно статичными в течение последнего десятилетия. Несмотря на то, что они точны и эффективны, они обычно требуют значительных знаний и ресурсов. Несмотря на то, что были разработаны некоторые схемы высокопроизводительной очистки, они еще не нашли широкого распространения и часто основаны на обогащении гликопептидами. Один из многообещающих методов, разработанный Thomas-Oates et al., разделение N-гликанов с помощью фильтра (FANGS), был качественно продемонстрирован на тканях. В данной работе мы адаптировали FANGS к плазме и связали ее со стратегией нормализации индивидуальности при мечении метками гликанового гидразида с целью достижения точного относительного количественного определения с помощью жидкостной хроматографии, масс-спектрометрии и усиленной ионизации электроспреем. Кроме того, мы разработали новую функциональность протокола, реализовав тандем, протеомику дробовика и анализ сайта гликозилирования на плазме курицы. Мы показали, что N-гликаны, очищенные на фильтре и дериватизированные гидрофобными гидразидными метками, сопоставимы по содержанию и классу с таковыми при твердофазной экстракции (SPE); Последний считается золотым стандартом в этой области. Важно отметить, что вариабельность в двух протоколах статистически не отличалась. Протеомные данные, которые были собраны в соответствии с гликомическими данными, имели ту же глубину по сравнению со стандартным расщеплением трипсина. Дезаминация пептидов в протоколе сведена к минимуму, что ограничивает неспецифическую дезаминацию, обнаруживаемую при мотивах гликозилирования. Это позволило провести прямой анализ сайта гликозилирования, хотя протокол также может включать мечение 18О-сайта. В целом, мы продемонстрировали новый встроенный высокопроизводительный, несмещенный, основанный на фильтре протокол для количественного гликомического и протеомного анализа.

Введение

В области протеомики, фильтр автоматизированного подготовки проб (ФАСП) получила широкое распространение благодаря своей способности минимизировать количество исходного материала, уменьшения артефактов подготовки проб, и максимизировать пропускную 1. Тем не менее, такой способ еще появляться и получить тягу для области glycomics. Развитие высокой пропускной способности , количественные рабочие процессы необходимы из-за интегральной роли гликозилирования в биологической защиты и его модуляции рака или заболеваний 2,3. У млекопитающих, N -glycans состоят из повторяющихся сахаридных единиц (гексозы (Hex), гексозамины (HexNac), сиаловой кислоты (NeuAc) и fucoses (ОФП)), украшающие основную структуру (Hex 3 HexNac 2) 4 ковалентно связанного на аспарагин. Хотя glycospace значительно большим , когда изомеры подсчитываются (> 10 12), она достаточно мала по композиции основы и молекулярные массы , как правило , в диапазоне от 1,000-8,000 Da 5 </ SUP>. Композиционное гомогенность класса и гидрофильность гликанах создают уникальные проблемы для очистки, разделения и масс - спектрометрии (МС) рабочих процессов 6.

Традиционно N -glycans перевариваются из белков или пептидов пептидные N -glycosidase F (F PNG - азой) , а затем обогащается лектин аффинной хроматографии 7, захваченный гидразида бисером 8, или очищают с помощью твердофазной экстракции (SPE) 9,10. Хотя эти методы все очень эффективны, они вводят дополнительные шаги для обессоливания и ограничить количество образцов одновременно обрабатывается. За последнее десятилетие, было предложено ряд высокопроизводительных платформ для glycomics. Ким и др. Опубликовали полуавтоматическим методом с использованием вакуумных, SPE 96-луночного планшета 11. В качестве альтернативы, способ аффинно фильтр (N -glyco-ФАСП) была разработана группой Манн, которая требует первоначального модифицирования фифильтр с составным лектинов 12. И, наконец, группа Томаса-Оутс предложил полуколичественного метод, фильтр Aided N -Glycan разделения (клыки), который эксплуатировал узкий Размерный состав glycospace 13. Опираясь на молекулярный вес пороговым фильтром, мелкие загрязняющие вещества были сначала моют в отходы , а затем N -glycans переваривают и элюируют. Дегликозилированного белки остаются на фильтре в этом протоколе и могут быть подвергнуты в линии ФАСП.

Идентификация и количественное определение гликанов электрораспылением ионизации (ESI) MS требует офф-лайн для разделения (частичного) разрешения изомеров и дериватизации для обнаружения низких преобладающих видов. Этикетировочное в индивидуальности при нормализации стратегии гликановые теги гидразид дает совместимость с обращенной фазой жидкостной хроматографии (RPLC) 14,15. 4-фенэтил-benzohydrazide (P2PGN) гидрофобные тег посредничает гидрофильность гликанах, ENHancing ионизацию, в среднем, в четыре раза 16. Хотя другие методы, такие как permethylation 17 или амин-реактивным мечения биохимический 18, содержат аналогичные преимущества, в гидразида реакции, гликаны реагируют 1: 1 стехиометрически в легковесных условиях. Относительное количественное определение достигается путем тандемного анализа образцов , дериватизированных с нативным (NAT) или 13 C 6 изотопных меток стабильной (SIL).

Следующий метод развивается КЛЫКИ для плазменных приложений и пар его к гидрофобным тег P2GPN для точного относительного количественного определения. Кроме того, он был разработан, чтобы выполнить дробовика протеомики, дезамидирования профилирование и количественные glycomics на одной аликвоте образца, не ставя под угрозу целостность анализа.

