Методическая статья

Иммунное окрашивание фосфо-эпитопы в мерцательного органах вся гора эмбрионов данио

DOI:

10.3791/53747

⸱

19 февраля 2016 г.

 ,  , 
1Department of Biology, Virginia Commonwealth University, 2Center for Human Disease Modeling, Duke University Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Методы описаны в immunostain фосфо-эпитопы в целых эмбрионов данио, а затем провести двухцветную локализацию флуоресцентного конфокальной в клеточных структурах, как малые, как первичных ресничек. Методики фиксации и обработки изображений может определять местоположение и кинетику появления или активации специфических белков.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Быстрое распространение клеток, выражение тканеспецифическая генов и появление сигнальных сетей характеризуют раннее эмбриональное развитие всех позвоночных. Кинетика и расположение сигналов - даже в пределах одной клетки - в развивающемся эмбрионе дополняет идентификацию важных генов в развитии. Иммунное окрашивание методы описаны, что, как было показано, чтобы определить кинетику внутриклеточных и целых сигналов животных в структурах, как малые, как первичных ресничек. Методы для фиксации, визуализации и обработки изображений с использованием лазерно-сканирующей конфокальной сложный микроскоп может быть завершена в качестве всего лишь 36 часов.

Данио рерио (Danio rerio) является желательным организм для исследователей, которые стремятся проводить исследования в видах позвоночных, что является доступным и отношение к болезни человека. Генетические нокауты или нокдаунов должна быть подтверждена потерей фактического белкового продукта. Такое подтверждение потери белкаможет быть достигнуто с помощью методов, описанных здесь. Ключи в сигнальных путей также могут быть расшифрованы с использованием антител, которые реагируют с белками, которые были посттрансляционно модифицированных путем фосфорилирования. Сохранение и оптимизацию фосфорилированный состояние эпитопом Поэтому крайне важно, чтобы это определение и осуществляется этим протоколом.

Это исследование описывает методы, чтобы исправить эмбрионов в течение первого 72 ч развития и сотрудничества, локализовать различные соответствующих эпитопов с ресничек в Купфера везикул (кВ), почку и внутреннее ухо. Эти методы являются простыми, не требуют рассечение и может быть завершена в течение относительно короткого периода времени. Проектирование стеки конфокальной изображения в одно изображение является полезным средством представления этих данных.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанные здесь методы являются результатом исследований, направленных на определение нисходящих мишеней сигналов Ca2+ во время событий, происходящих на ранних стадиях развития, включая оплодотворение, гаструляцию, сомитогенез и формирование туловища, глаза, мозга и органов. 1-3 Первоначальные открытия эмбриональной передачи сигналов Ca2+ зависели от использования природных и инженерных индикаторов Ca2+, таких как экворин4 и фура-2. 5 Даже при современных технологиях обнаружение переходных высот Ca2+ требует громоздких аналитических инструментов и не позволяет выявить цели таких сигналов Ca2+.

Эта лаборатория исследует сигналы Ca2+, которые действуют через Ca2+/кальмодулин-зависимую (многофункциональную) протеинкиназу, известную как CaMK-II, фермент, который обогащен в центральной нервной системе и первоначально идентифицирован как регулятор долгосрочного потенцирования. 6 CaMK-II не специфичен для мозга, широко экспрессируется и высоко сохраняется на протяжении всей жизни и тела видов животного мира, включая беспозвоночных. 7,8 CaMK-II обладает уникальной способностью поддерживать собственную активность даже после снижения уровня Ca2+ благодаря своей способности аутофосфорилировать при Thr287. В этом аутофосфорилированном состоянии CaMK-II остается активным Ca+/CaM-независимым образом до тех пор, пока не дефосфорилируется. 6 Таким образом, локализация фосфорилированного CaMK-II (Thr287) позволяет идентифицировать клетки, в которых произошло естественное, релевантное повышениеCa2+.

