Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выращивают Первичный Носовые эпителиальные клетки от детей и перепрограммировать в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки

11K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53814

⸱

10 марта 2016 г.

 ,  ,  ,  , 
1Pyrosequencing Core, Cincinnati Children's Hospital, 2Division of Developmental Biology, Cincinnati Children's Hospital, 3Division of Pulmonary Medicine, Seattle Children's Hospital, 4Division of Asthma Research, Cincinnati Children's Hospital

В этой статье

Краткое содержание

В этой публикации демонстрируются методы успешного отбора проб и культивирования слизистой оболочки эпителия носа у детей, а также перепрограммирования этих клеток в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs).

Аннотация

Эпителиальные клетки носа (НЭК) — это часть дыхательных путей, которая реагирует на загрязнители воздуха и является первой клеткой, инфицированной респираторными вирусами. Они также участвуют во многих заболеваниях дыхательных путей благодаря своему врожденному иммунному ответу и взаимодействию с иммунными и стромальными клетками дыхательных путей. НЭК представляют особый интерес для исследований у детей в связи с их доступностью во время клинических визитов. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека (ИПСК) были получены из нескольких типов клеток и являются мощным инструментом для моделирования развития и болезней человека, а также для их потенциального применения в регенеративной медицине. Это первый протокол, в котором изложены методы успешного получения ИПСК из НЭК, полученных от педиатрических участников, для исследовательских целей. В ней описывается, как получить эпителиальные клетки носа у детей, как получить первичные культуры NEC из этих образцов и как перепрограммировать первичные NEC в хорошо охарактеризованные iPSCs. Образцы слизистой оболочки носа полезны в эпидемиологических исследованиях, связанных с последствиями загрязнения воздуха у детей, и являются важным инструментом для изучения заболеваний дыхательных путей. Первичные назальные клетки и полученные из них иПСК могут быть инструментом для предоставления неограниченного материала для исследований пациентов в различных областях биологии эпителия дыхательных путей, включая исследования астмы и ХОБЛ.

Введение

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки из человеческих образцов (hiPSCs) являются быстро развивающейся технологии исследований стволовых клеток. Они предлагают альтернативу эмбриональных стволовых клеток (чЭСК) исследования с гораздо меньшим количеством этических и моральных недостатков 1,2. Несмотря на то, что они не эпигенетически идентичны ЭСК 3-5, hiPSCs предлагают уникальный способ моделирования развития и болезней фенотип, и они могут быть получены из тканей , имеющих отношение к болезненному состоянию 5-8. Новые методы генерации hiPSCs постоянно изучается в целях определения оптимальных типов клеток для начала, как способ подготовки GMP качества ИПСК подходящие для трансплантации, а также для повышения оперативности и эффективности процесса перепрограммирования 6,9-11.