Протокол

1. Белок и гликопротеин Денатурация и Алкилирование

  1. Для стандартных препаратов, нагрузки 2,5 мкл 0,1 мкг / мкл раствора гликопротеина (например , фетуина или РНКазы B) на 30 кДа или 10 кДа молекулярной массой (MW) отсечение фильтра.
    1. Для биологических образцов плазмы, проверять концентрацию белка с помощью анализа 20 (BCA) белка стандартного Брэдфорд 19 или бицинхониновой кислоты. Развести плазму, при необходимости, с помощью 100 мМ бикарбоната аммония (NH 4 HCO 3) в H 2 O (PNG - азой Digest буфер) при рН ~ 7 ​​содержит от 10-100 мг / мл общего белка. Нагрузка 2,5 мкл в плазме (25-250 мкг белка) на фильтр.
      Примечание: Этот протокол был протестирован только на плазме из образцов крови, собранных в присутствии этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА).
  2. Добавляют 2 мкл 1 М раствора дитиотрептол (DTT) для каждой выборки в фильтре.
  3. Разведите образец с 200 мкл буфера PNG-азой переваривать.
  4. Закрывают трубку образца фильтр и слегка вихрь, соблюдая осторожность, чтобы не нарушить фильтр из гнезда. Инкубируйте образца при 56 ° С в течение 30 мин, чтобы денатурировать белки и гликопротеины.
  5. Алкилировать образцы, добавить 50 мкл 1 М иодацетамида, чтобы получить конечную концентрацию ~ 200 мМ, и инкубируют при температуре 37 ° С в течение 60 мин.
    Примечание: Если анализ протеомика не требуется, шаг 1,5 может быть пропущен.
  6. Концентрат денатурированный гликопротеин на фильтре путем центрифугирования образцов при 14000 х г в течение 40 мин. Откажитесь течь через.

2. N -связанной Glycan ферментативного переваривания

  1. Вымойте образца с 100 мкл буфера PNG-азой переваривать. Концентрат гликопротеин на фильтре при 14000 х г в течение 20 мин и отбрасывать поток через.
    1. Повторите для стирки и концентрата шаг в два раза, в общей сложности три раза, получая концентрат в фильтре мертвого объема (~ 5 мкл). Выбросьте всепротекать.
    2. Отбросить коллекция флакон один раз моет завершены. Соберите все будущие элюентов и промывные в новый флакон коллекции.
      Примечание: PNG - азой переваривать буфер в H 2 18 O могут быть использованы во время стадии переваривания F для PNG - азой стабильных изотопов маркировки аспарагина сайтов де-гликозилированного, которые становятся химически Деамидированная.
  2. Добавьте 2 мкл глицерина, свободных от F PNG-азой (75000 х единиц / мл) для фильтрации после переноса в пробирку для сбора свежей. Добавьте 98 мкл буфера PNG-азой переваривания, в результате чего общий объем до 100 мкл, и осторожно пипеткой вверх и вниз на фильтре, чтобы перемешать. Ферментативно переваривать гликанов в условиях с шагом 2.2.1, 2.2.2, ИЛИ 2.2.3.
    Примечание: Три методы дегликозилированием белков могут быть использованы. Для анализа исключительно glycomics (без протеомики), рекомендуется длительный инкубационный на этапе 2.2.1. Для glycomics и протеомики исследований, шаги 2.2.2 и 2.2.3 будет производить продукцию высокого качества пептиды с минимальным не-зрecific деамидирование.
    1. Glycomics только для переваривания протокола (18hr): Инкубируйте образцы при температуре 37 ° С в течение 18 ч до ферментативно расщеплять все N -glycans.
    2. Спайк в протоколе пищеварения (SPI): Инкубируйте образцы при 50 ° С в течение 2 ч. Работая быстро, удалить образцы и шип в дополнительном 2 мкл глицерина свободной PNG-азой F (75000 х единиц / мл). Слегка вихрь образцов в течение 1-2 сек для смешивания. Инкубируйте образцы при 50 ° С в течение еще 2 ч.
    3. Протокол СВЧ пищеварения (MD): Место образцов в микроцентрифужных трубки плавающей стойки. Образцы парить в 1 л лабораторный стакан заливается 1 л деионизованной (ДИ) воды. Стакан помещают в центре микроволновой печи (950 Вт) с вращающейся пластиной. Микроволновая печь при 60% мощности (570 Вт) в течение 5 мин. Для того, чтобы охладить, извлечь образцы и держать при комнатной температуре в течение 2 мин. Затем микроволновой печи в течение еще 5 мин при 60% -ной мощности.
      Примечание: настройки мощности СВЧ должны быть скорректированы на основе максимальной выходной мощности микроволновой печи.Средняя мощность должна поддерживаться постоянной между моделями.

3. Вымывание N -glycans

  1. Элюции гликаны центрифугированием образца при 14000 х г в течение 20 мин при температуре 20 ° С.
  2. Добавьте 100 мкл буфера PNG-азой переваривать к фильтру и центрифуге при 14000 х г в течение 20 мин при температуре 20 ° С. Собрать мыть содержащий все оставшиеся N -связанной Гликан, в том же флаконе коллекции в качестве элюента. Повторите дважды. Удалить фильтр и место в новом флаконе коллекции.
  3. Инкубируйте гликанов образцов в -80 ° C морозильнике до замороженного (30-60 мин). Высыхание до завершения, при комнатной температуре, в вакуумной концентратором (4-6 ч).
    Примечание: N -glycans можно хранить при температуре -20 ° С в течение до шести месяцев до дериватизации.

4. Белок ФАСП Переваривание

Примечание: Если протеомика или анализ деамидирование сайта не требуется, раздел 4 протокола может быть пропущен.