Антитело против аутофосфорилированного (P-Thr287) CaMK-II млекопитающих было хорошо охарактеризовано и первоначально использовалось для локализации активированного CaMK-II в ткани мозга. 9 Данио-рерио (Danio rerio) имеют семь генов CaMK-II10,11, белковые продукты которых содержат последовательность MHRQE[pT287]VECLK в этой области. 10,11 Эта последовательность очень похожа на фосфопептидный антиген, используемый для создания этого поликлонального антитела кролика (MHRQE[pT]VDCLK; Upstate/Millipore), и поэтому не было полным сюрпризом, что это антитело вступило в перекрестную реакцию с рыбкой данио-рерио CaMK-II. Эта лаборатория показала, что это антитело реагирует с рыбкой данио рерио CaMK-II пропорционально аутофосфорилированию и Ca2+/CaM-независимой активности. 12 Также было показано, что дополнительные панспецифические антитела CaMK-II вступают в перекрестную реакцию с CaMK-II рыбок данио. 13

Это антитело было использовано для демонстрации того, что CaMK-II данио рерио преимущественно активируется в клетках на одной стороне везикулы Купфера (KV) данио-рерио, реснитчатого органа, необходимого для установления левой/правой асимметрии. 12 Данное антитело было использовано для демонстрации того, что CaMK-II временно активируется в четырех соседних клетках на левой стороне KV в течение той же фазы развития, на которой определяется позиционирование органа. 12 В дополнение к везикуле Купфера (KV), аутофосфорилированный (P-T287) также располагался в специфических внутриклеточных участках в других реснитчатых тканях, включая почки, невромасты и внутреннее ухо. 12,13 В почках рыбок данио-рерио P-T287-CaMK-II обогащается вдоль апикальной границы реснитчатых протоковых клеток и внутри клоакальных ресничек, где он влияет на их сборку. 13 Наконец, в развивающемся внутреннем ухе P-T287-CaMK-II интенсивно концентрируется у основания ресничек и влияет на дифференцировку клеток через сигнальный путь Delta-Notch. 14 Таким образом, обнаружение активированного CaMK-II позволило точно определить участки внутриклеточного высвобожденияCa2+ и выявить потенциальные новые сигнальные пути.

Эти открытия полностью зависели от разработки чувствительного и точного метода локализации активированного (P-T 287-аутофосфорилированного) CaMK-II. Описаны методы фиксации и иммуноокрашивания данио-рерио KV, почек и внутреннего уха. Также описаны ограничения этой методики. Эти методы должны быть полезны любому исследователю, который стремится получить изображения с высоким разрешением в двух флуоресцентных каналах не только фосфо-эпитопов, но и любого эпитопа во время раннего развития позвоночных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Данио процедуры этого протокола были утверждены животных уходу и использованию комитета Institutional (IACUC) в Университете Содружества Вирджинии мимо.

1. Подготовка реагентов

  1. 4% PFA / PBS. Взвесьте 8 г параформальдегида (PFA) в вытяжном шкафу. Хотя до сих пор в вытяжном шкафу, растворить сухой PFA в ~ 80 мл дистиллированной H 2 O при перемешивании и нагревании до 50 ° C. При перемешивании добавить 3 - 10 капель свежего 1N NaOH до PFA полностью не растворится и раствор уточняет. Снять с огня и добавить 100 мл 2x фосфатно-солевой буфер (PBS). Принесите объем до 200 мл дистиллированной H 2 O. Охлаждают до комнатной температуры и подтверждения рН 7,4 перед использованием. Хранить в темном месте при температуре 4 ° С, но использовать в течение одной недели.
  2. Используйте 100% метанола без каких-либо добавок. Используйте 95% этанола без каких-либо добавок.
  3. Подготовьте с фосфатным буфером Tween (РВТ). Дополнение фосфатно-солевом буфере (PBS) с 0,1% твина-20. Добавить 0.5 мл 20% -ного твина-20 маточного раствора до 100 мл 1X PBS. Хранить при комнатной температуре.
  4. Подготовьте с фосфатным буфером Triton-X (PBTx). Дополнение PBS с 0,1% Triton X-100. Добавить 0,5 мл 20% Triton X-100 на складе в 100 мл PBS. Хранить при комнатной температуре.
  5. Подготовьте 10% NGS / PBTx. Нормальной козьей сыворотки (NGS) блокирует неспецифические сайты связывания. Хранить NGS в аликвотах при -20 ° C. Чтобы использовать, добавьте 1 мл до 9 мл PBTx.
  6. Подготовьте 50% глицерина / PBS. Тщательно перемешать в равных частях 2x PBS и 100% глицерина. Хранить при комнатной температуре.

