Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Feeder-свободный Вывод меланоцитов из человеческих плюрипотентные стволовые клетки

9.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53806

⸱

3 марта 2016 г.

 ,  , 
1The Center for Stem Cell Biology, Developmental Biology Program, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, 2Cancer Biology and Genetics Program, Gerstner Sloan-Kettering Graduate School, Sloan-Kettering Institute for Cancer Research, 3Thermo Fisher Scientific

В этой статье

Краткое содержание

Эта работа описывает протокол дифференцировки в пробирке для производства пигментных, зрелые меланоциты из человеческих плюрипотентных стволовых клеток с помощью нервного гребня и меланобластов промежуточную стадию с использованием фидерных бесплатно, 25 день протокола.

Аннотация

Человеческие плюрипотентные стволовые клетки (hPSCs) представляют собой платформу для изучения развития человека in vitro как в нормальных, так и в болезненных условиях. Исследователи могут направлять дифференцировку hPSCs в интересующий их тип клеток, манипулируя условиями культивирования для повторения сигналов, наблюдаемых во время развития. Одним из таких типов клеток является меланоцит, пигмент-продуцирующая клетка нервного гребня (НК), отвечающая за защиту кожи от ультрафиолетового излучения. Этот протокол представляет собой расширение доступного в настоящее время протокола дифференцировки Neural Crest in vitro от hPSCs для дальнейшей дифференциации NC в полностью пигментированные меланоциты. Предшественники меланоцитов могут быть обогащены по протоколу Neural Crest путем временного воздействия на активаторы передачи сигналов WNT, BMP и EDN3 в условиях двойного ингибирования SMAD. Полученные предшественники меланоцитов затем очищают и созревают в полностью пигментированные меланоциты путем культивирования в селективной среде. Полученные меланоциты полностью пигментированы и окрашиваются в соответствии с белками, характерными для зрелых меланоцитов.

Введение

Человеческие плюрипотентные стволовые клетки (hPSCs) обеспечивают платформу для имитации нормальной дифференцировки в масштабируемой моды для моделирования болезней, скрининга лекарственных средств и клеточной заместительной терапии 1-6. Особый интерес, hPSCs открывают возможности для изучения трудно выделить или редкие / переходные типы клеток, где образцы пациентов скудны. Кроме того, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК) позволяют исследователям изучать развитие и моделирования заболевания у пациента специфическим образом , чтобы раскрыть уникальные механизмы 1,2,7-11. Ранее опубликована протокол для дифференциации меланоцитов от hPSCs требуется до 6 недель дифференцировок и включает в себя культивирование клеток с кондиционированной средой из L-WNT3a клеток 12. Протокол первый представленный слюды и др. И описано здесь производит пигментные клетки в течение трех недель и устраняет неоднозначность и несоответствий , связанных с кондиционированной средой.

меланоциты сотоке происходит от нервного гребня, миграционным популяции клеток, уникальных для позвоночных. Нервный гребень определяется во время гаструляции и представляет собой популяцию клеток у края нервной пластинки, на границе между нервной и не-нейральной эктодермы. Во время нейруляции, нервная ткань развивается из нервной пластинки с образованием нервных складок, которые сходятся на средней линии спины приводит к 13,14 нервной трубки.

В клетки нервного гребня возникают из потолочной панели нервной трубки, напротив хорды, и пройти эпителиальные к мезенхимальных перехода перед миграцией в сторону, чтобы дать начало различных слоев населения дифференцированных клеток. Судьбы клеток гребня определяются частично анатомическим расположением крыши пластины вдоль оси тела зародыша. Нервные производные гребень клеток включают родословные, характерные как мезодермы (гладкие мышечные клетки, остеобласты, адипоциты, хондроциты) и эктодермы клетки (меланоциты, Шванн сгезов, нейроны) 14. Нервный гребень стволовые клетки апрегулируются фактор транскрипции Sox10 и может быть выделен с помощью флуоресцентной активированные клетки сортировочного с антителами к р75 и HNK1.