  1. Полоскание тон фильтр, содержащий Деамидированная пептиды, с 400 мкл буфера 8 М мочевины. Пробирки закрывают крышками для сбора и слегка перемешать вихрь. Сконцентрируйтесь на фильтре при 14000 мкг в течение 15 мин. Выбросьте все проточные.
    1. Повторите шаг 4.1 еще два раза, в общей сложности три буферных мочевины стирок.
  2. Промыть фильтр, содержащий Деамидированная пептиды, с 400 мкл 2 М мочевины, 10 мМ CaCl 2 - буфера (трипсин переваривать буфер). Пробирки закрывают крышками для сбора и слегка перемешать вихрь. Сконцентрируйтесь на фильтре при 14000 мкг в течение 15 мин. Выбросьте все проточные.
    1. Повторите шаг 4.1 еще два раза, в общей сложности три трипсина переварить буфера стирок.
    2. Отбросить коллекция флакон один раз моет завершены. Соберите все будущие элюентов и промывные в новый флакон коллекции.
  3. Добавляют 50 мкл свиную модифицированного трипсина в 1:50 или 1: 5 трипсин: белок (вес / вес) отношение для обнаружения или количественного протеомики экспериментов, соответственно.Пробирки закрывают крышками для сбора и слегка перемешать вихрь.
  4. Инкубируйте образцы при температуре 37 ° С в течение 2 часов. Работая быстро, удалить образцы и шип в дополнительные 50 мкл трипсина в 1:50 или 1: белка: трипсин 5. Слегка вихрь образцов в течение 1-2 сек для смешивания. Инкубируйте образцы при 50 ° С в течение еще 2 ч.
  5. Элюируйте пептиды центрифугированием при 14000 мкг в течение 15 мин.
  6. Полоскание оставшиеся пептиды из фильтра с 400 мкл 1% -ной муравьиной кислоты и 0,001% Zwittergent 3-16 (закалочной буфер). Элюции из фильтра центрифугированием при 14000 мкг в течение 15 мин.
  7. Количественно концентрации пептида в образцах Брэдфорда 19 или BCA анализа 20.
  8. Инкубируйте образцы пептида в -80 ° C морозильнике до замороженными (30-60 мин). Высыхание до завершения, при комнатной температуре, в вакуумной концентратором (4-6 ч).
    Примечание: Сушеные пептиды могут храниться при температуре -20 ° С в течение до трех месяцев.
  9. Ресуспендируют триптические белки непосредственно перед Liquid хромато-масс - спектрометрии (ЖХ-МС) анализ в 2% ацетонитрила, 98% H 2 O и 0,1% муравьиной кислоты (подвижная фаза А) до требуемой концентрации. Триптические концентрации пептида от 2,5 мкл плазмы диапазоне от 100 - 300 нг / мкл.

5. Дериватизация N -связанной гликанах с гидрофобными гидразид Теги

  1. Развести высушенные тяжелые (ПИП) или света (NAT) P2GPN реагенты в 1 мл 75:25 MeOH: уксусная кислота (дериватизации раствор) для конечной концентрации 0,25 мг / мл. Реагенты будут занимать до 10 минут, чтобы полностью растворять. Обширно вихрь, чтобы обеспечить полное растворение.
    Примечание: В случае этот протокол дериватизации используется со стандартными N -glycans, по сравнению с очищенными гликанов, молярное отношение P2GPN: Гликан должно быть приблизительно (а не меньше) , чем 17: 1.
  2. Тэг сушат N -glycans с 200 мкл (50 мкг) или СИЛ НАТ P2GPN реагента. Пипетировать вверх и вниз для ресуспендирования высушенных гликаны. Vortex саmples, а затем спином вниз образцы для ~ 5 сек на настольном центрифуге.
  3. React гликанов с реагентом в течение 3 ч при 56 ° С.
  4. Немедленно переместить гликаны из инкубатора к вакуумному концентратору. Высыхание до завершения при температуре 55 ° С (3-5 ч).
    Примечание: Этот шаг гасит реакцию дериватизации; образец должен быть полностью сухим, чтобы предотвратить перекрестную реактивность на последующих стадиях.
    Примечание: Сушеные, помеченных пробы могут храниться при температуре -20 ° С в течение до шести месяцев.
  5. Ресуспендируют помечено N -glycans в 25-50 мкл H 2 O непосредственно перед анализом LC-MS. Пипетировать вверх и вниз , чтобы обеспечить N -glycans полностью солюбилизированный.
    Примечание: Объем для ресуспендирования зависит от исходной концентрации гликопротеина, который может быть оценен с исходной концентрации белка. Тем не менее, диапазон будет варьироваться в зависимости от типа образца и должны быть индивидуально оптимизированы.
  6. Центрифуга образцов при 14000 мкг в течение 5 мин. Удалите supernatant, стараясь не допустить, чтобы кончик пипетки касаться дна центрифуги трубы.
    Примечание: Избыточный тег может быть не видна глазу, но будет уменьшен путем центрифугирования.
  7. Смешайте пару образцов NAT и Sil, если это необходимо для относительного количественного определения, в соотношении 1: 1 для анализа тандемной.

6. сверхвысокого давления жидкостной хроматографии и масс-спектрометрического анализа

Примечание: ЖК и MS условия , описанные для легкого НЖК-1000 и высокочастотного поля Q Exactive, соответственно, были оптимизированы в доме для анализа протеомики и гликановой анализа 21. Эти условия могут быть адаптированы к другим сверхвысоких или нано- к давлению систем LC и других высокотехнологичных средств массовой разрешения мощности спектрометров, но может потребоваться незначительные изменения. Использование высокой разрешающей масс - спектрометрии мощности необходим для гликановой идентификации и анализа деамидированием 22,23.

Примечание: Шаги 6.1-6.3 может быть skipped если соответствующий хроматографии с обращенной фазой или гидрофильные взаимодействия коммерческой ловушки и колонки используются.