2. Эмбрион Фиксация

  1. . (. Например, β-актина: CAAX-GFP) Разведение Получить дикого типа (АВ и WIK) или трансгенные эмбрионы через естественные спариваний. При желании, придать эмбрионов с конструкциями или Morpholinos, как описано. 15,16
  2. Повысить эмбрионов. Collect эмбрионов и инкубировать при 28,5 ° C в присутствии 0,003% 1-фенил-2-тиомочевины (ПТУ), чтобы блокировать пигментацию, как описано. 17 р>
  3. Фикс. Когда эмбрионы достигли желаемого стадию развития, 18,   обезболить эмбрионов с использованием MESAB, удалить как можно больше водной системы насколько это возможно и добавить свежий 4% PFA / PBS в течение 3 - 4 ч при комнатной температуре. Примечание: в разы меньше, чем 20 ч после оплодотворения (ФВЧ), исправить до dechorionation. Порой после 20 часов после оплодотворения, dechorionate до фиксации с использованием двух пар тонких точечных щипцов при вскрытии микроскопом.
  4. Изменение решения. Передача эмбрионы, используя широким отверстием пипетки, как описано. 17 Изменить решения в 1,5 мл микроцентрифужных крышками трубки, просто позволяя эмбрионов урегулировать под действием силы тяжести без центрифугирования.
  5. Пост-фиксатор Через 3 - 4. Ч удалить PFA / PBS, заменить 100% метанола и хранят при -20 ° С в течение по меньшей мере 48 ч. Примечание: Для максимального P-CaMK-II иммунореактивности, ограничить общее время хранения метанола до одной недели.
"> 3. Иммунологическое Всего Эмбрионы