Эпителиальных клеток дыхательных путей имеют решающее значение в развитии аллергического воспаления 12, и эпителий является основной движущей силой аллергических реакций и ремоделирования дыхательных путей через взаимодействие с Immunе и стромальных клеток. Эпителий дыхательных путях играет существенную роль в возникновении и настойчивости легочных заболеваний, таких как астма. Тем не менее, нижних дыхательных путей эпителиальные клетки трудно получить в клинической практике, особенно у здоровых пациентов контрольной группы и детей. Данные нескольких исследований подтверждают предположение , что эпителиальные клетки слизистой оболочки носа являются действительным и практичным прокси - сервер для нижних дыхательных путей эпителиальных клеток 13-20, особенно при изучении ответов на загрязнителей воздуха и аллергенов. Слизистую оболочку носа состоит из более чем 90% ресничная эпителиальных клеток дыхательных путей и отбор проб эти носовые эпителиальные клетки (НИКС) могут быть легко выполнены в детей в возрасте четырех лет или пять, так как она является менее инвазивным, чем другие методы отбора проб клеток / тканей и связано с минимальным риском развития побочных эффектов , таких как инфекции 20-23. Он предлагает быстрый и простой способ попробовать как здоровых, так и больных детей, оставшихся без длительного, ненужного, и часто болезненного бронхоскопии процедуры, применяемыеРез, которые требуют седации. Предыдущие исследования показали , что болезнь подтипы , связанные с тяжестью астмы можно выделить как в слизистой оболочке носа, а также образцы бронхиальных клеток , взятых у детей , страдающих астмой, и экспрессия генов между этими двумя типами тканей была одинаковой в примерно 90% не повсеместным генов 22 , 24. В качестве источника для ИПСК, НПВ, имеют преимущества перед другими часто используемыми типами клеток. Фибробласты часто используются для генерации иПСК, но хотя эти клетки могут легко быть выращены из биопсии кожи, этот процесс обычно требует местной анестезии, надрез, и шовные материалы, и связано с некоторым риском инфицирования. Таким образом, получения информированного согласия пациентов для этого типа биопсии может быть трудно 25. Одной из альтернатив фибробластов является мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС). Тем не менее, это может быть трудно получить достаточное количество крови для генерации иПСК от педиатрических больных. Кроме того, существуют ограничения нижнего течения ардля фибробластов складки и производных ИПСК клеток крови, в особенности их дифференциации способности к определенным типам клеток 5,26. Поэтому, учитывая относительную доступность и низкий риск побочных эффектов после их сбора, НИКС представляют собой идеальный источник клеток для генерации иПСК из педиатрической популяции.

иПСК получили много внимания в последнее время в качестве платформы для изучения развития человеческого потенциала, создавая новые модели заболеваний, и как потенциальный источник клеток для персонализированной терапии. Перед тем как полный потенциал этой технологии могут быть реализованы, молекулярные основ процесса перепрограммирования должны быть выяснены, но сейчас этот протокол и процедуры, изложенные в поясняют исследования исследований, направленных на дыхательных путях воздействия, а также обеспечить платформу для изучая эффекты персонализированной медицины с участием иПСК.

Совместная работа нескольких лабораторий привела к Generatioп успешной методики не только отбор проб слизистой оболочки носа, но и культивированием НИКС и перепрограммирования эти клетки ИПСК 23. В данной статье приводится краткое описание протокола для оптимального отбора образцов, культивирования и условий перепрограммирования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Следующий протокол следует рекомендациям институтов человеческого комитета по этике.

1. Отбор проб слизистой оболочки полости носа

Примечание: Получение образцов из предметов, которые являются свободными от признаков респираторной вирусной инфекции.

  1. Приготовьте 15 мл коническую свежим перед участником визита и добавляют 2 мл BEGM (бронхиальные эпителиальные ростовая среда Cell) плюс 20 мкл стерильной Пенна / Стрептококковое / Fungizone (P / S / F), (0,01%).
  2. Открыть цитологии кисти непосредственно перед тем как взять пробу, и не забудьте сохранить кисть стерильной и не прикасайтесь к нему любых поверхностей, кроме носовых поверхностей.
  3. Попросите участников, чтобы сидеть неподвижно и наклонить голову в сторону потолка. Есть меньше или больше беспокойных детей сидеть на руках и / или лежа, чтобы избежать прихлопнул смахнуть.
  4. Цель кисти на задней части носа, где проход суживается (выглядит как небольшая черная дыра). Вставьте щетку вниз и скрутить запястья, как щетка удалена из Nostriл.
  5. Поместите щетку в конической и погрузить в BEGM. Отрежьте лишнюю кисть и заменить крышку на трубе. НЕ VORTEX.
    Примечание: Если участник желает, получить вторую кисть таким же образом, но во втором ноздрю. Получение чистить щеткой обе ноздри приведет к более высокой вероятности того, что выборка будет успешным. Выборка же ноздрю может привести к кровотечению и не будет, вероятно, улучшит образец.
  6. Хранить образцы как можно ближе к 37 ° С, как это возможно во время транспортировки, используя химический стакан с теплой водой.

