Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Экс Vivo Живая съемка Метастазы в легких и их микроокружения

12.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53741

⸱

3 февраля 2016 г.

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy, University of California, 2Hubrecht Institute-Royal Dutch Academy of Science and University Medical Center Utrecht, 3Department of Cell and Developmental Biology, Sackler Faculty of Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Опишем относительно простой метод экс виво живых изображений опухолевых клеток стромы взаимодействий внутри метастазов в легких, используя флуоресцентные репортеров у мышей. Используя спиннинг-диска конфокальной микроскопии, эта методика позволяет визуализировать живых клеток в течение по крайней мере 4 ч и могут быть адаптированы для изучения других воспалительных состояний легких.

Аннотация

Метастазы являются основной причиной для рака, связанных с заболеваемостью и смертностью. Метастазы многоэтапный процесс, и из-за его сложности, точные клеточные и молекулярные процессы, которые регулируют метастатического распространения и роста по-прежнему не удается. Живая изображений позволяет визуализировать динамические и пространственные взаимодействия клеток и их микроокружения. Солидные опухоли обычно метастазируют в легкие. Тем не менее, анатомического расположения легких бросает вызов прижизненной визуализации. Этот протокол обеспечивает относительно простой и быстрый способ экс естественных живых изображений динамических взаимодействий между опухолевыми клетками и окружающей их стромы в метастазов в легких. С помощью этого метода, подвижность раковых клеток, а также взаимодействия между раковыми клетками и клетками стромы в их микросреде могут быть визуализированы в реальном времени в течение нескольких часов. При использовании трансгенных флуоресцентных мышей репортер, флуоресцентный клеточная линия, инъекционный флуоресцентную меткуМолекулы и / или антитела, множественные компоненты микросреды легких могут быть визуализированы, например, кровеносных сосудов и иммунных клеток. Чтобы создать образ различных типов клеток, был использован вращающийся диск конфокальной микроскопии, который позволяет долгосрочное непрерывное изображений с быстрым, четыре цвета захвата изображений. С интервальной фильмы собраны из изображений, собранных в течение нескольких позициях и фокальных плоскостях показать взаимодействие между живой метастатическим и иммунных клеток в течение по крайней мере 4 часа. Эта методика может быть дополнительно использован для тестирования химиотерапию или целевой терапии. Кроме того, этот метод может быть адаптирован для изучения других патологий легких, связанных которые могут повлиять на микросреду легких.

Введение

Самым смертоносным аспектом рака является метастазирование, на долю которого приходится более 90% заболеваемости и смертности, связанных с раком1. Метастазирование является многоступенчатым процессом, и из-за его сложности точные клеточные и молекулярные механизмы, которые управляют распространением и ростом метастазов, до сих пор неизвестны. Чтобы метастазировать, опухолевые клетки в первичной опухоли должны отделиться от соседних клеток и базальной мембраны, пройти через внеклеточный матрикс, интравазатировать, пройти через кровеносные или лимфатические сосуды, экстравазатировать во вторичном месте и, наконец, выжить и образовать вторичные опухоли. В дополнение к свойствам опухолевых клеток, вклад микроокружения, которое включает в себя соседнюю строму наряду с нормальными аналогами раковых клеток, имеет решающее значение для посева и образования метастатических поражений.

Традиционные методы изучения метастатического посева и роста изучают статические состояния, поскольку ткани иссекаются и разрезаются для гистологии. Эти данные лишь создают моментальный снимок этого высокодинамичного процесса. Несмотря на то, что из этих исследований можно извлечь некоторую полезную информацию, сложный процесс, посредством которого опухолевые и стромальные клетки взаимодействуют во время метастатического образования, не может быть адекватно оценен с помощью этих методов. Кроме того, невозможно получить представление о моделях миграции опухолевых или стромальных клеток, которые важны для создания колонии в отдаленном месте. Для эффективного изучения метастатического процесса важно непрерывно и в режиме реального времени визуализировать различные взаимодействия между раковыми клетками и их микроокружением.

