Методическая статья

Корковая актин расхода в Т-клетках количественно пространственно-временной корреляционной спектроскопии Изображение структурированных данных микроскопии Освещение

DOI:

10.3791/53749

⸱

17 декабря 2015 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physics and Randall Division of Cell and Molecular Biophysics, King's College London, 2Academic Department of Rheumatology, Centre for Molecular and Cellular Biology of Inflammation, Division of Immunology, Infection and Inflammatory Disease, King's College London, 3ARC Centre for Advanced Molecular Imaging, Australian Centre for NanoMedicine, University of New South Wales Australia, 4Departments of Chemistry and Physic, McGill University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для исследования скоростей потока и направленности нитевидного актина в иммунологическом синапсе Т-клеток, визуализация живых клеток сверхвысокого разрешения сочетается с флуоресценцией полного внутреннего отражения и количественно оценивается с помощью спектроскопии пространственно-временного корреляционного изображения.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нитчатых актина играет решающую роль в большинстве клеточных процессов, включая моторику и, в иммунных клетках, формирование ключа взаимодействия клетка-клетка, известного как иммунологического синапса. F-актина также предположил, чтобы играть роль в регулировании распределения молекулярных на мембране клеток, включая суб-перепончатая динамики пузырька и белка кластеризации. В то время как стандартные методы световой микроскоп позволяют обобщенные и дифракционной наблюдения должны быть сделаны, многие клеточные и молекулярные события, включая кластеризации и молекулярного потока происходят в популяциях в длину масштабах намного ниже разрешающей способности стандартных световой микроскопии. Комбинируя общую флуоресценцию внутреннего отражения с разрешающей способностью супер метод структурированной подсветки микроскопии, двумерный молекулярная поток F-актина в иммунной синапса Т-клеток был записан. Пространственно-временная корреляция изображений спектроскопия (Stics), то применялась, который генерирует количественному РЕЗУЛЬТАТОВTS в виде гистограмм скорости и векторных карт, представляющих направленность потока и величины. Этот протокол описывает комбинацию изображений и Stics методов супер-разрешением, чтобы генерировать векторы движения на уровне суб-дифракционных подробно. Этот метод был использован для подтверждения, что поток актина симметрично ретроградной и центростремительных всей периферии Т-клеток при образовании синапсов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цель эксперимента состоит в изображении и характеризуют молекулярный поток filamentous- (F-) актина в живых Т-клеток, за пределом дифракции для установления направления потока и величину во иммунологического синапса (IS) образование. Эта техника будет осуществляться с использованием структурированного освещения микроскопа (SIM) в полного внутреннего отражения флуоресценции (TIRF) режиме, визуализации Jurkat Т-клетки, образующие искусственную синапс на покровные активации, покрытых анти-CD3- и анти-CD28 антител. ИС формы между Т-клетке и ее цели; антигенпрезентирующей клетки (АРС) при Т-клеточный рецептор (TCR) активации 1,2. Как это первый шаг в определении, создает ли адаптивной иммунной системы иммунного ответа на инфекцию, последствия неправильного реагирования на раздражители могут вызвать ряд заболеваний. Важность взаимодействия Т-клеток-APC хорошо документирована, однако, роль (ы) зрелого после первоначального TCR сигнал интернализация еще предстоит в полной мере понять.

Как цитоскелета, как полагают, помочь два процесса, связанных с TCR активации (движения молекул на плазматической мембране и контроля сигнальных молекул, зависящие от актина цитоскелета 3,4), понимание того, как цитоскелет перестраивается во времени и пространстве будет выяснить шаги молекулярной реорганизации в процессе формирования синапсов. Ретроградное поток F-актина, как полагают, загон TCR кластеров к центру иммунологического синапса, это перемещение, как полагают, важны для прекращения и утилизации сигнала; помогая прекрасный баланс активации Т-клеток 5.

В то время как стандартная флуоресцентная микроскопия представляет собой гибкий инструмент, который продолжает оказывать представление о многих биологических событий, включая межклеточных взаимодействий, она ограничена способность системы точно решить несколько флуорофоры проживающих ближе, чем diffrПредел действие (≈200 нм) друг от друга. Как и многие молекулярные события в клетках включать плотные популяции молекул и проявляют динамическую перестройку или в неподвижности или по специфической стимуляции, обычный световой микроскопии не обеспечивает полную картину.

