Мы описываем здесь протокол выделения миелоидных клеток из кожи мыши и дренирования лимфатических узлов после внутрикожного введения спорозоитов Plasmodium. Проточная цитометрия собранных клеток обеспечивает надежный анализ для характеристики кожных и дренирующих лимфатических узлов воспалительной реакции на паразита.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Миелоидный Выделение клеток из кожи мышей и Слив лимфатического узла После внутрикожной иммунизации с живой аттенуированной
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Малярийной инфекции начинается , когда стадия спорозоитов плазмодия засевают в кожу млекопитающего - хозяина через укус комара. Высоко подвижны паразит не только попадает в печень, чтобы вторгнуться в гепатоциты и превращаются в эритроцитах-инфекционный форму. Он также мигрирует в кожу и проксимального лимфатических узлов, дренирующих место инъекции, где он может быть признан и деградировал резидентом и / или завербованных миелоидных клеток. Прижизненные изображения сообщалось раннее набор ярко флуоресцентный Lys-GFP положительных лейкоцитов в коже , а также взаимодействия между спорозоитов и CD11c + клеток в осушение лимфатических узлов. Мы представляем здесь эффективную процедуру для восстановления, выявления и перечисления миелоидной подмножеств клеток, которые набираются на кожу мыши и дренирующих лимфатических узлов следующие внутрикожной инъекции иммунизация дозы спорозоитов в мышиной модели. Фенотипическая характеристика с использованием многопараметрических проточной цитометрии обеспечиваетнадежный анализ для оценки ранних динамических клеточных изменений в ходе воспалительной реакции на Plasmodium инфекции.
Введение
Малярия является одной из самых опасных инфекционных заболеваний в мире погибло более полумиллиона человек в год. Инфекция Plasmodium, возбудителя заболевания, начинается с фазы преэритроцитарных (PE). Во время этой фазы, спорозоиты впрыскивается в принимающей коже самкой малярийного комара достигают печени через кровь и дифференцировать внутри гепатоцитов в формы паразитов , которые инфицируют красные кровяные клетки и вызывают симптомы заболевания.
Стадии ПЭ плазмодия представляют собой привилегированный мишень для вакцинации против малярии. Действительно, живые ослабленные вакцины против этих стадий, таких ка....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры были одобрены комитетом Института Пастера и местного комитета по этике по экспериментированию животных (этический комитет IDF-Париж 1, Париж, Франция; Номер договора: 2012-0015) с помощью и осуществляется в соответствии с действующими нормами и правилами.
1. Материалы и реагенты
- Использование женского Anopheles stephensi москитов (Sda500 деформация) , которые питаются инфицированных мышей через 3-5 дней после появления всходов и задней части , как описано выше 21.
- Используйте паразиты Plasmodium berghei АНКА клон , экспрессирующий ген зеленого флуоресцентного белка (GFP) под контролем конст....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Недавно мы показали , что игла-шприц инъекции иммунизировать доз P. berghei спорозоитов в коже мыши вызывает последовательное набор полиморфноядерных нейтрофилов с последующим воспалительных моноцитов в коже и дина 19. В данном разделе описано выше протокол подробно процедура , используемая , чтобы успешно изолировать живых миелоидных клеток из обеих тканей следующие многократном введении большого количества спорозоитов в дерме уха (фиг.1 и 2).......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В перспективе крупномасштабной вакцинации людей , используя всю вакцину спорозоитов малярии, одной из главных задач по преодолению заключается в разработке оптимизированных маршрутов и способов введения паразита для обеспечения успешной иммунизации и защиты 24,25. В организме человека, оценка защитной эффективности опосредованного живых ослабленных паразитов (LAP) была выполнена после стихийных укусов комаров 2, а также внутрикожного, подкожного 25,26 и IV иммунизацию 27. Как .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Авторы благодарят Patricia Baldacci, Ванесса Lagal и Сабин Thiberge для критического чтения, Ирина Добреску и Сабин Thiberge за помощь в съемке и Полин Formaglio для обучения в естественных изображений спорозоидной моторики в коже мыши. Мы также хотели бы поблагодарить Марека Szatanik и Центр по производству и Инфицирование Anopheles (Cepia-Institut Pasteur) для противомоскитной выращивания. Это исследование было поддержано исследовательским фондом и фондами AXA от Laboratoire d'Превосходство "интегративной биологии возникающих инфекционных болезней» (грант №. ANR-10-LabX-62-IBEID).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Кетамин: Imalgene® 1,000 | Merial | - | 50 мг/кг: предыдущее введение спорозоита 125 мг/кг: до жертвоприношения |
| Ксилазин: ромпун® 2% | Байер-5 | мг/кг: до введения спорозоита 12,5 мг/кг: перед жертвой | |
| шприц NanoFil + игла 35 калибра | World Precision Instruments | - | - |
| Omnican® 50 Инсулиновый шприц 0,5 мл/50 МЕ | Б. Браун Медикал | для культуры тканей | 9151125-MultiwellTM |
| – Плоское дно | BD Falcon | 353046-70 | |
| & микро; Ситечко для клеток M | BD Falcon | 352350-2 | |
| мл шприц | Terumo | SS-02S-BLUE | |
| MAXTM 15 мл полипропиленовая коническая трубка | BD Falcon | 352097-BLUE | |
| MAXTM 50 мл Полипропиленовая коническая туба | BD Falcon | 352098-5 | |
| мл Полистирольная трубка с круглым дном с 35 &; m Колпачок фильтра для ячеек | BD Falcon | ||
| 1x CaCl2- и MgCl2--free | Life Technologies | 14190-094-DMEM | |
| 1x + GlutaMAXTM | Life Technologies | 31966-021-коллагеназа | |
| из Clostridium histolyticum, тип IV 0,5-5,0 единиц FALGPA/мг твердого вещества; | Сигма-Олдрич | C5138 | 400 Ед/мл |
| Дезоксирибонуклеаза I из поджелудочной железы крупного рогатого скота, тип IV | Сигма-Олдрич | D5025 | 50 & микро; г/мл |
| ЭДТА динатриевая соль | Sigma-Aldrich | E-5134 | 10 мМ или 2,5 мМ |
| FBS | Biowest S1810-500-HEPES | ||
| буферный раствор (1М) | Gibco | 15630-056 | 25 мМ |
| Трипановый синий краситель (0,4%) | Life Technologies | 15250-061 | Разбавление 1:10 |
| Антимышиный CD16/CD32 (клон 2.4G2) | BD Biosciences | 553142 | 10 &микро; г/мл конечный (1:50) |
| DAPI FluoroPureTM марка | Life Technologies | D21490 | 1 &; г/мл конечный |
| Anti-mouse CD45 (клон 30-F11) | BD Biosciences | 559864 | Разведение 1:200 |
| Антимышиный CD11b (клон M1/70) | BD Biosciences | 557657 | Разведение 1:400 |
| Антимышиный CD8&альфа; (клон 5H10) | Технологии жизни | MCD0830 | Разведение 1:100 |
| Самки мышей C57BL/6JRj (7-недельный возраст) | Лаборатории Жанвье- | - |
Ссылки
- Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Most, H., Orton, C. Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of plasmodium berghei. Nature. 216 (5111), 160-162 (1967).
- Hoffman, S. L., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