  1. Синтезируя фритты в 100 мкМ ID капилляра в соответствии с Meiring и др. 24 для использования в качестве ловушки.
  2. Упаковать ловушку под давлением с 2,6 мкМ, 100 A, C 18 упаковочный материал и нарезают в длину 5 см.
  3. Пакет 75 мкМ колонку ID эмиттера под давлением с 2,6 мкМ, 100 A, C 18 упаковочного материала и обрезают до длины 30 см.
  4. Подготовьте два различных метода LC-MS для протеомики (6.4.1) и glycomics (6.4.2) рабочих процессов.
    Примечание: Белок и гликановые образцы могут быть запущены на той же установке ловушки / столбца в любом порядке.
    1. Для анализа белков, вводят ~ 400 нг белка на колонку в мобильной фазе А (MPA). Запуск образца при температуре 300 Нл / мин, в соответствии с таблицей 1, с 1 мкл предварительно колонке уравновешивания (500 бар) и 5 мкл аналитической колонке уравновешивания(500 бар). Ионизируют белки в условиях МС , приведенных в таблице 2.
    2. Для гликановой анализа, вводят 5 мкл ресуспендировали, P2GPN помечено NAT / ПИП эквимолярные образцов на колонку. Запуск образца при температуре 300 Нл / мин, в соответствии с таблицей 3, с 2 мкл предварительно колонки уравновешивания (500 бар) , и 5 мкл аналитического уравновешивания колонки (500 бар). Ионизируют гликаны при условиях МС , приведенных в таблице 4.
Время % MPA % MPB
0 100 0
5 98 2
105 80 20
135 68 32
136 5 95
151 5 95
152 100 0
167 100 0

Таблица 1. Условия LC для протеомики анализа. Градиент элюирования с подвижной фазой B (MPB, 98% ацетонитрила, 2% H 2 O, 0,1% муравьиной кислоты) проводили для вымывания пептидов для дробовика протеомики, зависимым от данных приобретения эксперименты MS.

MS 1 Параметры
Масс-диапазон (Th) 375-1500
разрешение 120000
AGC 1 × 10 6
Макс Ионизация Время 30
S-объектива FR Уровень 55
Капиллярная TemПК) 300
Спрей напряжение 1,75
MS 2 Параметры
Приобретение Тип Top20
разрешение 15000
AGC 1 × 10 5
Макс Ионизация Время 30
Недолив Коэффициент 2%
Изоляция окон (Th) 1.4
Заряд Государственный Исключение +1
Нормированная энергии столкновения 27
Время (с) Исключение 20

Таблица 2: MS условия для протеомики анализа Параметры для ионизации электрораспылением, MS 1 приобретение, а также MS 2 приобретение в качестве Orbitrap инструмента с использованием более высокой энергии dissociatio.п (HCD) приведены.

Время % MPA % MPB
0 95 5
1 70 30
41 60 40
46 37 63
47 10 90
55 10 90
56 95 5
66 95 5

Таблица 3:. Условия LC для гликановой анализа Градиент элюции проводили для элюирования гидразид меченый N -glycans для анализа MS.

MS 1 Параметры
Масс-диапазон (Th) 600-1900
разрешение 60000
AGC 5 × 10 5
Макс Ионизация Время 64
S-объектива FR Уровень 65
Капиллярная Temp (° C) 325
Спрей напряжение 1,75
MS 2 Параметры
Приобретение Тип Top12
разрешение 15000
AGC 5 × 10 4
Макс Ионизация Время 100
Недолив Коэффициент 1%
Изоляция окон (Th) 1.4
Фиксированный Первая Mass 125
Ступенчатая нормализованной энергии столкновения 10/20/30
Исключение Время (сек) 15

Таблица 4: условия для MS гидразида помечено N -glycan анализ Параметры электрораспылением ионизации, MS 1 приобретение, и приобретение MS 2 в Orbitrap инструмента с использованием более высокой энергии диссоциации (HCD) приведены..

7. протеомики и Дезамидирование анализ

  1. Идентификация белков / пептидов, используя стандартные инструменты поиска биоинформатики.
    Примечание: Следующий протокол анализа был разработан с использованием баз данных Swiss-Prot / TrEMBL в UniprotKB и поиск с помощью SEQUEST в 1.4 программного обеспечения Протеом Discoverer, однако, протокол может быть непосредственно переведены на любой поисковой белка и скоринга двигателя с использованием программного обеспечения с графическим интерфейсом. Все команды, приведенные ниже, могут быть доступны в программных интерфейсов осуществляется при помощи выпадающего меню.
    1. Создать или загрузить организм соответствующую базу данных белковой последовательности из геномных данных или доступных баз данных протеома , как описано Apweiler и др. 25
      Примечание: Общие базы данных протеома включают Swiss-Prot, TrEMBL и NCBI, но могут быть построены на основе данных в доме, а также.
    2. В программном обеспечении, выберите поисковую базу данных двигателя и выбирать параметры в зависимости от качества полученных данных и требовательности обыска желаемого, как это описано в работе Перкинса и соавт. для MASCOT 26 или Eng и др. для SEQUEST 27.
      1. Для получения данных с высокой массовой точности, установить параметры для поиска в программе следующим образом : не более 2 пропущенных расколы, 5 частей на миллион предшественника массовой толерантности и 0,02 Da фрагмент массовой толерантности (для оптимизации обнаружения 22 точным деамидированием) и включают в себя следующие триптические модификации пептидов : "carbamidomethyl (С)" статической модификации и "деамидирование (N / Q)" и "волidation (М) "динамические изменения. При использовании 18 O маркировки пищеварения, включают в себя" деамидирование 18 O (1) " в качестве дополнительной динамической модификации.
      2. Поиск, используя выбранный двигатель, необработанные пептидные данные от базы данных белка (7.1.1).
        Примечание: Массовые допуски должны соответствовать используемого прибора, а не произвольно низким.
        Примечание: Функция поиска завершается автоматически с помощью программного обеспечения с использованием конкретных различных поисковых системах алгоритмы. Алгоритм перколатор (MASCOT), Sequest или другие комбинации алгоритмов используются для идентификации белков из пептидов и оценка обоснованности обращений; Более подробную информацию о доступных инструментов покрыты в обзоре от Гонсалес-Galarza и др. , 28,29. В зависимости от программного обеспечения, дополнительные параметры поиска, возможно, должны быть выбраны в соответствии с усмотрению пользователя.
    3. Экспорт выявленных пептидов для ручной курирование и ФюртАнализ эр.
  2. Вручную викарию список пептидов , содержащих определенную дезамидирование на аспарагин из N -связанной гликозилирования мотив (NX - (S / T), где X ≠ P). Перекрестные проверки этих сайтов с известными гликозилирования мотивами из литературы и создать два пула результатов (подтверждено и теоретически).
  3. Используйте спектральный отсчет 30 для сравнения процентов размещение данного сайта гликозилирования путем сравнения обилие дезамидированных и не деамидированных форм.

