Этот протокол описывает конкретные методы, используемые для структурной характеристики восстановительных конечных (RE) и внутренних областей гликозильных последовательностей гтероксиланов путем мечения RE 2 аминобензамидом перед ферментативным (эндоксиланазным) гидролизом, а затем анализа полученных олигосахаридов с использованием масс-спектрометрии (MS) и ядерного магнитного резонанса (NMR).
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Секвенирование растений стены Heteroxylans Использование ферментативной, химической (метилирование) и физический (масс-спектрометрия, ядерный магнитный резонанс) Методики
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Этот протокол описывает конкретные методы, применяемые для характеристики восстанавливающего конца (RE) и последовательность гликозильную внутреннюю область (и) heteroxylans. Де-крахмальные стены эндосперме пшеницы клеток выделяли в виде спиртовой нерастворимого остатка (AIR) 1 и последовательно экстрагировали водой (W-SOL Fr) и 1 М КОН , содержащем 1% NaBH 4 (KOH-SOL Fr) , как описано Ратнаяке ЕТ и др. (2014) 2. Два разных подхода (см резюме на рисунке 1) принимаются. В первом случае, интактные W-SOL AXS обрабатывают 2ab помечать исходную RE основной цепи остаток сахара, а затем обрабатывают эндоксиланазой, чтобы сформировать смесь 2ab меченных RE и внутренней области восстановительной олигосахариды, соответственно. Во втором подходе, KOH-золь ПТ гидролизуется с эндоксиланазой сначала подготовить смесь олигосахаридов, которые впоследствии меченных 2ab. В ферментативно выпустили ((ООН) отмеченном) олигосахариды с обеихW- и KOH-SOL Frs затем метилированной и детальный структурный анализ как нативных , так и метилированных олигосахаридов производится с использованием комбинации MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-МС и ESI-MS п. Эндоксиланазой переваривается KOH-золь AXS также характеризуются ядерного магнитного резонанса (ЯМР), которая также предоставляет информацию о конфигурации аномерного. Эти методы могут быть применены к другим классам полисахаридов с использованием соответствующих эндо-гидролазы.
Введение
Heteroxylans представляют собой семейство полисахаридов , которые являются преобладающими нецеллюлозные полисахариды первичных стенок трав и вторичных стенок всех покрытосеменные 3-6. Ксилана магистральные сети различаются по типам и моделей замещения с гликозил (глюкуроновой кислоты (GlcA), арабинозы (Араф)) и не гликозил (O-ацетил, феруловая кислота) остатки в зависимости от типа ткани, стадии развития и видов 7.
Стены из пшеницы (Triticum AESTIVUM L.) , эндосперма состоят в основном из арабиноксиланов (AXS) (70%) и (1 → 3) (1 → 4) -β-D-глюкан (20%) с небольшими количествами целлюлозы и heteromannans (2% каждый) 8. Ксилана цепь может быть различным образом ун-замещенные и преимущественно монозамещенным (в основном O-2 положении и в меньшей степени, O-3-положении) и ди-замещенные (O-2 и O-3 позиции), с & alpha; -L-Ara F остатки 9. Восстанавливающий конец (RE) гетеросвязейксиланы из двудольных (например, Резуховидка Таля) 10 и голосеменных (например, ель (Picea пихта)) 11 содержит характерную последовательность тетрасахарид гликозильную; -β-D-Xyl р - (1 → 3) -α-L-Rha р - (1 → 2) -α-D-Gal р А- (1 → 4) -D-Xyl р. Чтобы понять heteroxylan биосинтез и функции (биологической и промышленных), важно, чтобы полностью секвенировать ксилана позвоночник, чтобы понять типы и образцы замен, а также последовательность восстанавливающего конца (RE).
