Method Article

Выделение, характеристика и функциональное обследование сотовый сети десен иммунной

DOI:

10.3791/53736

⸱

February 16th, 2016

 ,  ,  , 
1Oral Immunity and Inflammation Unit, NIDCR, NIH, 2Manchester Immunology Group, Faculty of Life Sciences, University of Manchester, 3Manchester Collaborative Centre for Inflammation Research, University of Manchester

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы создали методику выделения, фенотипического описания и функционального анализа иммунных клеток из мышиного десны.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сети иммунных клеток в тканях играют жизненно важную роль в опосредовании местного иммунитета и поддержании гомеостаза тканей, но мало что известно о популяциях резидентных иммунных клеток в слизистой оболочке полости рта и десне. Мы разработали методику выделения и изучения иммунных клеток из десневых тканей мышей, области постоянного микробного воздействия и уязвимого места для распространенного воспалительного заболевания – пародонтита. Наш протокол позволяет провести детальную фенотипическую характеристику популяций иммунных клеток, обитающих в десне, даже в равновесном состоянии. Наша процедура также позволяет получить достаточное количество клеток с высокой жизнеспособностью для использования в функциональных исследованиях, таких как оценка секреции цитокинов ex vivo. Эта комбинация фенотипической и функциональной характеристики сети иммунных клеток десны должна помочь в исследовании механизмов, участвующих в оральном иммунитете и гомеостазе пародонтаза, а также углубит наше понимание механизмов, участвующих в местной иммунопатологии.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Тканях десны окружают человека и мыши зубной и постоянно подвергаются комплексной биопленки зуба 1. Сеть иммунной клетки полицейской десневого барьер жизненно важно для поддержания целостности тканей, обеспечивая гомеостаз с местными микробами синантропных и, в то же время, обеспечивая эффективный иммунитет против патогенного вызов 2. Для достижения гомеостаза, иммунная система тщательно адаптировать к десневой среды, создающей высоко специализированной сети иммунных клеток, пока известно мало подробностей известно о десневых популяциях клеток иммунной системы и их роль в поддержании тканей иммунитет 2.

Ко....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все экспериментальные процедуры, описанные в данном протоколе последующим необходимые принципы и были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета, NIDCR / NIH.

1. Подготовьте заранее

  1. Подготовьте полной среде: RPMI с добавлением 2 мМ L-глутамина, 100 единиц / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 10% FBS.
  2. Подготовьте ДНКазную СМИ: 50 мл RPMI среде с 7,5 мкг ДНКазы (Make свежий, держать на льду во все времена).
  3. Подготовьте коллагеназы-ДНКазы носитель: 5 мл ДНКазы сред плюс 3,2 мг / мл коллагеназы типа IV (Make свежей, держать на льду во все времена).
  4. Предварительно круто FACS буфера: 0,5% FB....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы проиллюстрировать применение протокола, мы показываем репрезентативные результаты Рассматривая сеть иммунных клеток в десне мышей с и без периодонтита (WT против LFA - / -, рис 2a - C). Представительные FACS графики показывают живые CD45 + гемопоэтических клеток в десны (рис 2А, 2С). Выделение и обработка иммунных клеток по этому протоколу дает достаточное количество клеток для выполнения .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Тока методика успешно дает большое количество иммунных клеток (от одной мыши) подходит не только для фенотипического описания, но также и для функциональных исследований экс виво. Другая группа ранее опубликованные протокол, чтобы изолировать и охарактеризовать иммунные клетки мышиной десневые и введены ценность использования многоцветной проточной цитометрии при изучении периодонтита в животных моделях 9. После обширных Устранение неполадок ключевую модификацию в этом протоколе было включать рассече.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы были частично профинансированы внутренней программой NIDCR (N.M.M.) и поддержаны стипендией Wellcome Trust Stepping Stones Fellowship (097820/Z/11/B to J.E.K) и грантом Манчестерского центра сотрудничества по исследованию воспаления (J.E.K). Авторы благодарят Терезу Уайлд за критическое рецензирование рукописи.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Тонкие ножницыТонкие научные инструменты14058-11
Ручка скальпеля #3Тонкие научные инструменты10003-12
Лезвия скальпеля #10Тонкие научные инструменты10010-00Стерильные
щипцы для занозыIntegra Miltex6-304
Иглы с обычным скосом BD Medical30510927 G, длина 12,7 мм
Моноджект шприцыCovidien8881513934наконечник Luer-lock, 3 мл
PBS, pH 7,4Life Technologies10010-049Без кальция и магния
RPMI 1640Lonza12-167Fбез L-глутаминовой
DNазы I из поджелудочной железы крупного рогатого скотаSigma-AldrichDN25-1G
Коллагеназа IV типаGibco (от Life technologies)17104-019
Фетальная бычья сывороткаGemini Bio-products100-106
Гентамицин 50 мг/млКачество биологическое120-098-661EA
Pen StrepGibco (от Life technologies)15140-122
L-глутаминGibco (от Life technologies)25030-081
0,5 м ЭДТА pH 8,0Качество биологическое351-027-721EA
50 мл пробиркиCorning352070Полипропилен, стерильный
70 μ M Cell SitsCorning352350
ЧашкиПетри Corning351029Стерильные
5 мл FACSTubes Corning352052Sterile
BD BD GolgiPlugBD Biosciences555029Содержит раствор брефелдина А
Форбол 12-миристат 13-ацетат (PMA)Sigma-AldrichP8139
Иономицин Кальциевая сольSigma-Aldrich13909
Сапонин из коры квилладжиSigma-AldrichS4521
LIVE/DEAD Исправляемый набор для окрашивания Aqua Dead Cell Stain KitLife TechnologiesL34957
Анти-Мышь CD45 Alexa Fluor 700eBioscience56-0451-82
Анти-Мышь CD4 eFluor 450 eBioscience48-0042-82
Анти-Мышь TCR бета APC eFluor 780 eBioscience47-5961-82
Антимышиный гамма-дельта TCR FITCeBioscience11-5711-82
Антимышиный IL-17A APCeBioscience12-7311-82
Антимышиный ИФН-&гамма; PEeBioscience11-5931-82
Антимышиный NK1.1 PE-Cy7eBioscience25-5941-82
Антимышиный CD90.2 APC eFluor 780 eBioscience47-0902-82
Антимышиный CD3e FITCeBioscience11-0031-82
Антимышиный CD19 FITCeBioscience11-0193-82
Антимышиный CD11b FITCeBioscience11-0112-82
Антимышиный CD11c FITCeBioscience11-0114-82
Мышиный TCR beta FITCeBioscience11-5961-82
Мышиный Ly-6G FITCeBioscience11-5931-82
Мышиный Ly-6C FITCBD Pharmingen553104

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining The Normal Bacterial Flora Of The Oral Cavity. J Clin Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
  2. Belkaid, Y., Naik, S. Compartmentalized And Systemic Control Of Tissue Immunity By Commensals. Nat Immunol.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Gingival Immune CellsImmune Cell IsolationTissue DigestionFlow CytometryCytokine SecretionCollagenase DNaseCell StrainerEx Vivo StimulationPhenotypic CharacterizationFunctional Examination

Related Articles