8. Glycan Относительная Количественный

Примечание: Следующая идентификация и количественное определение было завершено с использованием программного обеспечения Xcalibur. Тем не менее, любое программное обеспечение, которое анализирует исходные данные и автоматически интегрирует хроматографических пиков могут быть замещены.

  1. Генерирование теоретический список гликанов композиций из биологически возможных комбинаций гексоз, дезокси-гексоз, гексозаминов, сиаловой кислоты и другие саccharides. Для этой цели Гликан база данных человеческого была опубликована Walker и др. 15 и может быть использован как есть. Для теоретических баз данных, видоспецифична биологические ограничения должны быть наложены на комбинаторном пространстве, и эти правила описываются Kronewitter и др. 31.
  2. Вычислить Гликан моноизотопных массы (м) от атомных масс для каждой композиции для заряда протона состояний + 1-3. Изменение моноизотопном массы включать добавление NAT (254,14191 г / моль) или SIL (260,162042 г / моль) P2GPN тега.
  3. Откройте программу "Setup" Обработка с точки зрения дорожной карты в Xcalibur. Установить способ обработки , как в точности описано в Дополнительной материал от Walker и др. 15 с использованием списка , генерируемой на этапе 8.2 , содержащий теоретические моноизотопиче- массы на [М + Н] 1+, [М + 2Н] 2+, и [ М + 3Н] 3+ видов.
    Примечание: Для подтверждения гликана идентичности за пределами точноймасса, для NAT / СИЛ дуплексной работает, проверьте , что NAT и СИЛ N -glycan пар коэлировать с тем же временем удерживания. Качественно, кросс-проверки идентификации с спектров МС 2, который должен содержать пики , принадлежащие к оксониевого ионов серии 32.
  4. Экспорт комплексного, извлекаемого ионного хроматограмм (Xic) областей в Excel для получения содержаний ПИП и NAT , как точно описано в Дополнительной материал от Walker и др. 15
  5. В Excel, программа ячейки в новый столбец для вычисления поправки на вес перекрытия молекулярного путем регулирования численности SIL в соответствии с уравнением , опубликованной Walker и др 1 5.:
    figure-protocol-1 ,
    где А представляет собой пик одноизотопные и теоретический изотоп перекрытия, figure-protocol-2 , Могут быть независимо друг от друга в расчете на композицию.
  6. Во втором столбце, программа клетки , чтобы нормализовать каналы NAT и ПИП с использованием уравнения для полного нормированного гликановой фактора (TGNF), в спектре, как описано Walker и др 1 5.:
    figure-protocol-3 ,
    где N есть число N -glycans выше предела количественного определения.
  7. В новой колонке, программа клетки, чтобы взять отношение СИЛ: NAT гликаны (или наоборот), чтобы вычислить загнутой изменение концентрации между двумя образцами.

Результаты

figure-results-1
Рисунок 1:. Схема клыки-P2GPN гидрофобный мечение в сочетании методом (метод А) для комбинированных протеомики и glycomics анализа дается шаги , которые отличаются между glycomics только для обработки и тандем glycomics и анализа протеомики, с идентификацией сайта гликозилирования, выдвинуты на первый план. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

В линии протеомики и glycomics, фильтр на основе P2GPN гидрофобным метод мечения (метод А) была подтверждена для идентификации, количественного и смещения молекулярной массы с использованием куриных складочный образцов плазмы (рис 1). Для исключительно glycomics экспериментов, интер-сравнения в содержаний N -glycans экстрагируют по методуА до carbograph SPE (золотой стандарт, метод В) были сделаны (рисунок 2). Там не было никаких существенных различий в распространенностях гликанах между этими двумя методами. Внутриизмерительные изменчивость также оценивали путем количественного SIL: НАТ соотношение гликанов, экстрагированных таким же способом. Бревенчатые 2 -распределения обоих методов были гауссовым, с центром на нуле, а не существенно отличается (рис 3А-В). Молекулярная масса колеблется между этими двумя протоколами полностью перекрывается, предполагая , что фильтр не дискриминировать N -glycans на основе диапазона молекулярной массы и гидрофильности (рисунок 4).

figure-results-2
Рисунок 2: эквимолярной смеси NAT и СИЛ N -glycans экстрагируют по методу А или методу Б получают из 2,5 мкл плазмы курицы (N = 4) Образцы были Anal.yzed по UPLC-МС в соответствии с рекомендуемыми параметрами, предложенными в разделе 6. Содержания для каждого гликана, в каждом канале NAT / Sil, были рассчитаны путем интегрирования площади под извлекаемого ионного хроматограмм (ММА = 3 промилле), с поправкой на молекулярный вес перекрытия и регулировки с помощью TGNF. Эти отношения показаны с их стандартными ошибками. Содержания Метод B: Метод A N -glycans существенно не отличались (р> 0,05). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3: Внутриизмерительные вариабельность в (A) Способ A (N = 133) или (В) Способ Б (N = 123) стратегии сравнивали. NAT и SIL эквимолярные смеси N -glycans, из той же схемы экстракции, Были проанализированы по трем техническим повторах. Бревенчатые 2 -распределений были сосредоточены на нуле и существенно не отличались между двумя рабочими процессами. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 4: Диапазоны молекулярная масса гликанов из каждой стратегии сравнивались. Две рабочие процессы дали гликаны охватывает тот же диапазон молекулярного веса. N -glycans обнаружен в одном протоколе по сравнению с другой упал чуть выше предела обнаружения (1 × 10 5 изобилие) и не отражают систематическую ошибку. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версия этой фигуры.