  1. Поместите минимум 10 эмбрионов для каждой экспериментальной состоянии в ограничен 1,5 мл микроцентрифужных трубки, и обозначить их.
  2. Разрешить эмбрионы урегулировать. Удаляют метанол и увлажняет с прогрессивными стирок содержащий 0,5 мл уменьшением концентрации этанола, как указано в следующей стадии. Каждый шаг является 5 мин промывка качалки.
  3. Постепенно увлажняет с этими 5 решений: 66% этанол / 33% PBTx, 33% этанол / 66% PBTx, 100% PBTx, 100% PBTx (это первое повторение PBTx), 100% PBTx (это второй повтор PBTx).
  4. Удалить последней промывки PBTx. Добавить 0,5 мл 10% NGS / PBTx. Выдержите в течение по крайней мере 1 час при комнатной температуре при осторожном качания, а затем удалить и выбросить решение.
  5. Получают раствор первичного антитела путем разбавления в 10% NGS / PBTx. Если со-иммунное, использовать более высокое сродство антитела первым. Для этого исследования, инкубировать с мышиным анти-ацетилированный тубулина моноклонального антитела, разбавленного 1: 500. Для examplе, если есть 10 образцов, сочетающие 6 мкл раствора складе антитела с 3 мл 10% NGS / PBTx а затем распределяют 0,3 мл этого в каждую пробирку.
  6. Добавить 0,2 - 0,5 мл разбавленного первичного антитела в каждую пробирку погрузить все эмбрионы. Выдержите с нежным качалке O / N при комнатной температуре.
  7. Утром снимите и выбросьте раствор антител. Добавить 0,5 мл 2% NGS / PBTx чтобы смыть лишнюю первичное антитело. Осторожно покачайте в течение 5 мин. Удаляют решение. Повторите дважды.
  8. Дим верхний свет и разбавить соответствующий флуоресцентно-конъюгированного вторичного антитела в 10% NGS / PBTx так что каждое условие содержит, по меньшей мере, 0,5 мл. С мышиного антитела против ацетилированного тубулина первичного антитела, используйте зеленый флуоресцентный краситель козий анти-мыши IgG при разведении 1: 500.
  9. Выдержите вторичного антитела в течение 4 часов с нежным качалки при комнатной температуре в темноте. С этого момента, процесс образцы под приглушенное освещение и инкубировать в темном контейнере или путем обертывания в алюминиевую фольгу.
  10. В конце инкубации, удалить и выбросить решение вторичное антитело. Добавить 0,5 мл 2% NGS / PBTx мыть. Осторожно покачайте в течение 5 мин. Удаляют решение. Повторите дважды.
  11. Если со-иммунное, получим второе первичное антитело из различных видов, чем первый первичного антитела. В этих исследованиях, следуют кроличье анти-фосфо CaMK-II антитела красным-флуоресцентный краситель, конъюгированных козьих антител против кроличьего IgG вторичного антитела.
  12. Развести кроличье анти-фосфо CaMK-II антитела 1:20. Для каждой трубки эмбрионов, приостанавливать в 0,3 мл 10% -ного NGS / PBTx, затем добавляют 15 мкл раствора складе антител.
  13. Убедитесь, что эмбрионы погружаются и фонари затемнены. Выдержите при осторожном качалки O / N при комнатной температуре в темноте.
  14. Утром под приглушенный свет, снимите и выбросьте раствор антител. Добавить 0,5 мл 2% NGS / PBTx. Осторожно покачайте в течение 5 мин. Удаляют решение. Повторите дважды.
  15. Держите верхний свет тусклый и разбавить достаточное количество соответствующего флуоресцентно-conjuзакрытый вторичное антитело, так что каждое условие содержит, по меньшей мере, 0,5 мл. В этом исследовании, разбавить красную-флуоресцентный краситель, конъюгированных козьих антител против кроличьего IgG вторичного антитела (красный канал) 1: 500 в 10% NGS / PBTx.
  16. Выдержите вторую вторичные антитела в течение 4 часов с нежным качалки при комнатной температуре в темноте.
  17. В конце этой инкубации и под приглушенным светом, удалить и выбросить решение вторичное антитело. Добавить 0,5 мл PBTx. Осторожно покачайте в течение 5 мин. Удаляют решение. Повторите дважды. Хранить в любом PBTx или 50% глицерина / PBS в зависимости от процедуры визуализации.

4. конфокальной микроскопии и обработки

  1. Маунт эмбрионов для работы с изображениями. 1 место - 5 эмбрионов на предметное стекло. Создание камеру между главной покровное и ползуна с использованием фрагментов покровного стекла в каждую сторону от камеры. Как правило, четыре # 1 покровные используются, чтобы сделать эти разделительные стеки без герметизации.
    Примечание: Нет гистологическая среда не является необходимым.
  2. Используйте масло погружения 100XЦель довести одного эмбриона в фокусе использованием проходящего света. Выключить свет. Включите конфокальной микроскопии. Убедитесь, что соответствующие лазеры (зеленый и / или красный) и включены дистанционного внимание соучастником занимается.
  3. Включите конфокальной программы. В "Снимок панели", выбрать нужный цели. В баре "XY Basic", установить размер изображения 1024 нажав кнопку 1,024.
  4. В "лазерных и детектор" бар, нажмите на красную 488 коробка и зеленой 568 коробки, чтобы включить лазер и детектор для каждого канала. Установите обскура до среднего и регулировать усиление в "Gain" строке каждого канала, чтобы визуализировать.
  5. В "приобретают Настройки" панели, нажмите кнопку "Live", чтобы начать получения изображений. В "View Settings" панели, снимите флажок "Force Integral Zoom" до центра в "Живом" окна.
  6. В баре "Приобретение Настройки" на вкладке "Z", шаг через слои изображения. После выбора NUmber оптических секций включить в образ, перейти к какой-то момент в «центра» г-плоскости.
  7. На вкладке "Z", нажмите на маленькую красную "ссылка" окно. Это нулю RFA в точке, выбранной в качестве «центра». В поле "Размер шага", выберите толщину слоев (от 0,25 мкм и 2,0 мкм идеально подходит). Обратите внимание на поле "Размер файла" и пытаются ограничить до 1 Гб.
    Примечание: Как правило, до 40 оптических секций 0,5 - 1,0 мкм, получают, но количество секций может быть определена эмпирически.
  8. Чтобы найти верхнюю крайнюю изображения, нажмите круг рядом с "Top" и двигаться через г слоев. Теперь нажмите круг рядом с "Bottom", то компьютер будет принимать изображение обратно к слою в качестве центра. Опять двигаться сквозь слои найти нижнюю крайнюю изображения.
  9. Нажмите на кнопку "Live" снова в "Снимок Настройки" поле, чтобы остановить лазерполучение. В этой панели, нажмите красные коробки помечены средних и Z-Stack. Эти коробки станет зеленым.
  10. В поле "приобретают Настройки", нажмите кнопку "Single", чтобы приобрести всю серию изображений. Вы можете следить за ходом, как он сканирует в обоих каналах и через весь г-стека.
  11. Чтобы сохранить, нажмите на окне тома и нажмите "Сохранить как" и имя файла. Сохранить в виде файла ".ids". Для объема обработать файл в то время как г-стек по-прежнему открыт, выберите данные выпадающего меню и нажмите на кнопку "объема оказания". Сохранить оказанных файл в виде файла TIFF. Это проецируемое изображение, которые показаны в данной публикации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оптимальные условия для визуализации фосфо-эпитопы