В клетки нервного гребня суждено стать меланоциты пройти через стадию меланобластов и апрегулируются KIT и MITF (микрофтальмия-ассоциированный фактор транскрипции) 6,21 MITF является главный регулятор развития меланоцитов и является фактором транскрипции отвечает за контроль большую часть развития меланоцитов 22- 24. Человеческие меланобластов мигрируют в базальный слой эпидермиса, где они проживают либо в выпуклость волос или окружены кератиноцитов в эпидермисе (образуя пигментные единиц), чтобы служить в качестве предшественников зрелых, пигментных меланоцитов. Дифференцировку и созревание меланобластов в пигментированных меланоцитов происходит одновременно с колонизацией волосяной луковицы и экспрессии продуцирование меланина пути (TYRP1, Tyr, oca2 иПМЕЛ) 25,26.

Разделительный меланоцитов человека и меланобластов от больных является дорогостоящим, трудным и ограничение в количестве. Этот протокол позволяет исследователям дифференцировать hPSCs (беременными или эмбриональные) в меланоцитов или меланоцитов предшественников в четко определенной, быстрой, воспроизводимой, масштабируемой и недорогим способом без сортировки клеток. Протокол был использован ранее для выявления конкретных заболеваний дефектов при дифференцировании иПСК от пациентов с нарушениями пигментации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: Протокол меланоцитов описано здесь была впервые продемонстрирована слюды и др.

1. Приготовление культуральной среды, с покрытием Посуда и поддержание hPSCs

  1. Средний Приготовление
    Примечание: Храните все среды при 4 ° С в темноте в течение до 2-х недель. Фильтр всю среду для стерилизации.
    1. Подготовка DMEM / 10% FBS. Смешайте 885 мл DMEM, 100 мл FBS, 10 мл пен / стреп и 5 мл L-глютамин. Фильтр для стерилизации.
    2. Подготовка чЭСК-среду. Смешайте 800 мл DMEM / F12, 200 мл KSR, 5 мл L-глутамина, 10 мл MEM минимально необходимого раствора аминокислоты, 1 мл -меркаптоэтанола и 5 мл Pen / Strep. После фильтрации добавляют 10 нг / мл FGF-2.
    3. Подготовка KSR-дифференциации среды: Смешайте 820 мл Нокаут DMEM, 150 мл KSR, 10 мл L-глутамина, 10 мл Pen / Strep, 10 мл MEM минимального основного раствора аминокислоты и 1 мл β-меркаптоэтанола. Фильтр для стерилизации.
    4. Подготовка N2-дифференциации среды. Растворить 12 г DMEM / F12 порошок IN 980 мл дН 2 O. Добавить 1,55 г глюкозы, 2 г бикарбоната натрия и 100 мг APO человеческого трансферрина. Смешайте 2 мл дН 2 O с 25 мг человеческого инсулина и 40 мкл 1 N NaOH; После растворения, добавьте смесь в среду. Добавьте 100 мкл путресцина дигидрохлорид, 60 мкл селенит 100 мкл прогестерон. Принесите конечный объем до 1 л с дН 2 O до фильтрации.
    5. Подготовка Полный меланоцитов среды. Комбинат 50% Neurobasal среды, 30% Низкая DMEM глюкозы, а 20% MCDB201. К этому добавить: 0,8% ITS +, 250 нМ L-глутамина, 100 мкМ аскорбиновой кислоты (L-АА), 50 нг / мл холерного токсина, 50 нг / мл SCF, 0,05 мкМ дексаметазон, 100 нМ EDN3, 4 нг / мл FGF2 , Стерильный фильтр, а затем добавить остальные реагенты: 2% B27 Supplement, 25 нг / мл Bmp4, 3 мкМ CHIR99021, 500 мкМ цАМФ.
  2. Покрытие посуды культуры
    1. Осуществить покрытие с использованием гелеобразную белок, такой как Матригель. После открытия аликвоты и замораживания Матригель в 1 мл частей, чтобы избежать повторных замораживания таяния снегаycles. Оттепель и повторно приостановить 1 мл аликвоты заморожен с 19 мл DMEM / F12. Пластина 5 мл на 10 см блюдо. Инкубируйте блюда в течение 1 часа при комнатной температуре. Аспирируйте гелеобразную белка непосредственно перед металлизированный клетки и промывают DMEM / F12.
    2. Осуществить покрытие с использованием поли-L ornithin гидробромид / мышь Laminin-I / фибронектин (PO / LAM / FN). Смазать блюдо с PBS, содержащей 15 мкг / мл поли-L ornithin гидробромид. Выдержите O / N при 37 ° С в увлажненном инкубаторе. Аспирируйте раствор и промыть пластины с PBS три раза перед нанесением покрытия с PBS, содержащим 1 мкг / мл мыши ламинина-I и 2 мкг / мл фибронектина. Инкубируйте блюда O / N при 37 ° С в увлажненном инкубаторе.
      1. Перед металлизированный клетки, аспирация раствор и дайте пластины полностью высохнуть без крышки в капюшоне культуры ткани. Разрешить пластины высохнуть в течение примерно 10-15 мин.
        Примечание: Блюда сухие и готовы к клеточной обшивки, когда появляются кристаллические структуры на поверхности со стороны глаза. PlatES могут быть сохранены с ФБР, содержащим LAM / FN в инкубаторе в течение двух недель, до тех пор пока жидкость не испаряется. Пластины могут быть высушен при комнатной температуре в течение нескольких часов.
  3. Поддержание hPSCs
    Примечание: hPSCs поддерживаются на 0,1% желатина и митотически инактивированной мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ) в чЭСК-среде. Клетки должны быть разделены каждые 6-8 дней.
    1. Покройте 10 см чашку с 0,1% желатина в PBS при комнатной температуре в течение 5 мин.
    2. Размораживайте MEFs быстро в водяной бане при 37 ° C.
    3. Аспирируйте желатин и пластинчатые клетки. Пластинчатые MEFs при плотности ~ 50000 клеток / см 2 в среде DMEM / 10% FBS. Выдержите MEFs при 37 ° CO / N перед добавлением hPSCs.
    4. Аспирируйте DMEM / 10% FBS из подготовленной MEF пластины, мыть пластины с PBS и добавляют 10 мл чЭСК-среду с hPSCs. Прохождение hPSCs в соотношении 1: 5/10 в зависимости от плотности до пассажей.
      Примечание: Если hPSCs в настоящее время размораживают или пассировать в виде отдельных клеток, вир10 дополняют мкМ Y-27632 дигидрохлорида (Rocki) до первого прохода.
    5. Поток клетки ежедневно свежей 10 мл чЭСК-среды.
    6. Перед началом дифференцировки плюрипотентных удалить любые колонии , которые , как представляется, содержат дифференцированные клетки, неровные границы, или прозрачные центры 28. Механически выбить и аспирацию нерегулярные колонии с пипеткой под капотом ламинарного потока с рассекает микроскопом.

