Миелоидный Выделение клеток из кожи мышей и Слив лимфатического узла После внутрикожной иммунизации с живой аттенуированной Plasmodium Спорозоиты

Малярия является одной из самых опасных инфекционных заболеваний в мире погибло более полумиллиона человек в год. Инфекция Plasmodium, возбудителя заболевания, начинается с фазы преэритроцитарных (PE). Во время этой фазы, спорозоиты впрыскивается в принимающей коже самкой малярийного комара достигают печени через кровь и дифференцировать внутри гепатоцитов в формы паразитов , которые инфицируют красные кровяные клетки и вызывают симптомы заболевания.

Стадии ПЭ плазмодия представляют собой привилегированный мишень для вакцинации против малярии. Действительно, живые ослабленные вакцины против этих стадий, таких как радиация ослабляется спорозоитов (RAS), генетически арестованные паразиты (GAP) или химиопрофилактики и спорозоиты (СКЗ) продемонстрировали свою способность защищать как от грызунов и человека ^1-9 узлов. В модели с грызунами, большинство исследований по вакцинации проводятся с использованием внутривенного введения иммунизации, Которая является золотым стандартом с точки зрения защитной эффективности. Тем не менее, описание стадии кожи и важность кожи ассоциированного дренирования лимфатического узла (дина) в выявляя защиту изменилось наше восприятие фазы PE и подчеркнул важность внутрикожно инъекции. Прижизненной визуализации P. berghei спорозоиты вводится в кожу грызунов показало , что только ~ 25% посевного материала достигает печени через кровь. Оставшиеся ~ 75% распределяется между проксимальным дина (~ 15%) и кожи (~ 50%) ^10,11, где небольшая часть может трансформировать и остаются живыми в течение нескольких недель в клетках кожи ^12,13. Более того, последующие исследования описано , что создание эффективного защитного иммунитета после внутрикожной иммунизации в основном происходит в коже-дина, где активируются паразит специфические CD8 ⁺ Т - клетки, и лишь незначительно в селезенке или печени-dLNs ^14,15.

В то время какбольшинство исследований сосредоточено на характеристике эффекторных клеток, замешанных в создании защитного иммунного ответа, гораздо меньше известно о судьбе живых ослабленных паразитов, инжектированных в кожу, в особенности их взаимодействия с врожденной иммунной системы. В частности, характеристика антиген-представляющих клеток , участвующих в антигенной паразит поглощения, обработки и представления на CD8 ⁺ Т - клеток , имеет решающее значение, зная , что РЕ приобретение антиген может происходить как в коже и DlN отсеков. Предыдущие исследования прижизненные визуализации описал ранний приток ярко флуоресцентный Lys-GFP - положительных клеток в коже после инфекционного укусе комара ¹⁶ в то время как ранние взаимодействия между спорозоитов и дендритные клетки наблюдались в дина ^10,17. Совсем недавно было сообщено, что спорозоиты засеянные в коже комарами повышает моторику обоих дендритных и регуляторных Т-клеток в кожемышей, в то время как уменьшение количества антиген - представляющих клеток наблюдалась в дина ^18.

Мы стремились выявить и количественно более точно лейкоцитарной подмножества , завербованных в коже и соответствующие дина, а также лица , взаимодействующие с паразитом следующие внутрикожной инъекции иммунизация дозы РАН ^19. В этом контексте, мы выделили миелоидных клеток (CD45 ⁺ CD11b ⁺⁾ из обеих тканей и характеризуется субпопуляции интерес с помощью мульти = параметрической проточной цитометрии. В соответствии с иммунным ответом , описанной в ранней стадии Leishmania основной инфекции кожи ^20, основной ответ хозяин спорозоитов инъекции состоит из последовательного набора полиморфноядерных нейтрофилов (CD45 ⁺ CD11b ⁺ Ly6G ⁺ Ly6C ^INT) с последующим воспалительным моноцитов (CD45 ⁺ CD11b ⁺ Ly6G ^- Ly6C ⁺⁾ , которые определяются на основе differentiаль экспрессия поверхностных маркеров Ly6G и Ly6C.

Здесь мы опишем протокол для выделения миелоидных клеток кожи мыши и дина следующие внутрикожные инъекции иммунизация дозы РАН, выделенных из инфицированных комаров слюнных желез. Воспроизводимые внутрикожные инъекции и обработки тканей являются критически важными шагами, чтобы количественно оценить фенотипические изменения инфильтрации популяции клеток в инфицированных тканях. Подход подробно описаны ниже обеспечивает надежный анализ для оценки кожи и DlN воспалительной реакции на паразита Plasmodium и может быть распространен на различных экспериментальных систем.