Конкретные методы, используемые для структурной характеристики восстанавливающего конца (RE) и последовательность гликозильную внутреннюю область (и) heteroxylans описаны в этой рукописи. Методы полагаются на флуорофора мечения (с 2 аминобензамидом (2ab)) восстанавливающий конец (RE) в heteroxylan цепи предшествующего уровня ферментативной (эндоксиланазой) гидролиза. Такой подход, в частности, для РЗ последовательности, быловпервые сообщили в лаборатории - Йорк 10,12-13 , но теперь расширена , чтобы включить внутреннюю область секвенирование и представляет собой сочетание установленных методов , которые в равной степени адаптированы ко всем heteroxylans независимо от их источника изоляции. Этот подход может быть также применен к другим классам полисахаридами, используя (если таковые имеются) соответствующие эндо-гидролазы.
В настоящем исследовании, де-накрахмален стены эндосперме пшеницы клеток выделяли в виде спиртовой нерастворимого остатка (воздух) и последовательно экстрагируют водой (W-золь Fr) и 1 М КОН , содержащем 1% NaBH 4 (КОН-SOL Fr) , как описано в Ратнаяке и др. (2014) 2. Освобожденные олигосахариды с обеих W- и KOH-SOL Frs затем метилированной и детальный структурный анализ как нативных, так и метилированных олигосахаридов производится с использованием комбинации MALDI-TOF-MS, ESI-QTOF-МС-в сочетании с ВЭЖХ с онлайн хроматографическое разделение с использованием с-18 колонке RPи ESI-МС п. Эндоксиланазой переваривается КОН-золь AXS характеризовался также ядерного магнитного резонанса (ЯМР).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Этикетировочное восстанавливающего конца (RE) сахарный остаток W-золь AXS с 2-аминобензамидом (2AB)
- Выдержите W-золь AXS с 2ab (0,2 М) в присутствии 1 М NaBH 3 CN (цианоборгидрид натрия) (рН 5,5) в течение 2 ч при 65 ° С , чтобы преобразовать восстанавливающих концы полисахарид основной цепи с их производными флуоресцентными.
ВНИМАНИЕ: Следующий шаг должен выполняться в вытяжном шкафу , как NaBH 3 CN выпускает ядовитый цианистый газ , когда он находится в контакте с водой.- Взвесить NaBH 3 CN (62,8 мг) и растворяют в воде (1 мл) в микроцентрифужных трубки (1,5 мл) с получением 1 М раствора NaBH 3 CN. Растворите 2AB реагента (27,2 мг) в 1 М растворе NaBH 3 CN (1 мл) при нагревании при 65 ° С и довести рН реакционной смеси (0,2 М 2ab, 1 М NaBH 3 CN) до рН 5,5 с помощью 10% -ной уксусной кислоты.
- Добавить 200 мкл реакционной смеси (0,2 М 2ab, 1 М NaBH 3 CN) в W-такл AXS (1 мг) в стеклянной трубке с крышкой и перемешать с помощью вихревой мешалки. Инкубировать в течение 2 часов при температуре 65 ° C в вытяжном шкафу. Охлаждают суспензию до комнатной температуры и добавить 4 тт. абсолютного этанола.
- Поместите суспензию в холодном хранении (4 ° C) O / N для осаждения полисахаридов.
- Центрифуга (1500 XG, 10 мин, RT) для удаления надосадочной жидкости. Промывают осадок экстенсивно с абсолютным этанолом (4 ×), ацетон (1x) и метанола (1x), центрифугирование между каждой промывке. Вакуумная сушка при 40 ° CO / N.
Примечание: Обширные мойка также удаляет остатки 2ab.
2. Генерация Xylo-олигосахаридов от 2 AB Меченые W-золь AXS
- Растворите 2AB меченый W-золь AXS (1 мг) в 500 мкл буферного раствора ацетата натрия (100 мМ, рН 5) в микроцентрифужных трубки (1,5 мл). Добавить 4 единицы эндоксиланазой (GH 11, [M1]) и инкубировать при температуре 37 ° C в течение 16 часов.
- Уничтожить активность фермента путем нагревания микст реакцииЮр в течение 10 мин в кипящей водяной бане. Охлаждают суспензию до комнатной температуры и передать в стеклянную трубку с крышкой. Добавьте 4 тт. абсолютного этанола и помещают суспензию, в холодном хранении (4 ° C) O / N для осаждения любых непереваренные полисахаридами.