Легкое является распространенным местом метастазов из солидных опухолей, таких как рак молочной железы, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, меланома и саркома3. Прижизненная визуализация ранее использовалась для изучения межклеточного взаимодействия в различных моделях первичных опухолей и метастазов4,5. Методы визуализации легких у мышей, включая прижизненную визуализацию, визуализацию легочных срезов и анализ метастазов в легкие ex vivo, были опубликованы6–9. При прижизненной визуализации легких мышей используется торакальное отсасывающее окно для стабилизации легких6. Этот метод используется для покадровой визуализации микроциркуляции легких и альвеолярных пространств. Анатомическое расположение легких представляет собой проблему для прижизненной визуализации. Для того, чтобы получить доступ к легким, грудная полость должна быть открыта, что приводит к потере отрицательного давления и коллапсу легких. Этот метод позволяет визуализировать только небольшую часть легких и является технически сложным; Ненужное усложнение в исследованиях, в которых изучаются процессы, не зависящие от кровотока. Кроме того, этот метод также требует ограничения движения, вызванного дыханием. Это делается либо путем сбора изображений между вдохами, либо во время анализа после получения изображений10. Альтернативная визуализация среза легких ex vivo обеспечивает стабильность и глубину, а также подготавливает паренхиму легких к иммуноокрашиванию7. Тем не менее, длительный процесс разделения приводит к значительной задержке между моментом жертвоприношения животных и началом сеанса визуализации. Более того, процесс разрезания легкого мыши вызываетзначительную гибель клеток8, тем самым влияя на качество и количество образцов визуализации и, возможно, из-за необходимости изменяя взаимодействие опухоли и стромы. Для того, чтобы технически соединить методы прижизненной визуализации и визуализации срезов легких, используя при этом преимущества этих двух методов, был разработан относительно быстрый и простой метод визуализации легких ex vivo. Этот метод был достигнут путем визуализации целых долей легких без сечения. С помощью этого метода можно визуализировать подвижность раковых клеток, а также взаимодействие между раковыми клетками и стромальными клетками в их микроокружении в режиме реального времени в течение нескольких часов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры, описанные должны быть выполнены в соответствии с действующими нормами и правилами по использованию позвоночных животных, в том числе предварительного одобрения со стороны местного Институциональные уходу и использованию животных комитета (IACUC).

1. Генерация метастазов в легких для Ex Vivo Живая съемка (Трансгенные или хвостовую вену для инъекций)

Примечание: метастазов в легких могут быть сгенерированы путем использования генной инженерии мышиные модели или путем внутривенной (IV) инъекции раковых клеток.

  1. Генерация легочные метастазы для визуализации путем скрещивания генетически измененных мышах опухоли в трансгенных репортера мыши, например, пересечь рак молочной железы мышиной модели мыши вируса опухоли молочной железы длинный концевой повтор полиома среднего Т-антиген (MMTV-PyMT) 11 в ACTB-ECFP мышиная модель 12.
    Примечание: Модель ACTB-ECFP выражает усиливается голубой флуоресцентный белок (ECFP) под бета-актав промотора, такого, что все клетки светиться в голубом, канал CFP. Тем не менее, раковые клетки являются на сегодняшний день наиболее известных и появляются как основная часть ECFP-позитивных клеток под микроскопом. Мышиная модель MMTV-PyMT развивает прогрессирующее заболевание, при котором рост опухоли молочной железы, связанный с распространением раковых клеток к периферии, особенно в легкие. У мышей MMTV-PyMT на FvB / н фоне, микрометастазов может наблюдаться вокруг 10-11-недельного возраста. Как правило, это прогресс macrometastases на отметке 14-недельного возраста 13.
    ИЛИ
  2. Создать экспериментальные метастазы, используя первичные клетки или сингенных клеточных линий. Использование в пробирке манипулировать первичной опухолевых клеток или клеточных линий (например., Трансдукции) с последующей инъекцией 14 IV.
    1. Вкратце, в этом протоколе, придать зеленый флуоресцентный белок (GFP) -expressing (+) клеточную линию ВОМЖМ-PyMT в люминесцентных мышей репортер (ACTB-ECFP) или мышей дикого типа. Затем,визуализировать эти клетки, называемые VO-PyMT клеток 15, используя зеленый, GFP канала.
      Примечание: Оригинальный клеточная линия В.О.-PyMT была определена на Вандербильта ортопедии в Нэшвилле, штат Теннесси. ВО означает Vanderbilt ортопедии.
    2. После инъекции 10 6 клеток (в 200 мкл), наблюдается раковых клеток экстравазации немедленно и до нескольких часов после инъекции; наблюдать микрометастазов между 1-3 недель после инъекции и обнаружения macrometastases 3 недели после инъекции 15.
      Примечание: Менее клетки могут быть введены, чтобы продлить время от инъекции рост метастазов.