Все процедуры были одобрены комитетом Института Пастера и местного комитета по этике по экспериментированию животных (этический комитет IDF-Париж 1, Париж, Франция; Номер договора: 2012-0015) с помощью и осуществляется в соответствии с действующими нормами и правилами.

1. Материалы и реагенты

1. Использование женского Anopheles stephensi москитов (Sda500 деформация) , которые питаются инфицированных мышей через 3-5 дней после появления всходов и задней части , как описано выше ^21.
2. Используйте паразиты Plasmodium berghei АНКА клон , экспрессирующий ген зеленого флуоресцентного белка (GFP) под контролем конститутивного белка теплового шока 70 (HSP70) промотора. Это дает яркую флуоресценцию на протяжении всего жизненного цикла паразита ^22.
3. Использование самок мышей C57BL / 6JRj (7 недель).
   Примечание: Все реагенты , используемые в описанном протоколе перечислены в T , способных материалов / оборудования.

1. Между 18-25 дней после инфекционного крови еды, собирать и холодной обезболить комаров в 15 мл пробирку на льду , как описано выше ^21. Аккуратно перенести их на чашку Петри с помощью переворачивания пробирки. Поддерживать насекомых на льду и подвергать москитов к 12 крад дозы гамма- или рентгеновского облучения.
2. Изолировать ослабленных спорозоитов из облученного комар слюнных желез , как описано выше ^21. Сбор зараженных слюнных желез в небольшом объеме (около 15 мкл) с фосфатным буферным солевым раствором 1x Дульбекко (DPBS) на льду и осторожно раздавить их, чтобы освободить спорозоиты.
   Примечание: Инъекция высококонцентрированной суспензии, паразит в небольшом объеме будучи критическим, следовательно, важно, чтобы собрать достаточное количество слюнных желез из большого количества заранее выбранных хорошо инфицированных комаров, о чем свидетельствует их прочном выражениемзелено-флуоресцентной.
3. Фильтр спорозоитов суспензии через 35 мкм ячейки фильтра защитный колпачок, адаптированного к низкой адгезией 1,5 мл микроцентрифужных трубки с целью устранения комков и москитные мусора.
4. Подсчитать общее количество изолированных спорозоитов , как описано выше ²¹ и регулировать концентрацию паразита суспензией с холодной 1x ДЗФР , чтобы получить 83000 спорозоитов / мкл. Храните паразиты на льду, продолжая следующие шаги.
5. Соберите эквивалентное количество слюнных желез от неинфицированных комаров, которые будут использоваться в качестве отрицательного контроля и обработки образца, как описано в пунктах 2.2 и 2.3. Разбавить образец, как указано выше, чтобы получить аналогичную концентрацию экстрактов слюнных желез в суспензии.
   Примечание: Спорозоиты можно хранить на льду в течение не более 2 часов. Тем не менее, в идеале они впрыскивают в течение часа после дробления слюнных желез.

3. Инъекции спорозоитов в дермальный LaЕр уха

1. Обезболить животных путем внутрибрюшинного введения кетамина (50 мг / кг) / ксилазином (5 мг / кг) смеси. Подождите 5-8 минут для мыши, чтобы находиться в бессознательном состоянии и применять глазной мази для глаз, чтобы предотвратить высыхание роговицы. Оцените глубину анестезии, выполняя нежный носок щепотку на обеих задних ног.
   ПРИМЕЧАНИЕ: доза анестезии длится менее 20 мин, так что следующие шаги должны быть сделано быстро.
2. Стабилизировать уха ушную мыши, зафиксировав вентральной стороной с прозрачной лентой ранее помещенные под стереомикроскопа (Рис . 1А) Слегка нажмите на ухо, чтобы не повредить сосудистую систему.
3. Загрузите 10 мкл шприца / 35 калибра скошенную иглу с 0,6 мкл ресуспендировали паразитов ^10.
4. Deliver спорозоитов подвеска в 4 местах инъекций (0,15 мкл на сайте), осторожно вставляя иглу на спинной стороне уха (рис 1А), под эпидермисом, сконическая вверх, следя за тем, чтобы избежать каких-либо кровеносных сосудов. Разрешить игла остаться в дерме в течение нескольких сек для предотвращения обратного потока инъекционной перед ее извлечением. Отметим , характерную папулы на каждом месте инъекции в конце процедуры (рис 1В и 1С).
5. После инъекции, осторожно снимите ухо с ленты.
6. Вводят контралатеральной ухо с той же дозой паразитов, выполнив действия 3.2-3.4.
7. Вводят 2 дополнительных мышей с либо 0,6 мкл 1х ДЗФР или 0,6 мкл экстракта слюнных желез 1x DPBS + из неинфицированных комаров, чтобы оценить воспалительную реакцию, опосредованную только инъекции и отложением москитной материала в дерме.
8. Монитор восстановления мыши от анестезии перед установкой его обратно в клетку.
   Примечание: Правильное осаждение спорозоитов в коже можно контролировать с помощью флуоресцентной микроскопии (рис 2А и 2В), Мышь готовится , как описано previsously ^23.