- Центрифуга (1500 XG, 10 мин, RT), чтобы отделить непереваренные полисахариды (пеллет) и эндоксиланазой генерироваться Xylo-олигосахариды (супернатант). Декантируют надосадочную жидкость в чистую стеклянную трубку и поместить его в теплую ванну водой (40 ° C).
- Выпаривают этанол в токе газообразного азота, к объему конечной точке (~ 500 мкл). Замораживание супернатант при -80 ° С в течение 4 ч и сухой замороженный супернатант в сублимационной сушилке для восстановления ксило-олигосахариды.
3. Генерация Xylo-олигосахаридов из KOH-SOL AXS и 2ab маркировки
- Treat KOH-SOL AXS с эндоксиланазой (GH 11, [M1]) для генерации ксило-олигосахаридов, как описано выше (разделы 2.1-2.4).
- Лечить endoxylanase генерируется ксило-олигосахариды с KOH-SOL AXS с реакционной смесью 2AB (0,2 М 2ab, 1 М NaBH 3 CN) , как описано выше (разделы 1.1.1-1.1.2).
- Декантируют надосадочную жидкость в чистую стеклянную трубку и поместить его в теплую ванну водой (40 ° C). Выпаривают этанол в токе газообразного азота, к объему конечной точке (~ 500 мкл). Замораживание супернатант при -80 ° С в течение 4 ч и сухой замороженный супернатант в сублимационной сушилке для восстановления ксило-олигосахариды.
4. MALDI-TOF-MS
- Получение MALDI-матричного решения
- Добавьте небольшое шариком 2, 5-dihydroxbenzoic кислоты (DHB) до 50% ацетонитрила (500 мл), содержащей 0,1% муравьиной кислоты в трубе (MALDI-матрица раствора). Смешайте с помощью вихря, если он быстро растворяется, добавьте еще один маленький совок DHB. Примечание: Идеальная концентрация MALDI-матричного раствора составляет 10 мкг / мкл -1.
- Получение MALDI-целевой плиты
- Депозит aqueoмы олигосахарид (родной) образцы (5-10 мкг) (W-золь и / или KOH-золь) на в MALDI-целевой пластины. Добавить 0,3 мкл раствора MALDI-матрицы с использованием отдельного наконечника и перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Дайте смеси высохнуть при комнатной температуре.
Примечание: Правильно высушенные образцы должны состоять из длинных игольчатых кристаллов, указывающими по направлению к центру пятна. Если депозит является липким и / или вязкий образец может быть либо слишком сгущенные или состоят из солей, такие месторождения вряд ли будут производить хорошие спектры и образец должен быть очищен далее. - Введем целевую пластину в источник MS и работать в положительном (+ IVE) режиме ионов. Регулировка напряжения акселератора до 19,0 кВ на источник ионов 1 и 16,3 кВ на источнике ионов 2. Отрегулировать мощность лазера до более чем 70%. Выберите место образца на MALDI-целевой пластины и нажмите кнопку Пуск, чтобы начать лазерные выстрелы.
Примечание: Все области мишени не даст сигналы. Особым местом будет только дать сигнал на несколько лазерных выстрелов из-либоИстощение образца / растворной смеси или характеристик кристалла.- Переместите лазер в различных областях цели при приобретении и в среднем около 200 случайных спектров для получения удовлетворительного соотношения сигнал-шум.
- Депозит aqueoмы олигосахарид (родной) образцы (5-10 мкг) (W-золь и / или KOH-золь) на в MALDI-целевой пластины. Добавить 0,3 мкл раствора MALDI-матрицы с использованием отдельного наконечника и перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Дайте смеси высохнуть при комнатной температуре.
5. ESI-MS-QTOF
- Анализ эндоксиланазой генерируемых олигосахариды (родной) с использованием нано-ВЭЖХ в сочетании с ионизацией электрораспылением (ESI) квадрупольный время пролета (QTOF) MS инструмент с онлайн хроматографического использованием RP колонка С-18 (75 мкм х 150 мм; 3,5 мкм шарик размер).
