Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение, характеристика и функциональное обследование сотовый сети десен иммунной

10.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53736

⸱

16 февраля 2016 г.

 ,  ,  , 
1Oral Immunity and Inflammation Unit, NIDCR, NIH, 2Manchester Immunology Group, Faculty of Life Sciences, University of Manchester, 3Manchester Collaborative Centre for Inflammation Research, University of Manchester

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Мы создали методику выделения, фенотипического описания и функционального анализа иммунных клеток из мышиного десны.

Аннотация

Сети иммунных клеток в тканях играют жизненно важную роль в опосредовании местного иммунитета и поддержании гомеостаза тканей, но мало что известно о популяциях резидентных иммунных клеток в слизистой оболочке полости рта и десне. Мы разработали методику выделения и изучения иммунных клеток из десневых тканей мышей, области постоянного микробного воздействия и уязвимого места для распространенного воспалительного заболевания – пародонтита. Наш протокол позволяет провести детальную фенотипическую характеристику популяций иммунных клеток, обитающих в десне, даже в равновесном состоянии. Наша процедура также позволяет получить достаточное количество клеток с высокой жизнеспособностью для использования в функциональных исследованиях, таких как оценка секреции цитокинов ex vivo. Эта комбинация фенотипической и функциональной характеристики сети иммунных клеток десны должна помочь в исследовании механизмов, участвующих в оральном иммунитете и гомеостазе пародонтаза, а также углубит наше понимание механизмов, участвующих в местной иммунопатологии.

Введение

Тканях десны окружают человека и мыши зубной и постоянно подвергаются комплексной биопленки зуба 1. Сеть иммунной клетки полицейской десневого барьер жизненно важно для поддержания целостности тканей, обеспечивая гомеостаз с местными микробами синантропных и, в то же время, обеспечивая эффективный иммунитет против патогенного вызов 2. Для достижения гомеостаза, иммунная система тщательно адаптировать к десневой среды, создающей высоко специализированной сети иммунных клеток, пока известно мало подробностей известно о десневых популяциях клеток иммунной системы и их роль в поддержании тканей иммунитет 2.

Когда иммунного гомеостаза нарушается на десны, либо через повышенной восприимчивости хозяина и / или в присутствии дисбиотических микробных сообществ, воспалительного состояния, периодонтит возникает 3 4. Пародонтит является распространенным воспалительным заболеванием, что приводит к потере зуба сupporting структуры. В своих тяжелых формах она наблюдается примерно 10% от общей численности населения 5. Анатомический ключевые факторы, влияющие на периодонтита восприимчивости и прогрессирования оказалось трудным 6. Тем не менее, модели на животных были чрезвычайно полезны в понимании механизмов инициации пародонтита и прогрессирования 7. Модели могут быть использованы для определения ключевых клеточных популяций и молекулярные медиаторы, которые имеют жизненно важное значение для поддержания иммунного гомеостаза и развитие привода пародонтоза. Такое понимание превратит наше понимание десны конкретных контроля иммунного гомеостаза и углубить наше нынешнее понимание патогенеза заболевания.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все экспериментальные процедуры, описанные в данном протоколе последующим необходимые принципы и были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета, NIDCR / NIH.

1. Подготовьте заранее

  1. Подготовьте полной среде: RPMI с добавлением 2 мМ L-глутамина, 100 единиц / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 10% FBS.
  2. Подготовьте ДНКазную СМИ: 50 мл RPMI среде с 7,5 мкг ДНКазы (Make свежий, держать на льду во все времена).
  3. Подготовьте коллагеназы-ДНКазы носитель: 5 мл ДНКазы сред плюс 3,2 мг / мл коллагеназы типа IV (Make свежей, держать на льду во все времена).
  4. Предварительно круто FACS буфера: 0,5% FBS разводили в PBS.
  5. Предварительно круто центрифуги до 4 ° С.
  6. Теплый шейкер-инкубатор до 37 ° С.