4. Кожа и Слив лимфодиссекция

1. Подготовьте стандартную среду (СМ) следующим образом: среда Игла в модификации Дульбекко (DMEM), 25 мМ + 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфонова кислота (HEPES) с добавлением 400 ед / мл коллагеназы и 50 мкг / мл ДНК-аза (ДНКазы) ,
2. Приготовьте два 6 луночные плоскодонные планшеты для тканевых культур на льду с 4,5 мл SM + 70 мкм ячейки фильтра на лунку для проб дина (пластинчатый А) и 4,5 мл SM на лунку для образцов кожи (табл В).
3. В желаемый момент времени после спорозоитов инокуляции, глубоко анестезию мыши путем внутрибрюшинной инъекции кетамина (125 мг / кг) / ксилазином (12,5 мг / кг), смесь перед смещением шейных позвонков. Убедитесь, что мышь демонстрирует признаки клинической смерти и начать рассечение немедленно.
   Примечание: Кинетика набора клеток миелоидного могут быть рассмотрены в разное время после инъекцпрогиб (т.е. 2 ч, 4 ч и 24 ч , как описано выше ^14).
4. Лечить привит ухо и соответствующую область шеи с 70% -ным этанолом, чтобы уменьшить вероятность заражения.
5. Используя стерильные ножницы и пинцет, асептически рассекают проксимального аурикулярных дина без сбора окружающего жира. Выполните первый надрез в jugulo-carotidian борозды и удалить волосы из рабочего поля. Растянуть разрез с 2 пинцетом, чтобы выставить дина, который появляется серовато по сравнению с окружающей тканью.
6. тщательно Pinch соединительной ткани на верхней части дина с щипцами, чтобы облегчить его удаление. Извлеките DlN путем размещения пинцетом под лимфоидной ткани (фиг 3А и 3В). Поместите дина в лунку, содержащую 4,5 мл SM + 70 мкм клеточный фильтр (плиты A).
7. Выловить весь привит ухо с помощью стерильных острыми ножницами и пинцетом (рис 4а). Separсъел спинной и брюшной стороны уха, зажимая и расстояние между ними , кроме разреза заканчивается двумя щипцами (рис 4В - 4e). Поместите их в лунку, содержащую 4,5 мл SM (пластина B) убедившись, что обе ткани полностью погружен в среду.
   Примечание: В целях повышения надежности эксперимента и увеличению числа клеток, представляющих интерес, бассейн 2 впрыскивается уши или 2 dLNs от той же мыши на образец.
8. Урожай и процесс параллельно уши и dLNs мышей, привитых либо 1x ДЗФР или слюнных желез экстрактов. Включите 2 дополнительных образцов уха и лимфатических узлов найденным наивным мыши для отрицательных и отдельных элементов управления компенсации окрашивания.

5. Выделение клеток из лимфатических узлов

1. Выдержите в лимфатические узлы (пластины А) при 37 ° C ± 5% CO ₂ в течение 15 мин при осторожном перемешивании. Добавьте 10 мМ окончательный этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) на лунку для нейтрализации коллагеназы и ДНКазы Actiстей. Выполните следующие шаги на льду.
2. Диссоциируют лимфатических узлов, используя верхний конец поршня шприца 5 мл. Пресс круговыми движениями против сетчатого фильтра, пока все, что остается белой соединительной ткани.
3. Промыть фильтр грубой очистки клеток дважды 500 мкл 1х ДЗФР + 2% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ ЭДТА +. Перенести весь объем скважины в 15 мл пробирку.
4. Промыть скважину в два раза с 500 мкл 1x ДЗФР + 2% FBS + 2 мМ ЭДТА и передавать объем в 15 мл пробирку. Хранить трубы на льду.