Сохранение дегликозилированного белков с помощью фильтра молекулярной массы позволило в линии протеом широкий анализ и сайт гликозилирования идентификации. Множественные протоколы для комбинированной очистки гликанов и белков по сравнению с традиционными препарата ФАСП без дегликозилированием (таблица 5). Наш типичный 18 ч фильтр на основе PNG-азой F переваривание, а затем ФАСП трипсина дайджеста (протокол Std) привело к значительным уровням неспецифической деамидированием, которые могут препятствовать идентификации glycosites. Таким образом, способ, использующий более короткое время инкубации при повышенной температуре (50 ° С) и спайкоподобных на этапе F PNG-азой (протокол SPI), был исследован в качестве альтернативы, наряду с протоколом микроволновой сбраживания (протокол MD), чтобы свести к минимуму не- конкретных деамидирование. Гликанов, наблюдаемые в новых методах пищеварения существенно не отличались в композициях или содержаний от стандартного 18 ч, 37 ° C фильтр F PNG-азой дайджеста ( Рисунок 5). В сочетании с коротким трипсина инкубации, неспецифический деамидирование была значительно снижена, с ложных срабатываний для glycosites <5% (таблица 5).

Белки Пептиды Деамидированная Пептиды Glycosites гликопротеины
+ - + - + - + - + -
ФАСП 249 3083 795 5 5
18hr 217 304 6013 5086 1029 733 257 24 112 18
Мэриленд 270 266 5190 5125 465 455 254 8 102 7
SPI 281 288 4729 4482 602 573 232 10 145 8

. Таблица 5: Сравнение протеомных данных из стандартного трипсином переваривания по сравнению с методом мечения в линию клыков-P2GPN были сделаны Препараты были проведены с (+) и без (-) PNG - азой F , чтобы определить фоновые показатели неспецифической деамидированием и оценки glycosite ложные положительные темпы. Белки были идентифицированы с 1% ложных открытий (FDR); пептиды фильтруются на основе "высокой" пептидной уверенности в Протеом Discoverer 1.4 (д <0,01); glycosites были Опознавательнаяе изд на основе уникальных последовательностей, содержащих деамидированием сохраняющегося гликозилирования мотива (NXS / T); и гликопротеины были определены как идентифицированных белков, содержащих по меньшей мере один идентифицированный glycosite.

figure-results-5
Рисунок 5: Укороченный протоколы для гликанов были разработаны , чтобы минимизировать дезаминирование в образцах и по сравнению с 18hr клыки F дайджеста PNG - азой. Средние различия в распространенностей составляли 10% и 5% для MD (2.2.3) и (2.2.2) протоколов SPI, соответственно. Из 48 гликанах выявленных, 90% отображается менее чем в 1,5 раза вариации. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Для облегчения рутинного анализа гликанов необходимы высокопроизводительные количественные методы. В течение последних тридцати лет гликомический анализ был ограничен подмножеством исследовательских групп, несмотря на его важность в области заболеваний, клинического применения и фармацевтики. Метод очистки и маркировки FANGS-P2GPN для гликомики и протеомики выполняет один и тот же анализ на одной аликвоте образца, снижая стоимость расходных материалов и количество необходимого материала (что особенно важно в исследованиях на людях и мышах). Кроме того, усилия по минимизации вариабельности препаратов критически важны, так как каждый дополнительный шаг вносит свой вклад в ошибку, потенциально маскируя важные, но малообильные изменения в исследованиях случай-контроль. Соединение FANGS с гидрофобным гидразидным мечением позволяет обрабатывать образцы белка и гликана на одной и той же колонке RPLC, усиливает ионизацию гликанов, обеспечивает относительную количественную оценку и может количественно применяться к плазме.

Для анализа N-гликанов крайне важно использовать предложенный уровень PNGазы F для достижения полного дегликозилирования. Несмотря на то, что гликаны подвергаются воздействию растворителей, денатурация белков и избыток фермента помогают обеспечить эффективное и полное расщепление. Для точного количественного определения гликанов необходимо убедиться, что они полностью высушены после дериватизации, чтобы погасить реакцию и предотвратить перекрестные реакции при смешивании видов NAT и SIL. Наконец, при расширении рабочего процесса до анализа гликозитов время выполнения этапов имеет решающее значение для минимизации неспецифического дезаминирования. Модифицированные протоколы, предусмотренные для комбинированного гликомического и протеомного анализа, работают последовательно при соответствующем выполнении.

Рабочий процесс обеспечивает точное относительное количественное определение N-гликанов из плазмы по сравнению с методом SPE, являющимся золотым стандартом. Нет никакой очевидной предвзятости в типах экстрагированных гликанов с точки зрения молекулярной массы, гидрофильности и композиционной структуры. Хотя мы не изучали качественный анализ О-связанных гликанов, мы ожидаем, что FANGS может приспособиться к добавлению стадии β элиминации после расщепления N-связанных гликанов PNGазой F. Тем не менее, процедуры потребуют значительных изменений для очистки реагентов перед масс-спектрометрией, и это значительно повлияет на анализ пептидов. Для протеомики достигается одинаковая глубина покрытия протеома по сравнению с традиционными методами FASP. Важно отметить, что методы достигают минимального уровня ложных обнаружений для дезаминирования N-гликанов. Несмотря на то, что этот метод совместим с мечением 18O Asn на этапе расщепления PNGазы22,23, низкий уровень ложного обнаружения сайта гликозилирования предполагает, что в этом может не быть необходимости, что еще больше снижает затраты и сложность.