2. Маркировка интересующих компонентов в метастатической микроокружения (трансгенных и / или инъекций)

Примечание: Маркировка может быть достигнуто путем трансгенных мышей и / или различными инъекций. Удостоверьтесь, чтобы использовать различные флуоресцентные цвета для маркировки различных типов клеток.

  1. Компоненты метку метастатическим микросреды с использованием трансгенных мышей. Замечательная ранее упомянутый модель опухоли мыши (например., ВОМЖМ-PyMT х ACTB-ECFP) в трансгенных мышах, в которых клетки стромы интересных помечены с помощью флуоресцентного белка, который не является ECFP., Например, гр-FMS-EGFP 4,16.
    Примечание: В дополнение к визуализации раковых клеток в канале CFP, это позволяет визуализировать миелоидных клеток в канале GFP 4.
    И / ИЛИ
  2. Добавьте различные компоненты метастатическим микросреды с использованием инъекционных в трансгенных мышах флуоресцентный репортер или (нефлуоресцирующих) мышей дикого типа.
    Примечание: Некоторые соединения могут быть введены для обозначения различных компонентов метастатического микросреды, например, AF647-конъюгированные Gr-1 антитело, используемого здесь, чтобы маркировать нейтрофилы и моноциты некоторые 13 и различные декстраны рные используемогомаркировать капилляры легких. Для подготовки этих инъекций смотрите шаг 4.

3. Подготовка материалов Перед Вскрытие

  1. 2% агарозном
    1. Взвесить 0,2 г агарозы и добавить до 10 мл 1 х PBS. Нагреть, чтобы растворить агарозы. Агарозном будет затвердевать при комнатной температуре, так поддерживать его в C водяной бане 37 ° С до использования для инфляции.
  2. CO 2 и регулятор температуры
    1. Проверьте DDh 2 O в влажную камеру. Пополнение в случае необходимости. Вставьте конфигурации пластину в температурном держателя этап пластины (климатическая камера). Включите контроллер СО 2 и СО 2 установлен на уровне 5%. Убедитесь, что расход воздуха устанавливается на уровне 0,4 л / мин.
    2. Откройте воздух и CO 2 клапанами. Включите контроллер температуры. Убедитесь, что температура климатической камере, и крышка установлены при 37 ° C.
    3. Отпустите давление воздуха на СО 2 метра. Проверьте CO 2 увеличивается, электроннойquilibration может занять до 30 минут.
  3. Вращающийся диск конфокальной микроскопии
    Примечание: Подробная информация о микроскопа настройке были описаны ранее 4,17.
    1. Включите лазеров (аргонового лазера для 488 нм возбуждения и твердотельный 405 нм, 561 нм и 640 нм лазеров). Включите микроскоп, камеры, блока управления диска прядении AOTF, блок управления лазером и контроллером камеры.
    2. Откройте микроскопа затвор, включите компьютер работает микроскоп и откройте программное обеспечение.
  4. Подготовка инструментов и рассечение платформы.
    1. Включите горячую борта стерилизатора и пусть он достигнет 250 ° C. Чистые 2 пары хирургических ножниц и щипцов с помощью воды и мыла. Стерилизация инструментов в течение по крайней мере 30 сек. Пусть инструменты остыть. Используйте полистирола крышку как рассечение платформы. Накройте его куском лаборатории Soaker.

