Культуры низкой плотности первичных нейронов гиппокампа обычно требуют питающего слоя глии для обеспечения нейротрофических факторов и поддержания долголетия. Мы описываем упрощенный метод культивирования нейронов сверхнизкой плотности на стеклянных покровных стеклах в присутствии нейронального фидерного слоя высокой плотности, что облегчает исследование специфических нейронально-автономных механизмов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Упрощенный метод для сверхнизкой плотности, Долгосрочное Первичный гиппокампа Нейрон культуры
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Культивирование первичных гиппокампа нейронов в пробирке облегчает механистической опрос многих аспектов развития нейронов. Разъединенные эмбриональные нейроны гиппокампа часто могут успешно расти на покровные стекла при высокой плотности при бессывороточной условиях, но культуры низкой плотности обычно требуют поставки трофических факторов путем совместного культивирования их с фидерной глии слоем, получение которого может занять много времени и трудоемкий. Кроме того, наличие глии может запутать интерпретацию результатов и исключает исследований по механизмам нейроноподобных специфичны. Здесь упрощенный метод представлен для ультра-низкой плотности (~ 2000 нейронов / см 2), долгосрочный (> 3 месяца) первичной гиппокампа нейрон культуры , который находится под бессывороточной условиях и без поддержки глии клеток. Нейроны низкой плотности выращены на поли-D-лизином покровные с покрытием, и переворачивается на нейроны с высокой плотностью, выращенных в 24-луночный планшет. Вместо того чтобы использовать парафиновые точки, чтобы создать пространство betweeп два нейрональных слоев, экспериментаторы могут просто травить пластический дно колодца, на котором нейроны высокой плотности проживают, чтобы создать Микрокосмом, способствующую росту нейронов низкой плотности. Сокультуры можно легко поддерживать в течение> 3-х месяцев без значительной потери нейронов низкой плотности, тем самым облегчая морфологические и физиологические исследования этих нейронов. Чтобы проиллюстрировать это успешное состояние культуры, данные предоставляются, чтобы показать образование обильное синапсов в клетках с низкой плотностью после длительной культуры. Эта система сокультуры также способствует выживанию редких отдельных нейронов, выращенных на островах поли-D-лизином субстратов и, таким образом, образованию autaptic соединений.
Введение
Рост гиппокампа нейронов в условиях , в пробирке позволяет вести наблюдение и экспериментальные манипуляции этих нейронов, которые в противном случае не представляется возможным в естественных условиях. Этот экспериментальный подход широко используется для выявления нейронные механизмы роста, полярности, спецификации аксонов, торговлей и внутриклеточной локализации белков, формирование синапсов и функционального созревания 1. Эти в пробирке культивированный нейронов гиппокампа, когда собирали из поздних эмбриональных стадий, относительно чистый (> 90%) глутаматергические клетки пирамидальной морфологии 2. Поскольку ней....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все экспериментальные процедуры, связанные с мышами были одобрены Institutional Animal Care и использование комитета Университета штата Аризона по, и соответствовали рекомендациям NIH.
1. Ткань Источник для гиппокампа Нейрон культуры
- Для создания предродовые щенят мыши для гиппокампа нейрон культуры, использовать временные беременных мышей (C57BL6 / J), которые разводятся в доме 17. На следующий день с вагинальным обнаружения пробки обозначается как E0.5. Планируемое время сбора урожая для культуры E16.5-E17.5.
Примечание: Этот протокол описывает культуры двух 24-луночных двух нейронов с высокой плотностью сок....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Протокол, описанный здесь, обеспечивает успешную сверхнизкой плотности, долгосрочную культуру чистых глутаматэргических нейронов без необходимости глиальных клеток, выступающей в качестве фидерного слоя. Протокол схематически на рисунке 1, который включает получение высокой плотности (поли-D-лизина с покрытием 24 лунок) и нейронов низкой плотности (поли-D-лизином с покрытием покровные стекла) отдельно, и последующее совместное культивирование , что может сохраняться до т.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мы представляем подробный протокол для долгосрочной культуры ультра-низкой плотности нейронов гиппокампа глутаматэргических под бессывороточной условиях. В ~ 2000 нейронов / см 2, плотность по меньшей мере , в два раза ниже , чем у большинства препаратов "низкой плотности" культуры с или без поддержки глии об этом сообщил существующей литературе 2,3,11,13,14. В дополнение к ультра-низкой плотности, этот протокол является новым и значимым еще в двух направлениях. Во-первых, ни один фидер г.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Это исследование было поддержано грантом NIH/NIMH для S.Q. (R00MH087628).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Нейробазальная среда | Life Technologies | 21103-049 | Защитить от света |
| B27 добавка | Life Technologies | 17504-044 | аликвота, хранить в объеме 0,6мл |
| GlutaMAX-I | Life Technologies | 35050-061 | развести 100X |
| антибиотико-антимикотический (АА) | Life Technologies | 15240-096 | разбавленный 100X |
| Полная питательная среда | Нейробазальная среда с 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I | ||
| Промывочная среда | такая же, как 'Нейробазальная среда'Кормовая | ||
| среда | Нейробазальная с 1X B27 добавкой | ||
| ДНК I | Sigma-Aldrich | D5025 | приготовить 100X бульон в 0,6 мг/мл |
| поли-D-лизин | Sigma-Aldrich | P6407 | M.W. 70000-150000 |
| боратный буфер | Sigma-Aldrich | B6768 (борная кислота); 71997 (бура) | 1,24 г борной кислоты и 1,9 г буры в 400 мл H2O, pH до 8,5 использовать HCl |
| 12-мм круглые стеклянные покровные стекла | Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/12 | No. 1 стекло, приобрести у Carolina Biological Supply |
| набор для трансфекции proFection | Promega | E1200 | см. протокол для подробностей |
| 2X HEPES буферизованный физиологический раствор (HBS) | Promega | E1200 | см. протокол для подробностей |
| Шприц-фильтр | Pall Corporation | 4192 | 0,2 мкм размер пор |
| Набор для подготовки эндосвободной плазмиды | Qiagen | 12362 | для приготовления трансфекционной плазмиды ДНК |
| анти-MAP2 антитела | Millipore | MAB3418 | мышиного антитела, клон AP20 |
| анти-p-Tau антитела | Millipore | AB10417 | кролик поликлональное антитело |
| анти-NR1 антитело | Millipore | MAB1586 | мышиное антитело, клон R1JHL |
| анти-GluR1 антитело | Millipore | AB1504 | кролик поликлональное антитело |
| сбалансированный раствор соли Хэнка | ThermoFisher | 14025092 | объем 500мл |
Ссылки
- Banker, G. Cultureing Nerve Cells. , 2nd edition, 339-370 (1998).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Petersen, J. D., Kaech, S., Banker, G.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