При этом методе протеом не обогащается гликопротеинами, что имеет как преимущества, так и недостатки. Некоторые гликопротеины с низким содержанием могут не обнаруживаться при анализе. Тем не менее, занятость гликозилированных участков на один белок может быть сравнена между биологическими образцами. Кроме того, устраняются ошибки и систематическая ошибка, возникающие при очистке сродства лектина или химическом обогащении. В заключение следует отметить, что сопряжение FANGS с нормализацией индивидуальности при мечении гликангидразидными метками приводит к упрощенному, количественному, высокопроизводительному методу тандемного анализа гликома и протеома с большим потенциалом для применения в клинических исследованиях случай-контроль.

Раскрытие информации

Мы сотрудничаем с Кембриджской изотопной лабораторией (CIL) для распространения реагента и технологии P2GPN среди более широкого научного сообщества в форме продукта (GTK-1000). Тем не менее, мы не получаем никакого дохода от продажи этого продукта.

Благодарности

Это исследование было щедро профинансировано грантом R33 программы NIH NCI IMAT (CA147988-02), грантом NIH NIGMS Graduate Training in Molecular Biotechnology в NC State Grant (T32GM008776), стипендиальной программой GAANN Министерства образования США в области молекулярной биотехнологии в NC State Grant (P200A140020), Фондом В.М. Кека и Университетом штата Северная Каролина. Куриная плазма была получена с помощью доктора Джеймса Н. Петитта и Ребекки Вайсоцки на факультете птицеводства Университета штата Северная Каролина.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Уксусная кислота (50%)Sigma Aldrich 45754
Ацетонитрил, ВЭЖХ классаBurdick & Джексон AH015-4
Бикарбонат аммонияСигма Олдрич A6141
Брэдфордский реагентСигма Олдрич B6916Альтернатива: Набор бицинхониновой кислоты (Sigma Aldrich BCA1)
Хлорид кальцияSigma Aldrich C1016
ЦентрифугаEppendorf5804 RАльтернативные центрифуги, достигающие 14 000 x g
, подходят DL-Dithiothreitol, 1  М в раствореSigma Aldrich 
Easy-nLC 1000Thermo ScientificLC120Альтернативные нано- или сверхвысокие ЖК будут выдавать аналогичные данные, такие как: 1. Dionex UltiMateÒ 3000 LC (Thermo Scientific); 2. Acquity UPLC (Воды).
Штатив для плавающих пробирокTedPella20831-20
FetuinNew England Biolabs P6042S
Fisher Scientific Isotemp Стандартные лабораторные печиFisher Scientific11-690-625FАльтернативные инкубаторы, достигающие 56  ° С подойдет
муравьиная кислотаSigma Aldrich;56302
GE Микроволновая печьGeneral Electric57B5 E82904Подойдет любая микроволновая печь с регулируемыми настройками мощности
INLIGHT Glycan Tagging Kit Кембриджская изотопная лабораторияGTK-1000Набор INLIGHT включает в себя версии реагента P2GPN NAT и SIL.
ЙодоацетамидСигма Олдрич A3221
Kinetix 2.6 mM, 100Å, C18 объемная стационарная фазаPhenomenex Альтернатива сыпучим средам: любой C18 стационарная фаза 5 
Программное обеспечение mM Mascot Daemon и сервернаяматрица Научнаяальтернатива: программное обеспечение Proteome Discoverer (Thermo Scientific)
Метанол, ВЭЖХ классаBurdick & Джексон AH230-4
Колонна для самоупаковки PicoFrit: 360  μ м, OD 75  μ m ID, 15  μ m наконечник, без покрытия, 5 в коробке, 50 смНовый объектив1 5 PF360-75-15-N-5
PNGase F (без глицерина), 75 000  единиц/млNew England BioLabsP0705L
Q Exactive HF Гибридный квадруполь-орбитрап Масс-спектрометрThermo ScientificAlternate высокая точность по массе (5  ppm) масс-спектрометры будут предоставлять аналогичные данные
РНКаза BNew England Biolabs P7817S
Трипсин из свиной поджелудочной железыSigma Aldrich T6567-5X
МочевинаСигма Олдрич 51456
Концентратор вакуумаКонцентратор Savant SPD131DDA SpeedVac КонцентраторThermo ScientificSPD131DDAАльтернативные концентраторы
подходят Vivacon 500 30 кДа Фильтры Альтернатива VN01H22 Sartorius Stedim Biotech: центробежные фильтрующие установки Amicon Ultra 0.5 с Ultracel-10  Мембрана kDa (Millipore UFC501096)
Вода, ВЭЖХ классаBurdick & Джексон AH365-4
Вода, 18O Кембриджские изотопные лабораторииOLM-240-97-1Добавление 18O на этапе расщепления PNGase F является необязательным и может не потребоваться для исследований дезаминирования, выполненных с вероятностью 95%
Xcalibur 2.0Thermo ScientificXCALIBUR20
Zwittergent Test KitMerck Millipore693030
646563 вакуума