6. Выделение клеток из кожи уха

1. Инкубируйте листовки уха (знак B) при температуре 37 ° С ± 5% СО ₂ в течение 1 ч при осторожном перемешивании.
   Примечание: Через 20 мин инкубации, нарезать листки ушные ножницами на мелкие кусочки, чтобы облегчить переваривание тканей и поместить образец обратно в инкубаторе в течение оставшихся 40 мин. Отдельные клетки можно наблюдать в среде в конце инкубационного периода.
2. Добавьте 10 мм Конечная EDTA на лунку для нейтрализации коллагеназы и ДНКазы деятельности. Выполните следующие шаги на льду.
3. Передача фрагментов тканей уха и весь объем среды в новую лунку, содержащую клеточный фильтр 70 мкм с использованием 1мл пипетки. Вырезать 2 до 3 мм от конца наконечника, чтобы собрать осколки уха ткани более легко.
4. Диссоциируют фрагментов тканей уха, используя верхний конец поршня шприца 5 мл. Пресс круговыми движениями против сетчатого фильтра, пока все, что остается белой соединительной ткани.
5. Промойте сетчатые клеток дважды 500 мкл 1x DPBS + 2% FBS + 2 мМ ЭДТА.
6. Перенести весь объем колодца в 50 мл трубки через сито 70 клеток мкм.
7. Промыть хорошо с 500 мкл 1x DPBS + 2% FBS + 2 мМ ЭДТА и передавать объем в 50 мл пробирку. Держите трубку на льду.
   Примечание: Различные шаги , чтобы изолировать общие клетки из кожи и ткани дина приведены на рисунке 5.

1. Центрифуга кожи и образцы дина в течение 5 мин при 450 х г при 4 ° С и отбросить супернатант. Аккуратно ресуспендируют осадок 300 мкл 1x DPBS + 2% FBS + 2 мМ ЭДТА.
2. Собрать небольшой объем каждой пробы, чтобы подсчитать общее число клеток, выделенных из кожи и дина с помощью гемоцитометра. Добавить 0,04% трипановым синим для определения жизнеспособности клеток.

8. Блокирование Non-антигену специфически связывающийся

1. Добавьте 10 мкг / мл немеченого CD16 / CD32 Fc-блок антитела. Инкубировать 20 мин при 4 ° C (может идти дольше).
2. Добавляют 2 мл холодного 1x DPBS + 2% FBS + 2 мМ ЭДТА. Центрифуга образца в течение 5 мин при 450 х г при 4 ° С и отбросить супернатант. Аккуратно ресуспендируют осадок 300 мкл 1х ДЗФР + 2% FBS + 2 мМ ЭДТА и поддерживать образцы на льду.

9. Окрашивание кожи и лимфатических узлов миелоидных клеток

1. Выдержите ранее заблокированного лыжиN и DlN изолированных клеток с Live / Dead трекеру (т.е. 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол или DAPI), анти-CD45 и анти-CD11b - специфических антител.
   ПРИМЕЧАНИЯ: Для того , чтобы обогатить миелоидного субпопуляции клеток , представляющих интерес, особенно редкие, CD45 ⁺ клетки и лимфоциты могут быть соответственно очищены из кожи или обедненный от дина путем магнитного бусинка сортировкой облегчающий клеток. Так как большинство клеток , выделенных из дина являются CD45 ^+, использование анти-CD45 не является обязательным. Другие маркеры могут быть включены, чтобы идентифицировать миелоидных субпопуляции клеток, представляющих интерес с положительным или отрицательным-стробирования стратегии. В этом протоколе, миелоидные клетки , набранные в дина обогащались за счет исключения CD8α ⁺ клеток (весь отсек ячейки T могут быть направлены с помощью анти-CD3 специфическое антитело).
2. Выдержите 30 мин при 4 ° С в темноте. Добавить 500 мкл 1x ДЗФР + 2% FBS + 2 мМ ЭДТА, центрифугировать образец 5 мин при 450 х г при температуре 4 ° С и отбросить супермаркеrnatant. Повторите стадию промывки дважды.
3. Ресуспендируют образцы с 300 мкл 1x DPBS + 2% FBS + 2 мМ ЭДТА. Перенести весь объем в трубку FACS через сетчатый фильтр 35 клеток мкм. Промыть фильтр с 100 мкл 1x DPBS + 2% FBS + 2 мМ ЭДТА.
4. Запуск окрашенных клеток в цитометра потока. Ворота живут отдельные клетки (DAPI ^-, FSC-W) , чтобы исключить мертвые клетки и дублеты. Участок CD45 ⁺ CD11b ⁺ события для кожи (рис 6а) и (CD45 ⁺⁾ CD8α ^- CD11b ⁺ события для дина (рис. 6б)