Использование изображений сверхвысокого разрешения позволило исследователям, чтобы обойти дифракционный предел, используя различные методы. Локализация одной молекулы микроскопии (SMLM), такие как ладонь и STORM 6,7 имеет возможность разрешить расположение молекул до точности около 20 нм, однако, эти методы опираются на долгие времена приобретения, создания образа в течение многих кадров , Как правило, это требует образцы, которые фиксированные или структуры, проявляют низкую мобильность так одиночные флуорофоры не неверно истолкованы как нескольких точек. В то время как истощение стимулировали выбросов (STED) изображения позволяет супер-разрешение через очень селективного возбуждения конфокальной 8, требуется сканированияПодход может быть медленным в течение целых клеток, полей зрения. STED также демонстрирует значительный фототоксичность для более высоких разрешениях в связи с увеличением мощности обеднения пучка.

Структурированная подсветка микроскопии (SIM-9) обеспечивает альтернативу этим методам, способных удвоения разрешение стандартного флуоресцентного микроскопа и более совместим с живой клетки визуализации, чем современные методы SMLM. Он использует нижних лазерных полномочия, в системе широкого поля для цельноклеточных полей зрения; обеспечивая повышенную скорость приобретения, и совместим со стандартным флуорофора маркировки. Широкий поля природа SIM также позволяет использование полного внутреннего отражения флуоресценции (TIRF) для высоко селективного возбуждения, с глубины проникновения в осевой размер <100 нм.

Корреляция изображения спектроскопии (ИКС) представляет собой метод корреляции флуктуации интенсивности флуоресценции. Эволюция ICS; Пространственно-временная имвозраст корреляционная спектроскопия (Stics 10) коррелирует внутриклеточные сигналы в люминесцентных времени и пространстве. Соотнося интенсивности пикселов с окружающих пикселей в отстающих кадров с помощью функции корреляции, информация о получила скоростей потока и направленности. Для обеспечения статические объекты не мешают анализу Stics, неподвижный объект фильтр реализован, который работает путем вычитания скользящей средней интенсивностей пикселей.

Методика представлена ​​здесь, как полагают, первой демонстрацией изображения корреляционной спектроскопии применяется к данным микроскопии сверхвысокого разрешения для количественного определения молекулярного потока в живых клетках 11. Этот метод улучшает дифракционной томографии F-актина потока через Stics анализа 12 и подойдет исследователей, которые хотят, чтобы определить двумерную молекулярного потока в живых клетках, из данных, полученных в пространственным разрешением пределами дифракционного предела света.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: Этапы 1 и 2 имеют место до дня томографии; убедитесь, что все средства массовой информации и добавки, которые будут использоваться до или в день визуализации уравновешивают. Уравновешивание достигается за счет потепления носителей и добавок до 37 ° С в инкубаторе установлен в 5% СО 2. Все этапы работы клеточной культуры и покровное обшивки состоится в стерильных условиях под капотом ламинарного потока.

1. трансфекции клеток

  1. Трансфекции Т-клеток, чтобы быть отображены 24 ч до начала эксперимента с плазмидой, кодирующей флуоресцентный слитая конструкция для F-актина маркировки GFP и визуализации. Примечание: Клетки должны быть разделены 24 ч до трансфекции (48 ч до обработки изображений), чтобы обеспечить клетки в здоровье и оптимального их логарифмической фазе роста.
    1. Поместите по 5 мл RPMI (RPMI дополнение 1640 плюс 10% FBS и 1% Pen-Strep (необязательно)) В одном лунку 6-луночного планшета в инкубатор для уравновешивания.
    2. Гранул 2 х 10 7 клеток культ Tряться при 37 ° С +5% СО 2 в RPMI дополнение использованием центрифужной пробирке на 327 мкг в течение 5 мин и мыть в равном объеме подогретого электропорации сред. Примечание: Электропорация среда является уменьшается средний сыворотка, содержащая буферы и добавки (см расходные).
    3. После повторного осаждения при температуре 327 х г в течение 5 мин, ресуспендирования клеток в 500 мкл электропорации сред и медленно добавить в кювету, добавляют 5 мкг плазмиды в ПЦР класса дН 2 O для маркировки F-актина.
    4. Аккуратно нажмите кювету на капот рабочей обеспечить удаление любых воздушных пузырьков в средствах массовой информации, которые могут вызвать искрение электричества и распределяют клетки равномерно в течение средствах массовой информации.
    5. Включите электропорации аппарата и установите напряжение до 300 В и емкостью до 290 Ом. Электропорации образец с использованием экспоненциального распада в течение 20 мс. Примечание: Оптимизация может потребоваться для различных клеток и различных плазмидные конструкции.
    6. После того, как протокол трансфекциикомплектующие, магазин клетки на льду в течение 1 мин, прежде чем продолжить.
    7. Тщательно передачи клетки из кюветы в 6-луночный планшет, содержащий 5 мл уравновешенной RPMI добавки с шага 1.1.1.
    8. Инкубируйте клетки O / N на 37 ° C ± 5% CO 2.