Ссылки

  1. Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).
  2. Preston, R. J. S., Rawley, O., Gleeson, E. M., O'Donnell, J. S. Elucidating the role of carbohydrate determinants in regulating hemostasis: insights and opportunities. Blood. 121, 3801-3810 (2013).
  3. Hasnain, S. Z., Gallagher, A. L., Grencis, R. K., Thornton, D. J. A new role for mucins in immunity: Insights from gastrointestinal nematode infection. Int. J. Biochem. Cell Biol. 45, 364-374 (2013).
  4. Roseman, S. Reflections on glycobiology. J. Biol. Chem. 276, 41527-41542 (2001).
  5. Laine, R. A. A calculation of all possible oligosaccharide isomers both branched and linear yields 1.05 x 10(12) structures for a reducing hexasaccharide: The isomer barrier to development of single-method saccharide sequencing or synthesis systems. Glycobiology. 4, 759-767 (1994).
  6. Zaia, J. Mass spectrometry and glycomics. Omics. 14, 401-418 (2010).
  7. Hirabayashi, J. Lectin-based structural glycomics: Glycoproteomics and glycan profiling. Glycoconjugate J. 21, 35-40 (2004).
  8. Nilsson, J., et al. Enrichment of glycopeptides for glycan structure and attachment site identification. Nat. Methods. 6, 809-811 (2009).
  9. Redmond, J. W., Packer, N. H. The use of solid-phase extraction with graphitised carbon for the fractionation and purification of sugars. Carbohyd. Res. 319, 74-79 (1999).
  10. Ruhaak, L. R., et al. Hydrophilic interaction chromatography-based high-throughput sample preparation method for N-glycan analysis from total human plasma glycoproteins. Anal. Chem. 80, 6119-6126 (2008).
  11. Kim, Y. -G., et al. Rapid and high-throughput analysis of N-glycans from ovarian cancer serum using a 96-well plate platform. Anal. Biochem. 391, 151-153 (2009).
  12. Zielinska, D. F., Gnad, F., Wiśniewski, J. R., Mann, M. Precision mapping of an in vivo N-glycoproteome reveals rigid topological and sequence constraints. Cell. 141, 897-907 (2010).
  13. Abdul Rahman, S., et al. Filter-aided N-glycan separation (FANGS): a convenient sample preparation method for mass spectrometric N-glycan profiling. J. Proteome Res. 13, 1167-1176 (2014).
  14. Walker, S. H., Carlisle, B. C., Muddiman, D. C. Systematic comparison of reverse phase and hydrophilic interaction liquid chromatography platforms for the analysis of N-linked glycans. Anal. Chem. 84, 8198-8206 (2012).
  15. Walker, S. H., Taylor, A. D., Muddiman, D. C. Individuality normalization when labeling with isotopic glycan hydrazide tags (INLIGHT): A novel glycan-relative quantification strategy. J. Am. Soc. Mass Spectr. 24, 1376-1384 (2013).
  16. Walker, S. H., Lilley, L. M., Enamorado, M. F., Comins, D. L., Muddiman, D. C. Hydrophobic derivatization of N-linked glycans for increased ion abundance in electrospray ionization mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass. Spectr. 22, 1309-1317 (2011).
  17. Baldwin, M. A., et al. Permethylation and tandem mass spectrometry of oligosaccharides having free hexosamine: Analysis of the glycoinositol phospholipid anchor glycan from the scrapie prion protein. Anal. Biochem. 191, 174-182 (1990).
  18. Harvey, D. J. Derivatization of carbohydrates for analysis by chromatography; electrophoresis and mass spectrometry. J. Chromatogr. B. 879, 1196-1225 (2011).
  19. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  20. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
  21. Hecht, E. S., McCord, J. P., Muddiman, D. C. Definitive screening design optimization of mass spectrometry parameters for sensitive comparison of filter and solid phase extraction purified, inlight plasma N-glycans. Anal. Chem. 87, 7305-7312 (2015).
  22. Nepomuceno, A. I., Gibson, R. J., Randall, S. M., Muddiman, D. C. Accurate identification of deamidated peptides in global proteomics using a quadrupole orbitrap mass spectrometer. J. Proteome Res. 13, 777-785 (2013).
  23. Yen, T. -Y., et al. Overcoming challenges and opening new opportunities in glycoproteomics. Biomolecules. 3, 270-286 (2013).
  24. Meiring, H. D., van der Heeft, E., ten Hove, G. J., de Jong, A. P. J. M. Nanoscale LC-MS(n): technical design and applications to peptide and protein. J. Sep. Sci. 25, 557-568 (2002).
  25. Apweiler, R., et al. UniProt: the Universal Protein knowledgebase. Nucleic Acids Res. 32, 115-119 (2004).
  26. Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20, 3551-3567 (1999).
  27. Eng, J. K., McCormack, A. L., Yates, J. R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 5, 976-989 (1994).
  28. Gonzalez-Galarza, F. F., et al. A critical appraisal of techniques, software packages, and standards for quantitative proteomic analysis. Omics. 16, 431-442 (2012).
  29. Spivak, M., Weston, J., Bottou, L., Käll, L., Noble, W. S. Improvements to the Percolator Algorithm for Peptide Identification from Shotgun Proteomics Data Sets. J Proteome Res. 8, 3737-3745 (2009).
  30. Collier, T. S., et al. Comparison of stable-isotope labeling with amino acids in cell culture and spectral counting for relative quantification of protein expression. Rapid Commun Mass Sp. 25, 2524-2532 (2011).
  31. Kronewitter, S. R., et al. The development of retrosynthetic glycan libraries to profile and classify the human serum N-linked glycome. Proteomics. 9, 2986-2994 (2009).
  32. Sheeley, D. M., Reinhold, V. N. Structural characterization of carbohydrate sequence, linkage, and branching in a quadrupole ion trap mass spectrometer: Neutral oligosaccharides and N-linked glycans. Anal. Chem. 70, 3053-3059 (1998).

Перепечатки и разрешения

Теги

Очистка N-гликановпротеомный анализразделение с помощью фильтрациижидкостная хроматография с масс-спектрометриейанализ сайтов гликозилированиятвердофазная экстракциябуфер для трипсинового перевариваниявакуумный концентратормаркирование стабильными изотопами
Количественный Glycomics и протеомикс Комбинированная стратегия очистки
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.