4. Подготовка инъекций

Примечание: В зависимости от периода полураспада и предпочтительного ответ, вводят флуоресцентно меченных антител и / или флуоресцентных молекул либо непосредственно перед жертвоприношении или пару часов до нескольких дней раньше.

  1. Чтобы изображение Gr1-положительных нейтрофилов и моноцитов, подготовить шприц с 7 мкл фондовом AF647-конъюгированные Gr-1 антитела (1 мг / мл) в 100 мкл стерильного PBS под капотом. Поместите 27 G ½ иглу на шприц.
  2. Для изображения легочных капиллярах, подготовить вторую и третью шприц с 100 мкл либо 70 кДа родамина-сопряженных декстрана (4 мг / мл) или 10 кДа AF647-сопряженного декстрана (4 мг / мл). Поместите 27 G ½ иглу на шприцах.
  3. Вводят AF647-сопряженных раствора антител IV 5 часов перед удалением легких.
  4. Вводят один или оба декстран решения IV непосредственно до удаления легких.

5. Получение легких для Ex Vivo Живая съемка

Примечание: Старайтесь работать как стерильные и осторожно, насколько это возможно, чтобы избежать ненужных проблем иммунных клеток в легких.

  1. Вводят внутрибрюшинно мыши (IP) с летальным передозировки анестетика, разрешенной протоколом животных утвержденным IACUC., Например, 1 мл 2,5% Avertin. Подождите мыши, чтобы остановить дыхание и быть полностью нечувствительной к вредных раздражителей (заднюю лапу пинч).
    Примечание: смещения шейных позвонков и эвтаназии диоксидом углерода следует избегать, поскольку это может негативно влиять на жизнеспособность клеток легких.
  2. Остановите курсор мыши над рассечение борту и стерилизовать мышь с 70% этанола.
  3. Используйте хирургические ножницы, чтобы сначала сделать поперечную эпигастрии разрез через кожу, а затем аналогичным разреза через брюшину. Удерживая рассечение доска в вертикальном положении и сократить нисходящей аорты, так что пулы крови вниз в живот и не в грудной полости.
  4. Sпресечь небольшое отверстие в диафрагме, чтобы освободить вакуум. Сокращение вдоль 10-й и 12-го ребра, чтобы вырезать диафрагму и получить визуальный доступ к легким.
  5. Используйте хирургические ножницы, чтобы вырезать кожу до трахеи над грудной клетки, но оставить грудную клетку нетронутыми. Отделить кожу от грудной клетки. Expose трахеи путем удаления окружающий соединительной ткани, соблюдая осторожность, чтобы не повредить саму (1А) трахеи.
  6. Надрез небольшое отверстие около 1 мм в диаметре в открытой трахеи параллельно хрящевых колец, как можно ближе к гортани, насколько возможно (рис 1б). Будьте осторожны, чтобы не полностью прорезать трахеи.
  7. Возьмите 20 G иглу и аккуратно вставьте иглу 4-5 мм в трахею без каких-либо противодействующей силы (рис 1D). Конец иглы должен быть виден через трахею (рисунок 1С). Используйте пинцет, чтобы стабилизировать иглу в трахею. Альтернативно, шовный могут быть привязаны Ароунд трахею провести иглу на месте.
    Примечание: При введении слишком глубоко, то киль может быть травмированы или только одна сторона легких может быть завышены.
  8. Заполните шприц с 400 мкл 37 ° C 2% агарозы легкоплавки температур (взятой непосредственно из ванны с постоянной температурой). Убедитесь, что рассечение доска встает и медленно привить теплую агарозы через иглу в легкие, использовать ~ 400 мкл раздуть легкие.
    Примечание: Смотрите легкие надувать внутри грудной клетки. Не слишком раздувать легкие, как это приведет к разрыву.
  9. После того, как легкие раздуваются, заполняя ~ ⅔ части грудной клетки, отсоединить шприц и держать иглу внутри трахеи, чтобы предотвратить любую утечку агарозы.
  10. Налейте примерно 50 мл 20 ° C PBS более надутых легких, чтобы позволить агарозы внутри легких для установки и затвердеть. Медленно извлеките иглу и закрыть трахеи пинцетом, чтобы предотвратить любой не затвердевает агарозы от утечки.
  11. Expose легкие, выполняя стернотомию и впоследствии вырезать легкие. Для удаления легких, провести на трахею при резке через трахею полностью. Осторожно потяните трахеи вверх, отрезать соединительную ткань и пищевод, потянув легкие из грудной полости, пока легкие не отделяется от мыши (рис 1E).
  12. Погрузитесь в легкие в теплой RPMI-1640, чтобы смыть избыточную кровь и осторожно отделить лепестки с помощью ножниц и щипцов, чтобы сократить главном стебле бронхов лепестков "на воротах (рис 1F).
  13. Поместите лепестки, с плоской поверхностью вниз, чтобы максимизировать поверхность формирования изображения, в лунке изображений пластины 24-луночного (рис 1G). Добавьте 100 мкл 37 ° C RPMI-1640 на верхней части лопастей. Место несколько 15 мм круглой микроскоп крышки скользит по верхней части мочки, чтобы предотвратить его плавающим.
  14. Налейте теплую PBS в окружающие скважин для предотвращения RPMI-1640 с EVAPorating. Вставьте 24-луночного планшета в уравновешенную климатической камере и поддерживать долей легких при 37 ° С с воздушным и 5% CO 2. Вставьте климатической камере на стадии конфокальной микроскопии.
    Примечание: Другие газовые смеси (например, 5% O 2, 5% СО 2 в N 2 для изучения поведение клеток в условиях гипоксии / нижней кислорода) также может быть рассмотрен.