2. Сотовый граф и Cytospin

  1. Аккуратно агитировать щетку в BEGM и возьмите 10 мкл образца для подсчета клеток с использованием гемоцитометра. Добавьте 10 мкл живого / мертвого пятна и рассчитывать только живые клетки под микроскопом.
  2. Принимать по 50 мкл образца и разбавляют до 200 мкл с помощью 1х PBS. Добавить в цитоспина воронку, присоединенную к стеклу и спина при 300 оборотах в минуту в течение 2 мин. Пусть скользят сухой O / N и морилки слайд followinИнструкция г изготовителя. Дайте высохнуть O / N, предпочтительно в темноте.
  3. Пятно слайдов с Хема 3 Stain
    1. Передача каждого раствора (Хема закрепитель, светло-голубой, Хема 3 Решение I, розовый, и Хема 3 Раствор II, темно-синий) в окрашивании блюдо; Хранить покрыты когда он не используется. Вставьте слайды в слайд окрашивания лодки
    2. Dip слайды непрерывно в фиксаторе в течение 30 секунд, затем дайте стечь избыток. Dip непрерывно скользит в растворе I в течение 30 секунд, затем дайте стечь избыток. Dip слайды непрерывно в растворе II в течение 30 секунд, затем дайте стечь избыток
    3. Полоскание деионизированной водой, пока вода не станет чистой. Дайте высохнуть O / N, предпочтительно в темноте
  4. Посмотрите на слайд под микроскопом и количества клеток, определяют процент эпителиальных клеток. Должно быть 90% или больше, если выборка хорошо.

3. Посев клеток

Примечание: Выполнить все процедуры клеточной культуры в правильной и сертифицированной культуре тканикапюшон с использованием стерильной техники.

  1. Coat пластины с бычьим коллагеном (Кожное BDC), тип 1. Добавить 0,5 мл 3 мг / мл НМТ разводили в 49,5 мл 1x PBS. Подготовьте менее, если будет использоваться только несколько пластин. Шерсть Т25 колбу с 2 мл НМТ и инкубировать в стерильных капот O / N или при температуре 37 ° С в течение 2 ч, при необходимости.
  2. После инкубации, аспирация оставшуюся жидкость. Expose колб УФ-светом в течение 30 минут в стерильных капот. Храните колбах на срок до одного месяца при 4 ° С, но довести их до комнатной температуры или 37 ° C перед посевом клеток.
  3. Держите щетку и клетки в BEGM при 37 ° С до готовности семян. Аккуратно взмах кисти внутри конической, но не вихря.
    1. Пластина 7 × 10 5 клеток в T25 колбу. Если есть меньше, использовать меньший контейнер, например, одну лунку 6-луночного планшета. Этот размер пластины требуется около 3 х 10 5 клеток.
      Примечание: Если нет этого многие клетки, не рекомендуется продолжать.
  4. Под капотом стерильной, возьмите щетку из трубки и геntly повернуть кисть на поверхности колбы с покрытием, соблюдая осторожность, чтобы не поцарапать покрытие. Выбросьте щетку в соответствующий контейнер для биологически опасных отходов.
  5. Медленно пипетку оставшиеся клетки в BEGM из конической и в T25 колбу. Обратите внимание на клетки под микроскопом. Будет наблюдаться ряд плавающих клеток и может быть некоторый мусор из носа, что приемлемо на данном этапе (рисунок 3 , а ).

4. Культура клеток

  1. После посева клеток, пусть они оседать в течение 48 часов без нарушения работы (рисунок 3). Через 48 ч медленно и осторожно добавляют 2 мл теплой BEGM и 20 мкл стерильной бензилпенициллин / стрептомицин / Fungizone (P / S / F).
    ПРИМЕЧАНИЕ: НЕ аспирация оригинал 2 мл среды.
  2. На 4 - й день после посева, тщательно аспирата всю жидкость, и заменить 4 мл свежей, подогреваемые BEGM плюс 1x Pen / Strep (Fungizone больше не требуется). Изменение среды каждые два дня и оценить клетки для присоединятьния, роста и слияния. Когда клетки достигают ~ 80% слияния, как правило, через 2-3 недели, они будут готовы к пассировать.
  3. Одна T25 колбу (около 2,5 х 10 6 клеток , когда сливная) могут быть пассировать на три колбы Т25 или Т75 одной колбе. После первого прохода, клетки должны быть прочными и здоровыми, достигая впадения примерно каждые три дня.