2. Пальто Покровные и Pre-теплый изображений Дополнение

  1. Coat покровные с антителами, чтобы вызвать возбуждение T клеток.
    1. Пальто каждая камера 8-а покровного с 1 мкг / мл αCD3 и αCD28 в 200 мкл PBS.
    2. Хранить при 4 ° CO / N. Кроме того, пальто покровные 2 ч до обработки изображений и держать в инкубаторе при 37 ° С, чтобы уменьшить дрейф в процессе визуализации путем минимизации изменения температуры до покровного стекла.
  2. Создайте тестовый образец с покровное 0,1 мкм суб-дифракционных люминесцентных микросфер.
    1. Вихрь раствор из бисера, чтобы избежать скопления.
    2. На новом, чистом покровного из йе же типа, как те, которые используются на этапе 2.1.1, пипетки 5 мкл флуоресцентного микросфер раствора на поверхность (в соответствии с инструкциями завода-изготовителя).
    3. Распространение микросфер раствор на покровное с кончика пипетки.
    4. Дайте высохнуть, а затем применить 200 мкл монтажные среды, такой как PBS.
      Примечание: монтажная среда должна соответствовать используемому для образцов изображений клеток.
  3. Равновесие HBSS (+ 20 мМ HEPES, здесь и далее называемый "HBSS добавка ') в центрифужную пробирку путем размещения в инкубаторе предварительно теплой O / N в 37 ° C до + 5% CO 2.
    Примечание: добавление HEPES является буфер СО 2, при использовании инкубационный камеру с СО 2 входа пропустить этот добавок.