2. Изоляция, Вскрытие и Выделение клеток из десневого блоков

  1. Эвтаназии мышей, подвергая их CO 2 в соответствующем камере, в соответствии с директивами ARAC.
  2. Открыть грудной и брюшной полости, чтобы разоблачить сердце и внутренние органы. Чтобы заливать, сделать разрез в нижней полой вене и заливать 3 мл PBS через левый желудочек с помощью 3 мл шприц с иглой 27 G.
  3. Остановите тело и голову мыши на слой с желудком вверх.
  4. Разрежьте каждый спайки губ к шее с помощью ножниц, отделяя кожу, которая покрывает нижней челюсти и шеи область, обнажая лежащие ткани и мышцы. Рассеките нижнюю губу, чтобы раскрыть нижнюю челюсть.
  5. Вырезать между нижними резцами, чтобы отделить обе части нижней челюсти и иммобилизации каждую сторону для доступа к полости рта.
  6. Визуализация и рассекают небо от носовой полости.
  7. Рассеките области с использованием 10 лезвие и включают верхней и нижней челюсти молярных областей с окружающими десны (рисунок 1). Сделать вертикальные надрезы только кпереди от первого моляра и кзади от третьего моляра и горизонтальной разрез награница десны (белый воротничок тканей, окружающих зубы).
  8. Поместите верхней и нижней челюсти блоков в 50 мл коническую трубку с 5 мл коллагеназы / ДНКазы (держать на льду).
  9. Инкубируйте в шейкере инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 1 ч и в течение последних 5-минутной инкубации добавляют 50 мкл 0,5 М ЭДТА.
  10. Добавьте 5 мл холодной ДНКазы СМИ к 50 мл пробирку с тканями и нежно вихревой перемешать.
  11. Передача 4 блока ткани на чашке Петри и накрыть 500 мкл ДНКазы СМИ. Удалить десны от каждого блока ткани, используя лезвие скальпеля и указывая лезвие в десневых и межзубных областях.
  12. Передача ткани и носитель из чашки Петри, а также предыдущих медиа ДНКазы используемых во время вскрытия, в новом 50 мл трубки через клеточный фильтр (размер 70 мкм). Промыть ДНКазы СМИ (3-5 мл) на всех инструментах, используемых и фильтра.
  13. Используя поршень из стерильной 3 мл шприц, пюре ткани против сито,фильтрации с холодным ДНКазы сред (от 30 до 35 мл).
  14. Промыть фильтр клеток с холодной ДНКазы СМИ.
  15. Центрифуга при 4 ° С, 314 мкг в течение 6 мин.
  16. Жидкость над осадком сливают, вновь приостановить в 1 мл полной среды.
  17. Граф клеток (ожидаемая сумма должна быть в пределах от 8 до 10 х 5 до 1,2 х 10 6 клеток с жизнеспособностью> 80%) с использованием автоматизированного счетчика клеток.