figure-protocol-1
Рисунок 1. Протокол для приготовления легких для живого изображения. (А) Воздействие на трахею после приготовления мыши. (Б) Малый надрез выполнен в открытой трахеи параллельно хрящевых колец. (C) 20 G иглы вставляются 4-5 мм в трахею. (D) Инстилляции 400 мкл 2% легкоплавких температуре агарозы в легкие. (Е) Влиянованные легкие отделены от мыши. (F) Лопасти отделяют после инфляции. (G) лепестков помещают в лунку пластины изображения 24-луночного. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.

6. Приобретение и анализа изображений

Примечание: Изображения могут быть приобретены с различными вращающийся диск конфокальной микроскопы, поддерживаемые различными программами. В этом протоколе, либо μManager с заказного вращающийся диск конфокальной микроскопии или дзен с коммерчески доступного вращающийся диск конфокальной микроскопии используется для получения изображения, в то время как Imaris используется для редактирования и анализа фильма.

  1. Получение изображений с помощью μManager. Подробное пошаговое протокола для приобретения изображений с использованием программного обеспечения μManager предварительно описано 18.
    ИЛИ
  2. Получение изображенийиспользуя программное обеспечение для анализа изображений, например Zen (рис S1).
    1. Нажмите на вкладку "Расположить", и выбрать цель (10x или 20x) в 'световой путь' инструмента (рис S1A, красное поле). Впоследствии, нажмите на кнопку "глаза - DAPI ', чтобы посмотреть на канале CFP через окуляр (Рисунок S1A, синей коробке). Локализация образца вручную с помощью микроскопа. Нажмите "Все Off'after ткани является центром поля зрения.
    2. Нажмите на вкладку "Приобретение", чтобы установить все параметры для получения изображения.
    3. В инструменте 'Каналы', нажмите кнопку "+" (рис s1b, выделена красным). Всплывающее меню появляется и поиск красителя (ов), присутствующего в образце в 'Dye Database' (рис s1b). Выберите краситель и нажмите кнопку "Добавить".
      Примечание: Программа будет установлена ​​все фильтры должны быть оптимизированы. Краситель может быть удаленавыбрав его последующим нажатием кнопки корзины (рис s1b, квадрат желтого цвета).
    4. В меню "Режим захвата 'установите' Биннинг ', чтобы 5x5. Двойной щелчок по ECFP в меню каналов, чтобы выбрать его. Опустите мощность лазера до 20%, так что выборка не будет беленой при настройке параметров для получения изображения.
    5. Установите флажок "плиток в разделе" Эксперимент менеджер 'и инструмент плитки появляется в группе инструментов "многомерные Acquisition" (рис S1C). Нажмите на кнопку 'Advanced Setup', чтобы посмотреть живое изображение с камеры. Нажмите на кнопку "Добавить" в разделе "позиции", чтобы добавить 4 до 6 позиции в эксперименте. Чтобы удалить позицию, выберите эту позицию и нажмите на кнопку мусорного ведра.
    6. В группе инструментов "Приобретение Параметр ', открыть инструмент" Плата стратегия », и выберите« Absolutе Исправлена ​​Z-позицию "из выпадающего списка.