3. Микроскоп Настройка

  1. Включите этап-топ инкубатора TIRF-SIM микроскопа и место достаточно дистиллированной воды в водохранилище микроскопом, чтобы полностью покрыть основание нагревательного элемента. Позвольте воде электроннойquilibrate до 37 ° C. Добавить нагревательный воротник объектива, установленного также до 37 ° C.
    Примечание: Из-за чувствительности настройки, эти шаги делаются в ночь перед таким образом оптические компоненты находятся на стабильной температурой до визуализации.
  2. Поместите TIRF 488 совместимый блок решетки на пути света микроскоп и закрепите на месте.
    1. Переключитесь в режим канала и оптического кабеля в положение "Единой" на этапе лазерного микроскопа постель и, соответственно, участвовать правильный путь для оптического режиме TIRF-SIM. Примечание: Пропуск этот шаг приведет к ошибке (рис 1А) в окне программного обеспечения.
  3. Включите все микроскопов и компьютерных компонентов и откройте программное обеспечение управления приобретением.
    1. Откройте панель OC, Ti Pad, N-SIM-Pad и Н. Д. Приобретение окна (рис 1B). В «Панели OC" выберите опцию "TIRF 488" (2В, желтая стрелка).
    2. В окне N-SIM-Pad, выберите "TIRF-SIM" и "Перемещение" настройки (Рисунок 2C, желтые стрелки). Выберите кнопку настройки (Рисунок 1С, квадрат желтого цвета) и выберите пункт "TIRF 488 (для 100x TIRF 488nm)" из выпадающего меню, нажмите «Применить» и «ОК».
    3. Установите параметры камеры в "настройки" в DU897: Frame Rate 50 мс, в режиме считывания, Е. М. Усиление 3 МГц в 14-битном, Е. М. Усиление множитель 300 с конверсии усиления 1 (рис 1С, зеленой корзины).
      Примечание: см Представитель результаты соображений частоты кадров.
    4. Калибровка освещение микроскопа для TIRF-SIM, выбрав 100x 1,49 Н.А. CFI Apochromat TIRF цели, на 'N-SIM Pad' повернуть мощности лазера 488 нм до 10%.
      Примечание: Размер пикселя из исходных изображений 60 нм, с полем 512 х 512 пикселей зрения.
    5. Очистите объектив с помощью объектива ткань для удаления пыли и масла.
  4. Найти фокальной плоскости TIRF-SIM.
    1. Начните с целью в максимально низкой г-плоскости. Поместите каплю масла на линзы объектива и добавить флуоресцентного образца микросфер с шага 2.2 в стадии микроскопа.
    2. Выбор функции идеального фокуса системы (PFS), расположенную на корпусе микроскопа.
    3. Медленно перемещайте цели через г-плоскости, пока кнопка ВБП не перестанет мигать для подтверждения фокальной плоскости была достигнута.
    4. Переключитесь на "Live" видом на программное обеспечение управления и изображения микросфер для окончательной корректировки, сделанные с помощью PFS-манипулятор микро колесо.
  5. Соблюдайте равномерное освещение, не из фокуса флуоресценции выше 75 нм исчезающего волны.
    Примечание: Убедитесь, структурированный освещение выполнено с соблюдением флуктуирующую образца подсветки от флуоресцентного образца микросфер.
  6. Измерьте флуоресцентный образец микросфер и количественно улучшенную resolut изображенийионная наблюдая полная ширина на половине максимума (FWHM) профиля интенсивности.
    1. Откройте Analyze программное обеспечение (v4.20.01), с помощью модуля НИС-н-SIM-анализа установлено и выберите "Приложения" -> "Показать Н-SIM окно".
    2. С отличие освещение модуляции (IMC) и подавления шума с высоким разрешением (HRNS) установлен в 1 для TIRF-SIM наборов данных (рисунок 2), реконструировать изображение образца микросфер для создания реконструированного изображения 1024 х 1,024 пикселей с размером пикселя 30 нм.
    3. Используя инструмент линии профиля шириной в 1 пиксель (рис 3А, желтый ящик), нарисуйте линию через центр одного микросферы.
    4. Выберите кнопку FWHM (рис 3B, квадрат желтого цвета) и нажмите на интенсивности максимумов распределения Гаусса, с последующим его интенсивности минимумов.
    5. Подтверждение полуширина микросферы в диапазоне от 100 нм (рис 3C). Примечание: разрешение ACHieved при визуализации биологических образцов будет варьироваться в зависимости от сигнала к шуму от эффективности мечения и фоновой флуоресценции.

4. Подготовка проб для визуализации

  1. Покровное подготовка.
    1. Получить покровное αCD покрытием с шага 2.1 из холодильника или инкубатора и удалить PBS, содержащий αCD3 и αCD28 из каждой лунки.
    2. Добавить 200 мкл подогретого HBSS дополнения, начиная с шага 2.3 в каждую лунку покровного стекла. Вымойте и удалить, чтобы обеспечить минимальное αCD3 и αCD28 осталось в растворе. Добавить еще 200 мкл HBSS дополнение к покровное скважин.
    3. Очистите нижнюю часть покровного с объективом ткани для удаления нефти и твердых частиц.
  2. Положение покровное на столик микроскопа и найти фокальной плоскости TIRF покровного стекла с помощью PFS плоскость г, как найден на этапе 3.4.
  3. Подготовка сотовый.
    1. Внесите 200 мкл СМИ Conсодержащие трансфекции клеток с шага 1.1.8 в микро-центрифуги трубы.
    2. Гранул клетки в микро-центрифуге при 268 мкг в течение 20 сек и удаления клеточных сред.
    3. Ресуспендируют клеток в 200 мкл подогретого HBSS дополнение с шага 2.3.