5. пассирования клетки

  1. Аккуратно аспирата носитель из пластины. Добавить 1 мл 0,05% раствора трипсина на T25 колбу на пластине и место в инкубаторе в течение примерно 4 мин, или до тех пор, пока клетки не отделяются от пластины. Проверьте уровень отрыва клеток каждые 2 мин и не оставляют трипсина на дольше, чем 10 мин.
  2. Добавьте 5 мл трипсин нейтрализующим раствором (TNS) или сыворотки, содержащей носитель для нейтрализации фермента. Удалите всю жидкость и клетки из колбы и поместить в 15 мл коническую трубку.
  3. Центрифуга при 200g (ускорение 0 замедления 0) в течение 5 мин, чтобы получить клеточный осадок. Отберите supernaTant и ресуспендирования клеток в BEGM + P / S в объеме, требуемом для новых флаконах (4 мл для T25 колбу, 10 мл для T75 колбу)
  4. Выполните подсчет клеток с живой / мертвой пятно, как описано выше (2.1). Добавьте соответствующее количество BEGM и клеток в колбы с покрытием и возвращают в инкубатор. Поддерживать как подробно описано выше , или в криоконсервируют замораживания среды (70% BEGM, 20% FBS и 10% ДМСО) в концентрации 0,5-2 х 10 6 клеток на мл.

6. Перепрограммирование для ИПСК

Примечание: Перед созданием ИПСК, обеспечить соблюдение всех институциональных положений, регулирующих формирование и использование человеческих ИПСК. Стерильный метод особенно важен для IPSC культур, так как питательная среда обычно не содержит антибиотики. Крайне важно, чтобы НПВ кажутся здоровыми и робастно пролиферативная для успешного перепрограммирования.