- Передача эндоксиланазой сгенерированных водные олигосахариды смесь во флакон и помещают в автосэмплера ВЭЖХ. Предварительно запрограммируйте градиент элюции 5-80% с подвижной фазы 0,1% (об / об) муравьиной кислоты в воде и 0,1% (об / об) муравьиной кислоты в ацетонитриле, соответственно, в течение 60 мин.
- Регулировка скорости потока до 0,2 мкл / мин. Настройка режима положительных ионов в диапазоне сканированияиз 300-1,600 т / г и сканирующим скоростью 0,5 сканирований / сек с использованием условий ESI источника следующим образом : Занавес газ 10, GS1 4, температура источника 100 ° С, с ионным распылением напряжение 2300 В, и де-кластеризация потенциал 50 V. Запустите программу LC хроматографического и элюции олигосахаридов. Полученная общая ионная хроматограмма (TIC) сохраняется автоматически с помощью программного обеспечения.
- Откройте сохраненный TIC и выберите хроматограмму экстракта. Введите ожидаемые массы (например, 271, 403, 535, 667, 799 и 931 м / г) в командной строке. Сканирование хроматограмму, нажав Enter. Процесс выбранных ионов сканы данных хроматограммы ESI-MS QTOF с использованием программного обеспечения в соответствии с инструкциями 14 изготовителя.
6. ESI-МС п
- Вставка 1 до 2 мкл на-O-метилированных олигосахаридов (метилированный , как описано Pettolino и др. 1) образца в 50% ацетонитрила в наконечнике микросфер с использованием шприца. Отделкакончик нано-спрей, используя стеклорез, чтобы вписаться в дискретном держатель нано-спрей, прикрепленной к MS.
- Установите массу в соответствии с ожидаемым диапазоном масс (200-1,500 м / г) и занавеской газа до 10, ionspray напряжения на 1,900 V и полярности к положительной.
- Нажмите кнопку , чтобы открыть сбора по релевантного окна, введите имя файла данных для получения общего ионного сканирования (ESI-MS 1). Затем нажмите кнопку STOP.
- Изменение типа сканирования из иона продукта фрагментировать пик интереса. Введите массу интерес (например, 885 м / г) , чтобы фрагментировать и регулировать диапазон масс (200-900 м / з). Нажмите кнопку получения и регулировки энергии столкновения (вверх и / или вниз на вкладке соединения) для достижения всей фрагментации родительского иона (885 м / г) и приобрести ионный фрагмент сканирования (ESI-MS 2).
- Ввод массы фрагмента иона интерес (например, 711 м / г) и регулировать диапазон масс (200-720 м / г). Нажмите кнопку Приобретатьd регулировать энергию удара , чтобы достичь всего фрагментации иона - предшественника (711 м / г) и приобретают ионный фрагмент сканирования (ESI-MS 3).
7. H 1 ЯМР - спектроскопия
- Растворите эндоксиланазой генерироваться смесь олигосахаридов (КОН-золь, нативной форме) (~ 500 мкг) в D 2 O (1,0 мл, 99,9%) в пластиковую пробирку (15 мл). Замораживание суспензии при -80 ° С в течение 4 ч и сухой замороженный приостановку в сублимационной сушилке для восстановления ксило-олигосахариды.
- Повторите 7.1 дважды, чтобы полностью обменять H 2 O с D 2 O.
- Растворите высушенных олигосахариды в D 2 O (0,6 мл, 99,9%) и добавьте 0,5 мкл ацетона (5% в D 2 O) в качестве внутреннего стандарта. Передача дейтерированных олигосахариды в ЯМР пробирку.
- Держите ЯМР пробирку, содержащую образец с верхней и вставьте пробирку с пробой в пластиковом блесны. Поместите вертушку в глубине образца датчика. Гнойч или тянуть пробирку, чтобы регулировать глубину образца, чтобы гарантировать, что центральная линия верхней и нижней образца глубиномеры равны.