    7. Установите флажок Z-Stack в разделе "Эксперимент менеджер» и инструмента Z-Stack появляется в группе инструментов в 'многомерных приобретения' (рис S1D). Двойной щелчок по одному из положений в разделе "Позиции" и нажмите кнопку "Live". Вручную установить первый и установить последнюю позицию области изображения. Установить интервал в 4 мкм.
      Примечание: Программа будет определить число срезов для выбранного диапазона и интервала. В идеале, 5-7 ломтика удобны, чтобы обеспечить достаточное визуализации и быстрого получения изображения.
    8. Проверьте флажок "Временные ряды" в разделе "Эксперимент менеджер '. Установите желаемый 'Продолжительность' и 'Интервал' раз в инструментальной временные ряды ', которая появилась в группе инструментов "многомерные Acquisition" (рис s1e).
    9. В «Acquisiным образом Mode 'меню, установить "Биннинг', чтобы 2x2. Двойной щелчок на флуорофора в меню каналов, чтобы выбрать его и увеличить мощность лазера до 100%. Нажмите 'Живая' и отрегулировать 'Время экспозиции'. Повторите эту процедуру для каждого флуорофора.
    10. Установите флажок "Разрешить Автосохранение 'окно. Выберите папку и введите имя файла. Все полученные изображения будут автоматически сохранены в этой папке.
    11. Нажмите на кнопку 'Пуск' эксперимента в разделе «Эксперимент менеджер", чтобы начать сканирование изображения.
  3. После получения изображения, компилировать исходные данные в программном обеспечении Imaris. Преобразование изображения в .ims файлы и настройки могут быть сделаны. Подробное пошаговое протокола для преобразования файлов, внося коррективы и сохранения фильмов с помощью Imaris предварительно описано 18.
  4. При сохранении фильма, установить 'Frame Rate' 5 кадров в секунду (FPS).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Используя спиннинг-диска конфокальной микроскопии, различные модели мыши системы и уколы, метастатической микросреда могут быть визуализированы и проследить во времени. Использование MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; гр-FMS-EGFP тройной трансгенная мышиная модель, разные клеточные компоненты флуоресцентную метку (2А, Фильм 1). Типичная структура легочной паренхимы могут быть визуализированы в канале CFP поскольку все клетки экспрессируют ECFP под -актина промотора. Большие / многоклеточные...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Эта рукопись описывает подробную способ экс естественных живых изображений метастазов в легких в мышиных моделях метастазов. Этот протокол изображений обеспечивает прямой визуализации динамических и пространственных взаимодействий опухолевых клеток стромы внутри микросреды легких. Это относительно легко и быстро метод, который позволяет надежную визуализацию метастазов в легких, по крайней мере 4 часа. Фильмы, приобретенные в результате этих экспериментов могут быть использованы для отслеживания динамических пр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколами, утвержденными IACUC, UCSF.