Недавно мы показали , что игла-шприц инъекции иммунизировать доз P. berghei спорозоитов в коже мыши вызывает последовательное набор полиморфноядерных нейтрофилов с последующим воспалительных моноцитов в коже и дина 19. В данном разделе описано выше протокол подробно процедура , используемая , чтобы успешно изолировать живых миелоидных клеток из обеих тканей следующие многократном введении большого количества спорозоитов в дерме уха (фиг.1 и 2). В течение первых 24 ч, то дина (рисунок 3) и участок инъекции кожи (рисунок 4) были выделены и обработаны , как показаны на рисунке 5 , чтобы проанализировать клеточную инфильтрацию путем многопараметрического проточной цитометрии. В целом, этот метод позволил нам выделить в среднем 10 4 CD45 + CD11b + и 2.10 4 CD11b + живые отдельные клеткидля кожи и DlN соответственно. Приемлемый жизнеспособность без мусора одиночных клеток колебалась от 40-70% для кожи и 70-90% для дина. Как показано на рисунке 6, частота миелоидных клеток в коже (CD45 + CD11b +) и дина (CD8α - CD11b +) сильно возрастает следующие внутрикожной инъекции РАН по сравнению с неинфицированных мышей.

Рисунок 1: Я ntradermal инъекции спорозоитов в ухо мыши. (A) Изображение показывает внутрикожные инъекции спорозоитов в ушной раковины из наркозом мыши. Брюшная сторона уха стабилизируют ясно ленты, ранее помещенные под рассекает микроскопом. Игла аккуратно вставляется на спинной стороне уха, под эпидермисом, с коническим вверх. (B - C) Фотографии , показывающие спинной стороне ушной раковины до (B) и после (C) внутрикожной инъекции 0,1-0,2 мкл суспензии паразитов. Характерная папулы (черная стрелка) наблюдается в месте инъекции в конце операции. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

. Рисунок 2: Визуализация спорозоитов депонированы в ушном дермы мыши (А) Флуоресцентная микроскопия показывает RAS мигрирующей из места инъекции (обозначенный пунктирными линиями) в коже мышей через 15 мин после инъекции (шкала бар = 60 мкм; 10Х увеличение). Путь спорозоитов представлен максимальной интенсивности проекции флуоресцентного сигнала. Зеленый и красный повторно флуоресценциисоответствен- показать положение паразита в коже в начале и после 10 секунд приобретения. (В) более высокое увеличение РАН (зеленый) вводится в кожу (бар Scale = 20 мкм; 25X увеличение). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Слив лимфатического узла обработки (A) Изображение , показывающее рассечение проксимального аурикулярную дина следующие внутрикожной инъекции Эванса синего для демонстрационных целей.. После смещения шейных позвонков мыши, шея дезинфицируют 70% этанола. Первый надрез в яремную-каротидной зоны с острыми ножницами и кожа удаляется из операционного поля. Разрез растягивается с 2 щипцов, чтобы выставить дина, который появляется грАйиш по сравнению с окружающей тканью. Соединительные ткани затем тщательно зажат с щипцами на верхней части дина и постепенно отделяется от него. И, наконец, DlN извлекается путем размещения пинцетом под лимфоидной ткани. (B) Изображение , показывающее извлеченный дина в капле PBS. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рис . 4: Ear Обработка кожи Фотографии , показывающие последовательные шаги , чтобы обработать привит ухо. (А) После смещения шейных позвонков мыши, ухо дезинфицируют 70% этанолом и удаляют с помощью стерильных острыми ножницами и пинцетом. (B - D) дорсальной и вентральной стороны уха слегка отделены друг от защемления и срасхаживая помимо разреза заканчивается двумя щипцами. (E) Изображение показывает спинной и брюшной стороны уха предварительного ферментативной обработки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5:.. Протокол Резюме Схематическое представление ключевых шагов , чтобы изолировать общие клетки из кожи и тканей дина Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6: миелоидный популяции клеток , изолированных от уха и кожи проксимального дина Представитель FACS графики , показывающие.Стратегия стробирования для анализа миелоидного отделение в коже (A) и дина (B). CD45 + CD11b + и CD8α - клетки CD11b + были закрытого типа на общее количество живых синглетными событий для кожи и дина соответственно. Для каждого условия, 5 х 10 5 Всего событий были приобретены (2 уши и 2 дина собирали на образец). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.