2. Покрытие из hPSCs для дифференциацию

Примечание: условия Дифференциация описаны на 10 см чашки.

  1. Подготовка 10 см Матригель блюда перед началом дифференциации, как это описано в шаге 1.3.1.
  2. Когда гальванических hPSCs для дифференцировки начинаются с пластины hPSCs при плотности готового для прохода (~ 80% сливающийся) аспирация чЭСК-среды, промывают PBS и добавляют 3 мл 0,05% трипсин-ЭДТА к клеткам.
  3. Энергично встряхните блюдо горизонтально расту в течение 2 мин при визуализации под микроскопом, пока не MEFs отрываться в виде отдельных клеток. Колонии HPSC должны оставаться присоединенным в качестве колоний.
  4. Аспирируйте трипсин после того, как MEFs подняли, но до того, как hPSCs колонии разделиться.
  5. Добавить 10 мл чЭСК-среде, содержащей 10 мкМ Y-27632 дигидрохлорид к пластине и открепления клеток с помощью пипетки вверх и вниз над колониями.
  6. Аспирируйте решение Matrigel от 10 см блюдо, полученного на стадии 2.1 и промывают DMEM / F12, чтобы удалить сгустки. Пластина hPSCs в соотношении 1: 2 на пластину Матригель. Добавить чЭСК-среду, содержащую 10 мкМ Y-27632 дигидрохлорид до 10 мл. Инкубируют при 37 ° CO / N.
    Примечание: Это покрытие должно привести к приблизительно 100000 клеток / см 2.