Благодарности

Мы благодарим Нгуен Х. Нгуен за ее техническую помощь и Одри О'Нил за поддержку с конфокальным микроскопом Zeiss Cell Observer с вращающимся диском. Эта работа была поддержана стипендией Министерства обороны США для постдокторантов (W81XWH-11-01-0139) и Программой постдокторских премий Института Вейцмана — Национальной программы постдокторских премий за продвижение женщин в науке (для вице-президента).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Мыши MMTV-PyMT/FVBЛаборатория Джексона2374Самки мышей
ACTB-ECFP/FVB МышиUCSF Werb LabsСамки
мышей c-fms-EGFP/FVBUCSF Werb Лабораторныесамки
FVB мыши Лаборатория Джексона1800Самки мышей
GFP+ VO-PyMT клеткиUCSF Werb lab
70 000 кДа Декстран, родамин-конъюгированныйинвитрогенD1818развести до 4 мг/мл в 1 x PBS и хранить при температуре -20  °C. Использовать 0,4 мг на животное.
10 000 кДа Декстран, Alexa Fluor 647 конъюгированныйInvitrogenD22914Разведите до 4 мг/мл в 1 x PBS и храните при -20   °C. Используйте 0,4 мг на животное.
Антитело против мышей Gr-1 Alexa Fluor 647UCSF Ядро моноклонального антителаБульон 1 мг/мл. Используйте 7 мкг на животное.
Анестезиологическаяанестезия, одобренная IACUC, используется для анестезии и/или эвтаназии
1X PBSUCSF клеточная культура
PBS, USP стерильная Amresco INCK813-500MLУльтрачистый сорт для внутривенного впрыска
Пенополистирольная платформаБудет использоваться в качестве платы для препарирования
Тонкие ножницы острые Fine Science Tools14060-11
ЩипцыRoboz Surgical StoreRS-5135
Стерилизатор горячих шариковFine Science Tools18000-45Включите за 30 минут до использования
ВоздухUCSF
КислородUCSF
Углекислый газUCSF
1 мл шприц без иглы BD309659
27 г x 1/2 игла   BD305109для внутривенного введения
20 G x 1 игла, короткий скос;  BD305178
Низкотемпературная агароза Lonza50111Для приготовления 10 мл раствора взвесьте 0,2 г агарозы, добавьте к 10 мл 1 х PBS и подогрейте до растворения. Агароза застынет при комнатной температуре, поэтому выдерживать при температуре 37 °°; C водяной баней до тех пор, пока не используется для надувания.
RPMI-1640 среда без фенола красногоLife Technologies11835-030
24 лунки Imaging plate Электронная промышленность и энергетика K scientificEK-42892
Предметные стекла, 15 мм Fisher Scientific22-031-144
Цифровой контроллер CO2 и температурыOkolabDGTCO2BXhttp://www.oko-lab.com
Климатическая камераOkolabhttp://www.oko-lab.com
Cell Observer вращающийся диск конфокальный микроскопZeiss
Zen программное обеспечениеZeiss
Carl Zeiss IncZeiss Axiovert 200M
ICCD камераStanford PhotonicsXR-Mega-10EX S-30
Вращающийся диск конфокальная сканирующая головкаYokogawaCorporation CSU-10b
ImarisBitplane
mManagerVale lab, UCSFПрограммное обеспечение с открытым исходным кодом
мыши Инвертированный микроскоп Zeiss