Методы, описывающие иммунолокализации белковых эпитопов в эмбрионов данио были относительно редкими по сравнению с теми для локализации мРНК с помощью гибридизация. Фиксаторы, используемые в локализации белка эпитопы в ресничных клетках эмбрионов данио включили 4% PFA / PBS и фиксатором Дента, который представляет собой смесь метанола и ДМСО. 19<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Способ / метанол PFA был разработан в этой лаборатории с основной целью оптимизации иммунолокализации в -CaMK-II эпитопа фосфо-T 287 во данио развития. Этот метод успешно локализованы P-CaMK-II при образовании нескольких ресничных органов, включая данио К.В., 12 внутреннего уха 14 и почки. 13 В частности, на этапе кВ, эта техника была необходима. Успех этого метода, скорее всего из-за комбинации) минимизации флуоресценции, б) сохранение эпитопа фосфо-CaMK-II и С) расширения до...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантом Национального научного фонда IOS-0817658.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1-фенил-2-тиомочевина (ПТУ)SigmaP-76290,12% стоковый раствор. Разведите в 1:40 в системной воде
Alexa488 против мыши IgGLife TechnologiesA11001Коза поликлональная, используйте в 1:500
Alexa488 против кролика IgGLife TechnologiesA11008Козья поликлональная, используйте в 1:500
Alexa488 фаллоидинLife TechnologiesA12379Преимущественно связывается с F-актином
Alexa568 против мыши IgGLife TechnologiesA11004Коза поликлональная, использовать в 1:500
Alexa568 анти-кроличий IgGLife TechnologiesA11011Коза поликлональная, использовать в 1:500
антиацетилированный α-тубулинSigmaT7451Мышиный моноклональный, использовать в 1:500
антифосфо-T287 CaMK-IIEMD Millipore06-881Кролик поликлональный, использовать в соотношении 1:20
анти-общий CaMK-IIBD Biosciences611292Мышь моноклональная, использование в соотношении 1:20
ЭтанолFisherS96857Лабораторный класс, 95% денатурированный
щипцыFine Science Tools11252-20Dumont #5
Стеклянные покровные стеклаVWR16004-330#1  толщина
Стеклянные предметные стекла для микроскопаFisher12-550-15Стандартные стеклянные стекла
МетанолFisherA411Хранить в морозильной камере
Микроцентрифуга пробиркиVWR20170-038закрытые пробирки, не стерильные
Нормальная козья сывороткаLife Technologies16210-064Аликвота 1 мл тубы, хранить в морозильной камере
ПараформальдегидSigmaP-6148Реагент марки, кристаллический
Фосфат буферизованный физиологический раствор (PBS)Качество Биологическое119-069-13110х стоковый раствор или сделанный в лаборатории
Triton X-100SigmaBP-15110% раствор в воде, хранить в RT
Tween-20Life Technologies8511310% раствор в воде, хранить в
RT Compound микроскопNikonE-600Крепление на безвибрационный стол
C1 Plus двухлазерный сканирующий конфокальныйNikonC1 PlusРаботать по программе EZ-C1, но при модернизации использовать " Элементы»