3. Индукция Neural дифференциацию

Примечание: дифференциация должна быть начата (день 0), когда hPSCs являются 80% сплошности. Клетки можно подавать ежедневно с чЭСК-средойне содержащий 10 мкМ Y-27632 дигидрохлорид до начала дифференцировки.

  1. В день 0 и день 1, питания клеток с 10 мл KSR-дифференцировке среде, содержащей 100 нМ LDN193189 и 10 мкМ SB431542.
  2. На 2-й день, питания клеток с 10 мл KSR-дифференцировке среде, содержащей 100 нМ LDN193189, 10 мкМ SB431542 и 3 мкМ CHIR99021.
  3. На 3-й день, питания клеток с 10 мл KSR-дифференцировки среде, содержащей 10 мкМ SB431542 и 3 мкМ CHIR99021.
  4. На 4 и 5 питания клеток с 15 мл 75% KSR-дифференциации среды и 25% N2-дифференциации среды, содержащей 3 мкМ CHIR99021.
    Примечание: Не беспокойтесь, чтобы увидеть большое количество клеточной смерти в терминах плавающих клеток. Это нормально и следовало ожидать.
  5. В дни 6 и 7 питания клеток с 15 мл 50% -ного KSR-дифференциации среды и 50% N2-дифференциации среды и содержащей 3 мкМ CHIR99021, 25 нг / мл ВМР4 и 100 нМ EDN3.
  6. В дни 8и 9 питания клеток с 20 мл 25% KSR-дифференцировке среды и 75% N 2-дифференцировке среде, содержащей как 3 мкМ CHIR99021, 25 нг / мл ВМР4 и 100 нМ EDN3.
  7. В дни 9 и 10 готовят PO / LAM / FN блюда, как указано в пункте 1.2.2 для повторного посева клеток на 11 день.
  8. На 10-й день кормовых клеток с 20 мл N2-дифференциации среды, содержащей 3 мкМ CHIR99021, 25 нг / мл ВМР4 и 100 нМ EDN3.

4. Replating в каплях для спецификации NC

  1. На 11-й день аспирата Lam / FN из подготовленных PO / LAM / FN пластин и полностью высохнуть.
  2. Удалить среду из 11-й день клетки, промывают PBS и добавляют 4 мл раствора открепления клеток, таких как Accutase на 10 см чашку. Инкубировать в течение 25 мин при 37 ° С.
  3. Добавляют 5 мл полной среды меланоцитов к блюду и ресуспендирования клеток вручную пипетированием вверх и вниз с 10 мл пипетки, пока все клетки не отрывается от пластины. Передача суспензии в 15 мл пробирку.
  4. КрутитьКлетки в течение 5 мин при 200g и клетки вновь суспендируют в 2 - х 10 6 клеток на мл в полной среде меланоцитов. Граф клеток с использованием трипанового синего на гемоцитометра или эквивалентной методикой.
  5. Пластина 10 мкл капли близко друг к другу (без их прикосновения) на высушенный PO / LAM / ФН 10 см чашки. Если пластинка достаточно высушенного, капли должны иметь четко определенные края и не выполняются.
    Примечание: Это создает локальную среду высокой плотности для клеток, что важно, когда replating клетки, сохраняя при этом комнату в блюдо для расширения.
  6. Разрешить капли постоять при комнатной температуре в течение 10-20 мин, чтобы клетки придерживаться, а затем медленно (чтобы не нарушить прикрепленные клетки) добавляют 10 мл полной среды меланоцитов. Переместить блюдо в инкубатор.