- Извлеките глубиномер и вставить образец в автосамплера, прикрепленного к 600 МГц ЯМР-спектрометре, снабженном крио-зондом.
- Логин и открытое программное обеспечение управления спектрометром. Введите имя файла образца. Откройте существующий набор данных, а затем использовать команду "EDC", чтобы сохранить его под новым именем. Введите номер позиции образца в автоматическом пробоотборнике и нажмите "ENTER".
Примечание: при нажатии кнопки "ENTER" сбросит пробирку осторожно, чтобы отверстие магнита, где оно будет расположено в верхней части зонда. - Установите желаемую температуру образца, набрав "edte" в командной строке. Подождите, пока температура образца достигнет желаемого значения, прежде чем перейти к следующему шагу. Введите "замок" в командной строке и выбрать соответствующий растворитель (D 2 O). Подождите, & #34; блокировка готовой "сообщение появится в нижней части окна.
- Введите "atmm" в командной строке и нажмите кнопку "Оптимизировать" в верхней части строки меню atmm. Выберите Пуск для настройки и согласования датчика для выбранного канала (1 H в данном случае).
- Введите "topshim" в командной строке для процесса подкладок, в котором незначительные корректировки для магнитного поля до однородного магнитного поля не будет достигнуто вокруг sample.Acquire сигнал, набрав "ZG" в командной строке и введите.
- Анализ спектров с использованием программного обеспечения 15 в соответствии с инструкциями изготовителя с 1 H химического сдвига , отнесенная к внутреннему стандарту ацетона при 2.225 частей на миллион.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Эндоксиланазой переваривание 2ab меченных W-золь AXS производит смесь 2ab меченных RE олигосахариды и ряд не-меченый (без этикетки 2ab) олигосахаридов , полученных из внутренних областей ксилана цепи (рис 1, из Ратнаяке и др. 2). Ряд хроматографических подходов затем используют для фракционирования сложную смесь изомеров. И, наконец, методы MS используются для идентификации изомерных структур, которые затем секвенировали с помощью MS н мето...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Большинство фазы матрицы полисахаридами клеточной стенки имеют по- видимому случайным образом замещенные основные цепи (с обоими гликозильная и не Гликозильные остатков) , которые сильно варьируют в зависимости от вида растений, стадии развития и типа ткани 3. Поскольку полисахаридами являются вторичными генные продукты их последовательность не шаблона: происходит и нет, поэтому ни один аналитический подход, например, существует для нуклеиновых кислот и белков, их последовательности. Наличие очищенных рычажну...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нам нечего раскрывать.
Благодарности
Этот проект был поддержан за счет средств Флагманской программы совместных исследований Организации Содружества по научным и исследовательским исследованиям, предоставленных кластеру зерен с высоким содержанием клетчатки через флагман Food Futures. AB также выражает признательность за поддержку гранта Австралийского исследовательского совета (ARC) Центру передового опыта ARC в области клеточных стенок растений (CE110001007).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 2 аминобензамид (2AB) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | A89804 | |
| боргидрид натрия (NaBH4) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 247677 | Опасно, обращайтесь с осторожностью |
| цианоборогидрид натрия (NaBH3CN) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com | )156159 | Опасно, обращайтесь с осторожностью |
| endo-1,4-β-Xylanase M1 (из Trichoderma viride) (120101a) | Megazyme (www.megazyme.com) | E-XYTR1 | |
| Deuterium Oxide (D2O) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 151882 | |
| Сублимационная сушилка (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus) | |||
| RP C18 Zorbax eclipse plus column | Agilent | (в 2,1 раза; 100 мм; 1.8 & микро; m размер борта) | |
| MicroFlex MALDI-TOF MS (модель - MicroFlex LR) | (Bruker Daltonics, Германия) | ||
| (ESI) -(QTOF) MS (Модель # 6520) | (Agilent, Пало-Альто, Калифорния ) | ||
| ESI-MSn - ионная ловушка (Модель # 1100 HCT) | (Agilent, Пало-Альто, Калифорния). | ||
| Bruker Avance III 600 МГц -ЯМР | Bruker Daltonics, Германия | ||
| Topspin (версия 3.0)-Программное обеспечение Biospin | Bruker | ||
| GC-MS (модель # 7890B) | Agilent |
Ссылки
- Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B., Bacic, A. Determining the polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. 7, 1590-1607 (2012).
