Выделение, характеристика и функциональное обследование сотовый сети десен иммунной

Краткое содержание

Мы создали методику выделения, фенотипического описания и функционального анализа иммунных клеток из мышиного десны.

Аннотация

Сети иммунных клеток в тканях играют жизненно важную роль в опосредовании местного иммунитета и поддержании гомеостаза тканей, но мало что известно о популяциях резидентных иммунных клеток в слизистой оболочке полости рта и десне. Мы разработали методику выделения и изучения иммунных клеток из десневых тканей мышей, области постоянного микробного воздействия и уязвимого места для распространенного воспалительного заболевания – пародонтита. Наш протокол позволяет провести детальную фенотипическую характеристику популяций иммунных клеток, обитающих в десне, даже в равновесном состоянии. Наша процедура также позволяет получить достаточное количество клеток с высокой жизнеспособностью для использования в функциональных исследованиях, таких как оценка секреции цитокинов ex vivo. Эта комбинация фенотипической и функциональной характеристики сети иммунных клеток десны должна помочь в исследовании механизмов, участвующих в оральном иммунитете и гомеостазе пародонтаза, а также углубит наше понимание механизмов, участвующих в местной иммунопатологии.

Введение

Тканях десны окружают человека и мыши зубной и постоянно подвергаются комплексной биопленки зуба ^1. Сеть иммунной клетки полицейской десневого барьер жизненно важно для поддержания целостности тканей, обеспечивая гомеостаз с местными микробами синантропных и, в то же время, обеспечивая эффективный иммунитет против патогенного вызов ^2. Для достижения гомеостаза, иммунная система тщательно адаптировать к десневой среды, создающей высоко специализированной сети иммунных клеток, пока известно мало подробностей известно о десневых популяциях клеток иммунной системы и их роль в поддержании тканей иммунитет ^2.

Когда иммунного гомеостаза нарушается на десны, либо через повышенной восприимчивости хозяина и / или в присутствии дисбиотических микробных сообществ, воспалительного состояния, периодонтит возникает ^{3 4.} Пародонтит является распространенным воспалительным заболеванием, что приводит к потере зуба сupporting структуры. В своих тяжелых формах она наблюдается примерно 10% от общей численности населения ^5. Анатомический ключевые факторы, влияющие на периодонтита восприимчивости и прогрессирования оказалось трудным ^6. Тем не менее, модели на животных были чрезвычайно полезны в понимании механизмов инициации пародонтита и прогрессирования ^7. Модели могут быть использованы для определения ключевых клеточных популяций и молекулярные медиаторы, которые имеют жизненно важное значение для поддержания иммунного гомеостаза и развитие привода пародонтоза. Такое понимание превратит наше понимание десны конкретных контроля иммунного гомеостаза и углубить наше нынешнее понимание патогенеза заболевания.

Протокол

Все экспериментальные процедуры, описанные в данном протоколе последующим необходимые принципы и были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета, NIDCR / NIH.

1. Подготовьте заранее

1. Подготовьте полной среде: RPMI с добавлением 2 мМ L-глутамина, 100 единиц / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 10% FBS.
2. Подготовьте ДНКазную СМИ: 50 мл RPMI среде с 7,5 мкг ДНКазы (Make свежий, держать на льду во все времена).
3. Подготовьте коллагеназы-ДНКазы носитель: 5 мл ДНКазы сред плюс 3,2 мг / мл коллагеназы типа IV (Make свежей, держать на льду во все времена).
4. Предварительно круто FACS буфера: 0,5% FBS разводили в PBS.
5. Предварительно круто центрифуги до 4 ° С.
6. Теплый шейкер-инкубатор до 37 ° С.