5. Клетки визуализации

  1. Возьмем клеток HBSS, содержащего добавку к микроскопу и осторожно пипеткой 200 мкл в одну из лунок.
  2. Оставаясь в фокальной плоскости TIRF на покровное (в режиме PFS), используйте окуляр микроскопов и эпифлуоресцентной освещение для отслеживания флуоресцентные клетки, приближающиеся покровное.
  3. После того, как клетки приземлиться на покровное, переключитесь на "Live" режиме в N-SIM Pad довести изображение на мониторе и проверить клетки находятся в фокусе на экране компьютера.
  4. Для записи тайм-курсы, откройте окно Н.Д. приобретения и выберите вкладку "Время", нажмите кнопку "Добавить" и установите "Интервал", чтобы без задержки, "Продолжительность"до 10 мин, 'Петли' установлен в 1.
    Примечание: Длительность можно изменить в зависимости от процесса интерес; программное обеспечение Stics можно извлечь количественные результаты с изображения штабеля ≈ 10 кадров при захватили с 'без задержки ".
  5. С одинаковыми настройками сбора к образцу борта, начать запись данных, выбрав "Выполнить сейчас" в окне Н.Д. приобретения.

6. Реконструкция SIM Изображения

  1. После завершения визуализации, откройте Analyze программное обеспечение (v4.20.01), с помощью модуля НИС-н-SIM-анализа установлено и выберите "Приложения" -> "Показать Н-SIM окно".
  2. С отличие освещение модуляции (IMC) и подавления шума с высоким разрешением (HRNS) установлен в 1 для TIRF-SIM наборов данных (рис 2), реконструировать один (или несколько с помощью Batch Tool) сырой SIM-файла, чтобы произвести реконструированное изображение SIM.
  3. Подтвердите реконструированный файл имеет размер пикселя 30 нм, указанный вСтрока состояния изображения.
    Примечание: Размер пикселя не влияет анализ Stics но она должна быть по крайней мере, 2x меньше размера, чем ФСФ ​​пространственным разрешением, чтобы обеспечить пространственную корреляцию между пикселями.
  4. Экспорт данных в файлы .tiff, готовых для анализа Stics.

7. Анализ Stics

  1. Скачать и извлечь STIC (C) S программный пакет Matlab (Wiseman лабораторию и доступен в качестве дополнительной информации). Сценарий stics_vectormapping.m является ядром одного анализа каналов Stics и первые 30 строк кода используется для определения входных параметров, как определено в разделе 2.1 данного руководства. Откройте этот сценарий и определить входные параметры для анализа данных TIRF-SIM. Он предложил также добавить STIC (С) S папку с вложенных папок в локальной машины Matlab пути, как описано в приложении к руководству.
    1. Определить входные параметры для анализа данных по редактирования соответствующие строки кода
    2. Для выполнения анализис данных TIRF-SIM для создания 1 векторную карту, установить временные параметры на временную субрегиона в строке 31 до максимального числа кадров и временного сдвига в соответствии с 32 1. Для получения временной ряд векторных карт различаются эти параметры ,
    3. Для неподвижных фильтр удаления, установите параметр "фильтрации" (линия 23) на "Скользящее среднее" и установите параметр 'MoveAverage »(строка 24) до 21.
      Примечание: Этот параметр, как было показано, чтобы работать на более медленном перемещении и больших сигналов флуоресценции, так как она основана на вычитании серийные кадры из кадра анализируются.
    4. Изменить линии 33-38, чтобы установить имя выходных файлов и названий выходных векторных карт, а также путь к каталогу вывода и определить, в каком формате векторной карте изображения должны быть сохранены.
Размер пикселя (мкм) 0.03 мкм Строка 19
Частота кадров (сек) 1 сек Строка 20
Максимальное время задержки (кадры) 20 кадров Линия 21
Размер субрегиона (пикселей) 8 пикселей Линия 29
Расстояние субрегиона (пикселей) 1 пиксель Строка 30
  1. Откройте сценарий run1ChannelSTICS в окне Matlab редактора. Загрузите изображения с помощью серии Запуск линии 1-23 этого сценария.
    Примечание: Этот сценарий может быть использован для загрузки и предварительная обработка серии изображений, построить векторные карты и скорость гистограммы и запустить пакетную обработку для многих файлов. При необходимости, обрезать изображения в интересующей области с помощью линии 24-26 этого сценария.
    1. Запуск линии 29-35 из run1ChannelSTICS начать анализ Stics. При появлении запроса выберите полигон, чтобы указать конкретную область процентной (ROI), если это необходимо. Убедитесь, что рентабельность не совпадать с краю ячейки, а происходят граничные артефакты, когда Stics анализирует эти ререгионов.
    2. Запуск линии 38-52, чтобы отобразить вектор карты. Для построения гистограммы скорость величину, запустите линии 53-72.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Настройки Микроскоп