3. Стимулирование и FACS окрашивания десны клеток

  1. Стимулируют одноклеточной суспензии с РМА (50 нг / мл) и Ionomycin (2,5 мкг / мл) в присутствии 1 мкл / мл брефелдин А.
  2. Инкубируйте в течение 3,5 ч при 37 ° С и 5% CO 2.
  3. Спин вниз и промыть PBS и центрифуге при 4 ° С; 314 мкг в течение 6 мин.
  4. Пятно клеток с использованием жизнеспособность пятно следующей инструкции производителя.
  5. Пятно внеклеточного маркеров (CD45, TCRγδ, TCR & beta;, CD4, CD8, TCRγδ или муравьевibodies выбора) в соответствии с инструкциями изготовителя.
  6. Вымойте клеток с холодным буфером FACS и центрифуге при 4 ° С, 314 мкг в течение 5 мин.
  7. Аккуратно вихрь, чтобы разрушить осадок клеток.
  8. Устранить клетки с 2% параформальдегидом в течение 20 мин при комнатной температуре.
  9. Вымойте клеток с холодным буфером FACS, центрифуги при 4 ° С, 314 мкг в течение 5 мин и пятно на внутриклеточных цитокинов.
    1. Заполните трубы FACS с раствором холодной 0,5% сапонина, разведенного в FACS буфере и центрифугируют при 4 ° С, 314 мкг в течение 5 мин.
    2. Добавить 300 мкл 0,5% раствора сапонина к трубкам FACS, инкубировать в течение 15 мин в темноте при 4 ° С и затем центрифуги при 4 ° С, 314 мкг в течение 5 мин.
    3. Пятно клетки для внутриклеточных маркеров (IL-17A и IFN & gamma или цитокинов выбора), следуя инструкциям изготовителя. Вымойте клеток с 0,5% раствором сапонина и центрифуге при 4 ° С, 314 мкг в течение 5 мин.
    4. снова промыть водой с FACSбуфер и центрифуги при 4 ° С, 314 мкг в течение 5 мин.
    5. Повторное приостановить клеток в 300 мкл буфера FACS.
  10. Анализ результатов по цитометра потока.

4. проточной цитометрии анализ

  1. Визуализация клеток для анализа на вперед (FSC) и боковое рассеивание (SCC) и ворот, чтобы исключить мусор.
  2. Выберите отдельные клетки с площадью рассеяния вперед (FSC-A) против высоты параметров (FSC-H).
  3. Клетки Gate, которые живут (как обозначено на жизнеспособность окрашиванием), и положительным для кроветворной маркер CD45 + для дальнейшего анализа (фиг.2А и 2С).
  4. Продолжить анализ специфических маркеров, как показано на рисунках 2 и 3.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Чтобы проиллюстрировать применение протокола, мы показываем репрезентативные результаты Рассматривая сеть иммунных клеток в десне мышей с и без периодонтита (WT против LFA - / -, рис 2a - C). Представительные FACS графики показывают живые CD45 + гемопоэтических клеток в десны (рис 2А, 2С). Выделение и обработка иммунных клеток по этому протоколу дает достаточное количество клеток для выполнения ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Тока методика успешно дает большое количество иммунных клеток (от одной мыши) подходит не только для фенотипического описания, но также и для функциональных исследований экс виво. Другая группа ранее опубликованные протокол, чтобы изолировать и охарактеризовать иммунные клетки мышиной десневые и введены ценность использования многоцветной проточной цитометрии при изучении периодонтита в животных моделях 9. После обширных Устранение неполадок ключевую модификацию в этом протоколе было включать рассече...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать

Благодарности

Авторы были частично профинансированы внутренней программой NIDCR (N.M.M.) и поддержаны стипендией Wellcome Trust Stepping Stones Fellowship (097820/Z/11/B to J.E.K) и грантом Манчестерского центра сотрудничества по исследованию воспаления (J.E.K). Авторы благодарят Терезу Уайлд за критическое рецензирование рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Тонкие ножницыТонкие научные инструменты14058-11
Ручка скальпеля #3Тонкие научные инструменты10003-12
Лезвия скальпеля #10Тонкие научные инструменты10010-00Стерильные
щипцы для занозыIntegra Miltex6-304
Иглы с обычным скосом BD Medical30510927 G, длина 12,7 мм
Моноджект шприцыCovidien8881513934наконечник Luer-lock, 3 мл
PBS, pH 7,4Life Technologies10010-049Без кальция и магния
RPMI 1640Lonza12-167Fбез L-глутаминовой
DNазы I из поджелудочной железы крупного рогатого скотаSigma-AldrichDN25-1G
Коллагеназа IV типаGibco (от Life technologies)17104-019
Фетальная бычья сывороткаGemini Bio-products100-106
Гентамицин 50 мг/млКачество биологическое120-098-661EA
Pen StrepGibco (от Life technologies)15140-122
L-глутаминGibco (от Life technologies)25030-081
0,5 м ЭДТА pH 8,0Качество биологическое351-027-721EA
50 мл пробиркиCorning352070Полипропилен, стерильный
70 μ M Cell SitsCorning352350
ЧашкиПетри Corning351029Стерильные
5 мл FACSTubes Corning352052Sterile
BD BD GolgiPlugBD Biosciences555029Содержит раствор брефелдина А
Форбол 12-миристат 13-ацетат (PMA)Sigma-AldrichP8139
Иономицин Кальциевая сольSigma-Aldrich13909
Сапонин из коры квилладжиSigma-AldrichS4521
LIVE/DEAD Исправляемый набор для окрашивания Aqua Dead Cell Stain KitLife TechnologiesL34957
Анти-Мышь CD45 Alexa Fluor 700eBioscience56-0451-82
Анти-Мышь CD4 eFluor 450 eBioscience48-0042-82
Анти-Мышь TCR бета APC eFluor 780 eBioscience47-5961-82
Антимышиный гамма-дельта TCR FITCeBioscience11-5711-82
Антимышиный IL-17A APCeBioscience12-7311-82
Антимышиный ИФН-&гамма; PEeBioscience11-5931-82
Антимышиный NK1.1 PE-Cy7eBioscience25-5941-82
Антимышиный CD90.2 APC eFluor 780 eBioscience47-0902-82
Антимышиный CD3e FITCeBioscience11-0031-82
Антимышиный CD19 FITCeBioscience11-0193-82
Антимышиный CD11b FITCeBioscience11-0112-82
Антимышиный CD11c FITCeBioscience11-0114-82
Мышиный TCR beta FITCeBioscience11-5961-82
Мышиный Ly-6G FITCeBioscience11-5931-82
Мышиный Ly-6C FITCBD Pharmingen553104

Ссылки

  1. Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining The Normal Bacterial Flora Of The Oral Cavity. J Clin Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
  2. Belkaid, Y., Naik, S. Compartmentalized And Systemic Control Of Tissue Immunity By Commensals. Nat Immunol. 14, 646-653 (2013).
  3. Darveau, R. P. Periodontitis: A Polymicrobial Disruption Of Host Homeostasis. Nat Rev Microbiol. 8, 481-490 (2010).
  4. Hajishengallis, G. Immunomicrobial Pathogenesis Of Periodontitis: Keystones, Pathobionts, And Host Response. Trends Immunol. 35, 3-11 (2014).
  5. Eke, P. I., et al. Prevalence Of Periodontitis In Adults In The United States: 2009 And 2010. J Dent Res. 91, 914-920 (2012).
  6. Moutsopoulos, N. M., Lionakis, M. S., Hajishengallis, G. Inborn Errors In Immunity: Unique Natural Models To Dissect Oral Immunity. J Dent Res. , (2015).
  7. Hajishengallis, G., Lamont, R. J., Graves, D. T. The Enduring Importance Of Animal Modelsin Understanding Periodontal Disease. Virulence. 6, 229-235 (2015).
  8. Sharrow, S. O. Analysis Of Flow Cytometry Data. Current Protocols In Immunology. Coligan, J. E., et al. , Chapter 5, Unit 5 2 (2001).
  9. Arizon, M., et al. Langerhans Cells Down-Regulate Inflammation-Driven Alveolar Bone Loss. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 7043-7048 (2012).
  10. Moutsopoulos, N. M., et al. Defective Neutrophil Recruitment In Leukocyte Adhesion Deficiency Type I Disease Causes Local IL-17-Driven Inflammatory Bone Loss. Sci Transl Med. 6, 229-240 (2014).
  11. Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. The IL-23-IL-17 Immune Axis: From Mechanisms To Therapeutic Testing. Nat Rev Immunol. 14, 585-600 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

ex vivo
Выделение, характеристика и функциональное обследование сотовый сети десен иммунной
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.