5. Расширение меланоцитов прародителей

  1. Продолжить кормление с полной меланоцитов среды каждые 2 до 3 дней.
    Примечание: Пигментация следует начинать, чтобы быть видимыми шithin кластеры клеток к концу первой недели и становится совершенно ясно, на второй неделе. Просмотр планшет на белом фоне, такой как лист бумаги, чтобы различить эти ранние маленькие, темные кластеры. Клетки будут постепенно становятся все более пигментированный с течением времени, пока вся пластинка не равномерно пигментированные (см Фигура 2В).
  2. Прохождение клетки не один раз в неделю в соотношении ~ 1: 6 (металлизации в виде капель больше нет необходимости на данном этапе). Используйте Accutase диссоциировать клетки и дважды промывают обычной средой Neurobasal перед повторным покрытием в полном меланоцитов среде. Поддерживать клетки на PO / LAM / FN пластин.
    Примечание: Мы обнаружили, что среда Full меланоцитов лучше всего подходит для поддержания и расширения чЭСК и IPSC полученных из меланоцитов. Тем не менее, клетки могут быть кратко культивируют в коммерчески доступной среде M254, но упрощенная медиа увеличивает риск клеток умирающих и подъемными от пластины.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этот протокол обеспечивает метод получения полностью пигментированные, зрелые меланоциты из hPSCs в в пробирке фидера свободной, экономически эффективным и воспроизводимым способом. В отличие от ранее установленной и др. Протоколом Fang для HPSC полученных из меланоцитов, наметившееся протокол не требует кондиционированной среды и уменьшает требование о времени. Протокол Fang и др. Использовали кондиционированную среду из WNT3a-продуцирующих клеток мышиной лини...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Для успешной дифференциации меланоцитов из hPSCs следующие предложения должны быть приняты во внимание. В первую очередь, необходимо работать в стерильных условиях культивирования во все времена. Кроме того, важно, чтобы начать с плюрипотентных полностью недифференцированных hPSCs; если исходная популяция содержит дифференцированные клетки выход неизменно будет падать, как загрязняющие вещества не могут быть направлены на меланоциты и может еще больше нарушить правильно дифференцирующие клетки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют никаких противоречивых интересов раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана стипендии для меланомы исследователей из Joanna M. Nicolay Foundation и Национальным институтом здоровья под Рут Л. Kirschstein Национальный исследовательский премии Сервис F31. Эта работа была дополнительно поддерживается за счет субсидий из NYSTEM и инициативы Tri-институциональном стволовых клеток (Starr Foundation).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
апо человеческий трансферринSigmaT1147
Аскорбиновая кислота (L-AA)SigmaA4034100 мМ
B27 (добавка B27)Инвитроген17504044
&бета;-меркаптоэтанолGibco-Life Technologies21985-02310 мг/мл
БМП4НИР D Systems314-bp
CHIR99021Tocris-R& D Systems44236 мМ
Холерный токсинSigmaC805250 мг/мл
цАМФ (cyclicAMP)SigmaD0627100 мМ
ДексаметазонSigmaD2915-100MG50 μ M
DMEM - модифицированная среда Dulbecco's EagleGibco-Life Technologies11985-092
DMEM/F12 - модифицированная среда Dulbecco's Eagle: смесь питательных веществ F-12Gibco-Life Technologies1133--032
DMEM/F12 порошокInvitrogen12500-096
EDN3 (эндотелин-3, человек)American Peptide Company88-5-10B100; M
ФибронектинBD Biosciences356008200 μ г/мл
желатина (PBS без Mg/Ca)в доме0,1% в PBS
ГлюкозаSigmaG7021
Человеческий инсулинSigmaI2643
ITS+ Универсальная культуральная добавка Premix BD Biosciences354352
KSR (замена нокаутирующей сыворотки)Gibco-Life Technologies10828-028
Knockout DMEMGibco-Life Technologies10829-018
L-глутаминGibco-Life Technologies25030-081
LDN193189Stemgent04-0074100 мМ
Низкий уровень глюкозы DMEMInvitrogen11885-084
Matrigel matrixBD Biosciences354234растворить 1:20 в DMEM/F12
MCDB201 MediumSigmaM6770
MEM минимальный раствор незаменимых аминокислотGibco-Life Technologies11140-080
Эмбриональные фибробласты мыши (7 миллионов клеток/флакон)GlobalStemGSC-8105M
Мышиный ламинин-IНИР D Systems3400-010-011 мг/мл
Нейробазальная средаИнвитроген21103049
Пенициллин/СтрептомицинGibco-Life Technologies15140-12210 000 Ед/мл
Poly-L Омитин гидробромидSigmaP365515 мг/мл
ПрогестеронSigmaP87830,032 г в 100 мл 100% этанол
Путресцина дигидрохлоридSigmaP5780
FGF2 (Рекомбинантный человеческий FGF базовый)R& D Systems233-FB-001MG/CF10 мг/мл
SB431542Tocris-R& D Systems181410 мМ
селенитSigmaS5261
Бикарбонат натрияSigmaS5761
SCF (Фактор стволовых клеток, рекомбинантный Человек) Пепротех Инк.300-0750 μ г/мл
TYRP1 (G-17) АнтителоSanta Cruz104431:200
Антитело к TYRP2Abcam740731:200
Трипсин-ЭДТА (0,05%)Gibco-Life Technologies25300-054
Y-27632 дигидрохлоридTocris-R& D Systems125410 мМ