После успешного достижения все шаги исследователь добились структурированы освещение (SIM) визуализации F-актина потока в ячейке синапса T (Видео 1), и количественно этот молекулярного потока по пространственно-временной корреляции изображений спектроскопии (рис 4 11). Перед началом записи изображения, убедитесь, что освещение образца равномерным по всей девяти необработанных изо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот метод позволит исследователям изображения и количественно ранее неразрешимые детали в клетках, экспрессирующих флуоресценции. В наших результатов мы показываем, что F-актин потоков в симметричной моды из клеточной периферии к центру клетки в клетки Т. Эти данные согласуются с предыдущими результатами 1D линии данных профиля кимографе 13 и расширить возможности анализа данных 2D и супер-разрешением.

Представленная методика является переход от кимографа изображений, которая огр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.M.O. признает грант Европейского исследовательского совета No 337187 и грант Марии-Кюри на интеграцию карьеры No 334303. P.W.W. признает программу грантов на открытие Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>Расходные материалы:
Jurkat E6.1 элементыAPCCATTC TIB-152
RPMILife Technologies21875-091
FBSSigmaF7524-500ML
Пенициллин-стрепромицин Life Technologies15140-122
HBSS  Life Technologies14025-050
HEPESLife Technologies15630-056
#1.5 8-луночные покровные стекла LabtekNUNC, Labtek155409
LifeAct GFP constructIbidi60101
OptiMemLife Technologies51985-042
anti-CD3Cambridge Bioscience317315
anti-CD28BD Bioscience / Insight Biotechnology555725
PBSLife Technologies20012-019
Lens oil
NameCompanyНомер в каталогеКомментарии
Оборудование:
Gene Pulsar Xcell SystemBioRad165-2660
Кювета (0,4 см)BioRad165-2088
(5810R)Eppendorf 5805 000.327
Центрифуга (Heraeus)Biofuge pico75003235
6-луночный планшетCorning3516
Топовый инкубаторTokai HitINUH-TIZSH
Nikon N-SIM микроскоп Nikon ContactкомпанияNikon
Программное обеспечение для анализа Nikon Контактное программное обеспечениеNikonContact компания
Инкубатор ( 190D)LEECКонтактная компания
Центрифуга

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
  2. Lanzavecchia, A. Antigen-specific interaction between T and B cells. Nature. 314, 537-539 (1985).
  3. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
  4. Delon, J., Bercovici, N., Liblau, R. Imaging antigen recognition by naive CD4+ T cells: compulsory cytoskeletal alterations for the triggering of an intracellular calcium response. European journal of Immunology. 28 (2), 716-729 (1998).
  5. Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
  6. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3, 793-796 (2006).
  7. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  8. Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (15), 8206-8210 (2000).
  9. Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
  10. Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophysical Journal. 88 (5), 3601-3614 (2005).
  11. Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. Molecular Flow Quantified beyond the Diffraction Limit by Spatiotemporal Image Correlation of Structured Illumination Microscopy Data. Biophysical Journal. 107 (9), 21-23 (2014).
  12. Brown, C. M., et al. Probing the integrin-actin linkage using high-resolution protein velocity mapping. Journal of Cell Science. 19 (24), 5204-5214 (2006).
  13. Yi, J., Xufeng, S. W., Crites, T., Hammer, J. A. Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).
  14. Watanabe, N., Mitchison, T. J. Single-molecule speckle analysis of actin filament turnover in lamellipodia. Science. 8 (5557), 1083-1086 (2002).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

F

Похожие статьи