2. Изоляция, Вскрытие и Выделение клеток из десневого блоков

1. Эвтаназии мышей, подвергая их _{CO 2} в соответствующем камере, в соответствии с директивами ARAC.
2. Открыть грудной и брюшной полости, чтобы разоблачить сердце и внутренние органы. Чтобы заливать, сделать разрез в нижней полой вене и заливать 3 мл PBS через левый желудочек с помощью 3 мл шприц с иглой 27 G.
3. Остановите тело и голову мыши на слой с желудком вверх.
4. Разрежьте каждый спайки губ к шее с помощью ножниц, отделяя кожу, которая покрывает нижней челюсти и шеи область, обнажая лежащие ткани и мышцы. Рассеките нижнюю губу, чтобы раскрыть нижнюю челюсть.
5. Вырезать между нижними резцами, чтобы отделить обе части нижней челюсти и иммобилизации каждую сторону для доступа к полости рта.
6. Визуализация и рассекают небо от носовой полости.
7. Рассеките области с использованием 10 лезвие и включают верхней и нижней челюсти молярных областей с окружающими десны (рисунок 1). Сделать вертикальные надрезы только кпереди от первого моляра и кзади от третьего моляра и горизонтальной разрез награница десны (белый воротничок тканей, окружающих зубы).
8. Поместите верхней и нижней челюсти блоков в 50 мл коническую трубку с 5 мл коллагеназы / ДНКазы (держать на льду).
9. Инкубируйте в шейкере инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 1 ч и в течение последних 5-минутной инкубации добавляют 50 мкл 0,5 М ЭДТА.
10. Добавьте 5 мл холодной ДНКазы СМИ к 50 мл пробирку с тканями и нежно вихревой перемешать.
11. Передача 4 блока ткани на чашке Петри и накрыть 500 мкл ДНКазы СМИ. Удалить десны от каждого блока ткани, используя лезвие скальпеля и указывая лезвие в десневых и межзубных областях.
12. Передача ткани и носитель из чашки Петри, а также предыдущих медиа ДНКазы используемых во время вскрытия, в новом 50 мл трубки через клеточный фильтр (размер 70 мкм). Промыть ДНКазы СМИ (3-5 мл) на всех инструментах, используемых и фильтра.
13. Используя поршень из стерильной 3 мл шприц, пюре ткани против сито,фильтрации с холодным ДНКазы сред (от 30 до 35 мл).
14. Промыть фильтр клеток с холодной ДНКазы СМИ.
15. Центрифуга при 4 ° С, 314 мкг в течение 6 мин.
16. Жидкость над осадком сливают, вновь приостановить в 1 мл полной среды.
17. Граф клеток (ожидаемая сумма должна быть в пределах от 8 до 10 х ^{5 до} 1,2 ^{х 10 6} клеток с жизнеспособностью> 80%) с использованием автоматизированного счетчика клеток.

3. Стимулирование и FACS окрашивания десны клеток

1. Стимулируют одноклеточной суспензии с РМА (50 нг / мл) и Ionomycin (2,5 мкг / мл) в присутствии 1 мкл / мл брефелдин А.
2. Инкубируйте в течение 3,5 ч при 37 ° С и 5% CO _2.
3. Спин вниз и промыть PBS и центрифуге при 4 ° С; 314 мкг в течение 6 мин.
4. Пятно клеток с использованием жизнеспособность пятно следующей инструкции производителя.
5. Пятно внеклеточного маркеров (CD45, TCRγδ, TCR & beta;, CD4, CD8, TCRγδ или муравьевibodies выбора) в соответствии с инструкциями изготовителя.
6. Вымойте клеток с холодным буфером FACS и центрифуге при 4 ° С, 314 мкг в течение 5 мин.
7. Аккуратно вихрь, чтобы разрушить осадок клеток.
8. Устранить клетки с 2% параформальдегидом в течение 20 мин при комнатной температуре.
9. Вымойте клеток с холодным буфером FACS, центрифуги при 4 ° С, 314 мкг в течение 5 мин и пятно на внутриклеточных цитокинов.
   1. Заполните трубы FACS с раствором холодной 0,5% сапонина, разведенного в FACS буфере и центрифугируют при 4 ° С, 314 мкг в течение 5 мин.
   2. Добавить 300 мкл 0,5% раствора сапонина к трубкам FACS, инкубировать в течение 15 мин в темноте при 4 ° С и затем центрифуги при 4 ° С, 314 мкг в течение 5 мин.
   3. Пятно клетки для внутриклеточных маркеров (IL-17A и IFN & gamma или цитокинов выбора), следуя инструкциям изготовителя. Вымойте клеток с 0,5% раствором сапонина и центрифуге при 4 ° С, 314 мкг в течение 5 мин.
   4. снова промыть водой с FACSбуфер и центрифуги при 4 ° С, 314 мкг в течение 5 мин.
   5. Повторное приостановить клеток в 300 мкл буфера FACS.
10. Анализ результатов по цитометра потока.