Ссылки

  1. Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
  2. Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
  3. Lee, G., et al. Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression. Nat biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).
  4. Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat methods. 7, 25-27 (2010).
  5. Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ health persp. 120, 1116-1122 (2012).
  6. Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell rep. 3, 1140-1152 (2013).
  7. Mariani, J., et al. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162, 375-390 (2015).
  8. Doulatov, S., et al. Modeling Diamond Blackfan Anemia in Vivo Using Human Induced Pluripotent Stem Cells. Blood. 124, (2014).
  9. Cherry, A. B. C., Daley, G. Q. Reprogrammed Cells for Disease Modeling and Regenerative Medicine. Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).
  10. Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. Embo J. 33, 409-417 (2014).
  11. Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494, 105-110 (2013).
  12. Fang, D., et al. Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells. Stem cells. 24, 1668-1677 (2006).
  13. Huang, X., Saint-Jeannet, J. P. Induction of the neural crest and the opportunities of life on the edge. Dev biol. 275, 1-11 (2004).
  14. White, R. M., Zon, L. I. Melanocytes in development, regeneration, and cancer. Cell stem cell. 3, 242-252 (2008).
  15. Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells. Cell. 96, 737-749 (1999).
  16. Elworthy, S., Pinto, J. P., Pettifer, A., Cancela, M. L., Kelsh, R. N. Phox2b function in the enteric nervous system is conserved in zebrafish and is sox10-dependent. Mech develop. 122, 659-669 (2005).
  17. Harris, M. L., Baxter, L. L., Loftus, S. K., Pavan, W. J. Sox proteins in melanocyte development and melanoma. Pigm cell melanoma r. 23, 496-513 (2010).
  18. Herbarth, B., et al. Mutation of the Sry-related Sox10 gene in Dominant megacolon, a mouse model for human Hirschsprung disease. PNAS. 95, 5161-5165 (1998).
  19. Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nat genetics. 18, 60-64 (1998).
  20. Dupin, E., Glavieux, C., Vaigot, P., Le Douarin, N. M. Endothelin 3 induces the reversion of melanocytes to glia through a neural crest-derived glial-melanocytic progenitor. PNAS. 97, 7882-7887 (2000).
  21. Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate. Development. 126, 3757-3767 (1999).
  22. Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF. Development. 127, 5379-5389 (2000).
  23. Levy, C., Khaled, M., Fisher, D. E. MITF: master regulator of melanocyte development and melanoma oncogene. Trends mol med. 12, 406-414 (2006).
  24. Phung, B., Sun, J., Schepsky, A., Steingrimsson, E., Ronnstrand, L. C-KIT signaling depends on microphthalmia-associated transcription factor for effects on cell proliferation. PloS one. 6, e24064(2011).
  25. Grichnik, J. M., et al. KIT expression reveals a population of precursor melanocytes in human skin. J invest dermatol. 106, 967-971 (1996).
  26. Li, L., et al. Human dermal stem cells differentiate into functional epidermal melanocytes. J cell sci. 123, 853-860 (2010).
  27. Nishimura, E. K., et al. Dominant role of the niche in melanocyte stem-cell fate determination. Nature. 416, 854-860 (2002).
  28. Zur Nieden, N. I. Embryonic stem cell therapy for osteo-degenerative diseases : methods and protocols. , Humana Press. (2011).
  29. Lee, J. H., et al. high-content screening for novel pigmentation regulators using a keratinocyte/melanocyte co-culture system. Exp dermatol. 23, 125-129 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

WNT BMP EDN3SMADPO
Feeder-свободный Вывод меланоцитов из человеческих плюрипотентные стволовые клетки
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.