- Ratnayake, S., Beahan, C. T., Callahan, D. L., Bacic, A. The reducing end sequence of wheat endosperm cell wall arabinoxylans. Carbohydr. Res. 386, 23-32 (2014).
- Bacic, A., Harris, P. J., Stone, B. A. The Biochemistry of Plants, Vol. 14, Carbohydrates. Preiss, J. 14, Academic Press. San Diego. 297-371 (1988).
- York, W. S., O'Neill, M. A. Biochemical control of xylan biosynthesis - which end is up? Plant Biol. 11, 258-265 (2008).
- Fincher, G. B. Revolutionary times in our understanding of cell wall biosynthesis and remodeling in the grasses. Plant Physiol. 149, 27-37 (2009).
- Faik, A. Xylan Biosynthesis: News from the Grass. Plant Physiol. 153, 396-402 (2010).
- Scheller, H. V., Ulskov, P. Hemicelluloses. Annu. Rev. Plant Biol. 61, 263-289 (2010).
- Bacic, A., Stone, B. A (1→3)- and (1→4)-linked β-D-glucan in the endosperm cell-wall of wheat. Carbohydr. Res. 82 (13), 372-377 (1980).
- Comino, P., Collins, H., Lahnstein, J., Beahan, C., Gidley, M. J. Characterisation of soluble and insoluble cell wall fractions from rye, wheat and hull-less barley endosperm flours. Food Hydrocolloids. 41, 219-226 (2014).
- Pena, M. J., et al. Arabidopsis irregular xylem8 and irregular xylem9: Implicationsfor the Complexity of Glucuronoxylan Biosynthesis. Plant Cell. 19, 549-563 (2007).
- Andersson, S. I., Samuelson, O., Ishihara, M., Shimizu, K. Structure of the reducing end-groups in Spruce xylan. Carbohydr. Res. 111, 283-288 (1983).
- Mazumder, K., York, W. S. Structural analysis of arabinoxylans isolated from ball-milled switchgrass biomass. Carbohydr. Res. 345, 2183-2193 (2010).
- Kulkarni, A. R., et al. The ability of land plants to synthesize glucuronoxylans predates the evolution of tracheophytes. Glycobiol. 22 (2012), 439-451 (2012).
- Agilent MassHunter Workstation Software - Quantitative Analysis Familiarization Guide. , Agilent Technologies. Available from: http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G3335_90061_Quant_Familiarization-EN.pdf (2010).
- Topspin User Manual. , Bruker. Available from: http://www.nmr.ucdavis.edu/docs/user_manual_topspin_ts30.pdf (2010).
- Domon, B., Costello, C. E. A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentation in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates. Glycoconjugate. J. 5, 397-409 (1988).
- Hoffmann, R. A., Leeflang, B. R., De Barse, M. M. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. Characterisation by 1H-n.m.r. spectroscopy of oligosaccharides, derived from arabinoxylans of white endosperm of wheat, that contain the elements ----4)[alpha-L-Araf-(1----3)]-beta-D-Xylp-(1---- or ----4)[alpha- L-Araf-(1----2)][alpha-L-Araf-(1----3)]-beta-D-Xylp-(1----. Carbohydr. Res. 221, 63-81 (1991).
- Gruppen, H., Hoffmann, R. A., Kormelink, F. J. M., Voragen, A. G. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. Characterisation by 1H NMR spectroscopy of enzymically derived oligosaccharides from alkali-extractable wheat-flour arabinoxylan. Carbohydr. Res. 233, 45-64 (1992).
- Kosik, O., Bromley, J. R., Busse-Wicher, M., Zhang, Z., Dupree, P. Studies of enzymatic cleavage of cellulose using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE). Methods Enzymol. 510, 51-67 (2012).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