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Webb, S. E., Miller, A. L. Calcium signalling during embryonic development. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 539-551 (2003).
  2. Webb, S. E., Miller, A. L. Ca2+ signalling and early embryonic patterning during zebrafish development. Clin Exp Pharmacol Physiol. 34, 897-904 (2007).
  3. Whitaker, M. Calcium at fertilization and in early development. Physiol. Rev. 86, 25-88 (2006).
  4. Yuen, M. Y., et al. Characterization of Ca(2+) signaling in the external yolk syncytial layer during the late blastula and early gastrula periods of zebrafish development. Biochim Biophys Acta. 1833, 1641-1656 (2013).
  5. Tombes, R. M., Borisy, G. G. Intracellular free calcium and mitosis in mammalian cells: anaphase onset is calcium modulated, but is not triggered by a brief transient. J. Cell Biol. 109, 627-636 (1989).
  6. Hudmon, A., Schulman, H. Neuronal Ca2+/Calmodulin-Dependent Protein Kinase II: The Role of Structure and Autoregulation in Cellular Function. Annu. Rev. Biochem. 71, 473-510 (2002).
  7. Tombes, R. M., Faison, M. O., Turbeville, C. Organization and Evolution of Multifunctional Ca2+/CaM-dependent Protein Kinase (CaMK-II). Gene. 322, 17-31 (2003).
  8. Braun, A. P., Schulman, H. The Multifunctional Calcium/Calmodulin-Dependent Protein Kinase: From Form to Function. Annu. Rev. Physiol. 57, 417-445 (1995).
  9. Rich, R. C., Schulman, H. Substrate-directed function of calmodulin in autophosphorylation of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II. J Biol Chem. 273, 28424-28429 (1998).
  10. Rothschild, S. C., et al. Tbx5-mediated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II is necessary for zebrafish cardiac and pectoral fin morphogenesis. Dev Biol. 330, 175-184 (2009).
  11. Rothschild, S. C., Lister, J. A., Tombes, R. M. Differential expression of CaMK-II genes during early zebrafish embryogenesis. Dev Dyn. 236, 295-305 (2007).
  12. Francescatto, L., Rothschild, S. C., Myers, A. L., Tombes, R. M. The activation of membrane targeted CaMK-II in the zebrafish Kupffer's vesicle is required for left-right asymmetry. Development. 137, 2753-2762 (2010).
  13. Rothschild, S. C., Francescatto, L., Drummond, I. A., Tombes, R. M. CaMK-II is a PKD2 target that promotes pronephric kidney development and stabilizes cilia. Development. 138, 3387-3397 (2011).
  14. Rothschild, S. C., et al. CaMK-II activation is essential for zebrafish inner ear development and acts through Delta-Notch signaling. Dev Biol. 381, 179-188 (2013).
  15. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. , e1113(2009).
  16. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. , e1115(2009).
  17. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , University of Oregon Press. (1993).
  18. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  19. Obara, T., et al. Polycystin-2 immunolocalization and function in zebrafish. J Am Soc Nephrol. 17, 2706-2718 (2006).
  20. Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. High resolution whole mount in situ hybridization within zebrafish embryos to study gene expression and function. J Vis Exp. , e50644(2013).
  21. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature. 3, 59-69 (2008).
  22. Harris, P., Osborn, M., Weber, K. Distribution of tubulin-containing structures in the egg of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus from fertilization through first cleavage. J Cell Biol. 84, 668-679 (1980).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CaMKII

Похожие статьи