Ссылки

  1. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
  2. Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. The cancer stem cell niche: how essential is the niche in regulating stemness of tumor cells. Cell stem cell. 16 (3), 225-238 (2015).
  3. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
  4. Egeblad, M., Ewald, A. J., et al. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1 (2-3), 155-167 (2008).
  5. Ellenbroek, S. I. J., van Rheenen, J. Imaging hallmarks of cancer in living mice. Nat Rev Cancer. 14 (6), 406-418 (2014).
  6. Looney, M. R., Thornton, E. E., Sen, D., Lamm, W. J., Glenny, R. W., Krummel, M. F. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
  7. Thornton, E. E., Krummel, M. F., Looney, M. R. Live imaging of the lung. Cur Protoc Cytom. , (2012).
  8. Thornton, E. E., Looney, M. R., et al. Spatiotemporally separated antigen uptake by alveolar dendritic cells and airway presentation to T cells in the lung. J Exp Med. 209 (6), 1183-1199 (2012).
  9. Mendoza, A., Hong, S. -H., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
  10. Lelkes, E., Headley, M. B., Thornton, E. E., Looney, M. R., Krummel, M. F. The spatiotemporal cellular dynamics of lung immunity. Trends Immunol. 35 (8), 379-386 (2014).
  11. Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Mol Cell Biol. 12 (3), 954-961 (1992).
  12. Hadjantonakis, A. -K., Macmaster, S., Nagy, A. Embryonic stem cells and mice expressing different GFP variants for multiple non-invasive reporter usage within a single animal. BMC Biotechnol. 2, (2002).
  13. Casbon, A. -J., Reynaud, D., et al. Invasive breast cancer reprograms early myeloid differentiation in the bone marrow to generate immunosuppressive neutrophils. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (6), 566-575 (2015).
  14. Donovan, J., Brown, P. Parenteral injections. Curr Protoc Immunol. , (2006).
  15. Halpern, J., Lynch, C. C., et al. The application of a murine bone bioreactor as a model of tumor: bone interaction. Clin Exp Metastas. 23 (7-8), 345-356 (2006).
  16. Sasmono, R. T., Oceandy, D., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
  17. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy. Cold Spring Harb Protoc. (2), (2011).
  18. Bonnans, C., Lohela, M., Werb, Z. Real-time imaging of myeloid cells dynamics in ApcMin/+ intestinal tumors by spinning disk confocal microscopy. J Vis Exp. (92), (2014).
  19. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer cell. 21 (4), (2012).
  20. Cheng, N., Lambert, D. L. Mammary transplantation of stromal cells and carcinoma cells in C57BL/6J mice. J Vis Exp. (54), (2011).
  21. Al-Mehdi, A. B., Tozawa, K., Fisher, A. B., Shientag, L., Lee, A., Muschel, R. J. Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis. Nat Med. 6 (1), 100-102 (2000).
  22. Wong, C. W., Song, C., et al. Intravascular location of breast cancer cells after spontaneous metastasis to the lung. Am J Pathol. 161 (3), 749-753 (2002).
  23. Liang, C. -C., Park, A. Y., Guan, J. -L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
  24. Nelson, K., Bobba, C., Ghadiali, S., Hayes, D. J., Black, S. M., Whitson, B. A. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World J Exp Med. 4 (2), (2014).
  25. Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40 (5), 1151-1159 (2004).
  26. Motoike, T., Loughna, S., et al. Universal GFP reporter for the study of vascular development. Genesis. 28 (2), (2000).
  27. Srivastava, M. K., Andersson, A., et al. Myeloid suppressor cells and immune modulation in lung cancer. Immunotherapy. 4 (3), (2012).
  28. Craig, A., Mai, J., Cai, S., Jeyaseelan, S. Neutrophil recruitment to the lungs during bacterial pneumonia. Infect Immun. 77 (2), 568-575 (2009).
  29. Kreisel, D., Nava, R. G., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Взаимодействия между опухолью и стромойконфокальная микроскопия с вращающимся дискомфлуоресцентные репортерные мышитайм-лапс визуализацияподвижность раковых клетоквзаимодействия иммунных клетокинфляция легких в агарозевизуализация микроокружения
Экс Vivo Живая съемка Метастазы в легких и их микроокружения
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.