4. проточной цитометрии анализ

1. Визуализация клеток для анализа на вперед (FSC) и боковое рассеивание (SCC) и ворот, чтобы исключить мусор.
2. Выберите отдельные клетки с площадью рассеяния вперед (FSC-A) против высоты параметров (FSC-H).
3. Клетки Gate, которые живут (как обозначено на жизнеспособность окрашиванием), и положительным для кроветворной маркер CD45 ⁺ для дальнейшего анализа (фиг.2А и 2С).
4. Продолжить анализ специфических маркеров, как показано на рисунках 2 и 3.

Результаты

Чтобы проиллюстрировать применение протокола, мы показываем репрезентативные результаты Рассматривая сеть иммунных клеток в десне мышей с и без периодонтита (WT против LFA ^{- / -,} рис 2a - C). Представительные FACS графики показывают живые CD45 ⁺ гемопоэтических клеток в десны (рис 2А, 2С). Выделение и обработка иммунных клеток по этому протоколу дает достаточное количество клеток для выполнения ...

Обсуждение

Тока методика успешно дает большое количество иммунных клеток (от одной мыши) подходит не только для фенотипического описания, но также и для функциональных исследований экс виво. Другая группа ранее опубликованные протокол, чтобы изолировать и охарактеризовать иммунные клетки мышиной десневые и введены ценность использования многоцветной проточной цитометрии при изучении периодонтита в животных моделях ^9. После обширных Устранение неполадок ключевую модификацию в этом протоколе было включать рассече...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Тонкие ножницы	Тонкие научные инструменты	14058-11
Ручка скальпеля #3	Тонкие научные инструменты	10003-12
Лезвия скальпеля #10	Тонкие научные инструменты	10010-00	Стерильные
щипцы для занозы	Integra Miltex	6-304
Иглы с обычным скосом	BD Medical	305109	27 G, длина 12,7 мм
Моноджект шприцы	Covidien	8881513934	наконечник Luer-lock, 3 мл
PBS, pH 7,4	Life Technologies	10010-049	Без кальция и магния
RPMI 1640	Lonza	12-167F	без L-глутаминовой
DNазы I из поджелудочной железы крупного рогатого скота	Sigma-Aldrich	DN25-1G
Коллагеназа IV типа	Gibco (от Life technologies)	17104-019
Фетальная бычья сыворотка	Gemini Bio-products	100-106
Гентамицин 50 мг/мл	Качество биологическое	120-098-661EA
Pen Strep	Gibco (от Life technologies)	15140-122
L-глутамин	Gibco (от Life technologies)	25030-081
0,5 м ЭДТА pH 8,0	Качество биологическое	351-027-721EA
50 мл пробирки	Corning	352070	Полипропилен, стерильный
70 μ M Cell Sits	Corning	352350
Чашки	Петри Corning	351029	Стерильные
5 мл FACS	Tubes Corning	352052	Sterile
BD BD GolgiPlug	BD Biosciences	555029	Содержит раствор брефелдина А
Форбол 12-миристат 13-ацетат (PMA)	Sigma-Aldrich	P8139
Иономицин Кальциевая соль	Sigma-Aldrich	13909
Сапонин из коры квилладжи	Sigma-Aldrich	S4521
LIVE/DEAD Исправляемый набор для окрашивания Aqua Dead Cell Stain Kit	Life Technologies	L34957
Анти-Мышь CD45 Alexa Fluor 700	eBioscience	56-0451-82
Анти-Мышь CD4 eFluor 450 eBioscience		48-0042-82
Анти-Мышь TCR бета APC eFluor 780 eBioscience		47-5961-82
Антимышиный гамма-дельта TCR FITC	eBioscience	11-5711-82
Антимышиный IL-17A APC	eBioscience	12-7311-82
Антимышиный ИФН-&гамма; PE	eBioscience	11-5931-82
Антимышиный NK1.1 PE-Cy7	eBioscience	25-5941-82
Антимышиный CD90.2 APC eFluor 780 eBioscience		47-0902-82
Антимышиный CD3e FITC	eBioscience	11-0031-82
Антимышиный CD19 FITC	eBioscience	11-0193-82
Антимышиный CD11b FITC	eBioscience	11-0112-82
Антимышиный CD11c FITC	eBioscience	11-0114-82
Мышиный TCR beta FITC	eBioscience	11-5961-82
Мышиный Ly-6G FITC	eBioscience	11-5931-82
Мышиный Ly-6C FITC	BD Pharmingen	553104