  1. Пластина 5 × 10 5 НИКС на лунку 6 скважин тканевой культуры планшета. Через 24 часа, добавляют полибренчтобы BEGM до конечной концентрации 8 мкг / мл и трансдукции ИЭС путем добавления лентивирусов частиц, выражающих Oct4, Sox2, Klf4, C-Myc к средствам массовой информации. Цель добиться множественности инфекции (MOI) от 5 ~ 27.
    1. Для определения MOI, готовят серийные разведения концентрированного-лентивирусов запаса и преобразовывают HT1080 клетки с этими разведений. После первого недвусмысленно обнаружения экспрессии dTomato в HT1080 клетках, вычисляют количество "трансдуцирующих единиц / мл", забив количество dTomato-позитивных клеток / небольшие скопления клеток в каждом разведении.
      Примечание: Как правило, там будет разведений, которые слишком высоки (все dTomato положительный) и слишком низкая (ни один или только несколько положительных клеток).
    2. Выполните скоринг из разведений, в котором зафиксировано дискретные положительных клеток / маленькие комочки клеток. Определить титр путем коррекции количества трансдукции ед / мл с соответствующим коэффициентом разбавления. MOI является то отношение числатрансдуцированных клеток к количеству вирусных частиц 27.
      Примечание: Предполагается, что каждый dTomato позитивна клетка / маленький комок возникает из одной вирусной частицы.
  2. Около 3 ч после трансдукции, удалите материал и замените свежим BEGM. Откажитесь Лентивирус содержащих носитель с помощью институционально утвержденных процедур. Возвращение трансдуцированных НИКС в инкубаторе в течение 3-х дней.
  3. На 3-й день, замените носитель свежей BEGM, а затем инкубируют еще в течение 3-х дней. Отберите провел СМИ, мыть клетки с 1x PBS и добавляют 1 мл 0,05% раствора трипсина в скважину. Прохождение клетки с помощью трипсина, как написано выше (раздел 5). Тщательно аспирата супернатант и ресуспендирования клеток в 4 мл BEGM + P / S. Клетки могут быть пассировать в новую лунку 6-луночного планшета с покрытием с НМТ, или добавляют к MEF культурам, если готов к работе (см следующий шаг).
  4. Подготовка MEF пластин с покрытием. На 4-й день добавляют 0,1% раствор желатина (1 мл / лунку) 2 лунки 6 скважины (для выполнения +/- Thiazovivin (SPT) см шаг 6.6). На следующийдень оттепели флакон инактивированных MEFs 28.
  5. Поместите MEFs в 10 мл MEF сред (DMEM + 1x NEAA + 10% dFCS). Спин при 200g в течение 5 минут, чтобы осадить. Ресуспендируют в MEF СМИ. Отберите желатин из 6 - луночного планшета и добавить 1,87 х 10 5 MEFs на лунку желатин покрытием 6 - луночный планшет. Выдержите O / N при 37 ° С, или в течение минимум 24 часов.
  6. Передача 2 мл BEGM содержащих трансдуцированных клеток на лунку в 2 лунки предварительно покрытой пластины 6 и инкубировать O / N. На следующий день, замените BEGM 2,5 мл на лунку стандартных средах, содержащих чЭСК 4 нг / мл основного фактора роста фибробластов. Поток клеток свежей чЭСК СМИ +/- SPT ежедневно в течение 10 дней
    Примечание: Можно добавить коктейль из малых молекул (SB431542, PD0325901 и Thiazovivin (SPT) коктейль) для повышения эффективности и кинетики перепрограммирования для ИЭС 23.
  7. Через десять дней, продолжают кормить ежедневно с использованием чЭСК СМИ без СПТ. Кормите культур ежедневно до чЭСК подобных колонийпоявляются (рисунок 5A, P0 колонию). Определить колонии, несущие предположительные ИПСК их высокой ядра: цитоплазматический соотношение и выраженными ядрышками.
  8. Вручную акцизные и переноса колоний с чЭСК морфологией к отдельным скважинам для культуры и расширения в виде отдельных линий в фидерной системе без. Вырезанные колонии должны быстро адаптироваться к этим условиям.
    1. После того, как гальванических вырезают колоний эти дискретные мнимые линии IPSC в настоящее время считаются канал 1 (p1). Кормовые культуры ежедневно с mTeSR1. Прохождение и расширение IPSC линий с использованием стандартных процедур. Это может занять несколько дней до недели для p1 колонии достигают размеров, при которых они должны быть пассировать.

7. Поддержание ИПСК в культуре

  1. Корма и оценки культур ежедневно. Вручную акцизные зоны выставляется откровенного дифференциацию путем соскоба со стерильной стеклянной пипетки или микро кончика пипетки. Изменение средств массовой информации после ежедневного сбора.
  2. Прохождение клетки после того, как приближенииДЕТАЛЬ каждые четыре дня: Осторожно аспирата СМИ, добавляют 1 мл теплой диспазу (1 мг / мл) на лунку 6-луночного планшета (половина объема кормления), а затем инкубировать при температуре 37 ° С в течение примерно 4 мин. Края колоний начнут поднимать, который выглядит как белый контур вокруг колонии. Аккуратно аспирата диспазу и промыть 3 раза с подогреваемой DMEM / F12.
  3. Добавьте 2 мл mTeSR1 и использовать мобильный подъемник для подъема колоний от пластины. Используйте 5 мл серологические пипетки или P1000 микропипетки осторожно растирают клетки, пока колонии не будут разбиты на более мелкие кластеры.
    1. Избегайте производить очень маленькие группы или отдельные клетки, а выживание и последующее распространение будет неоптимальным. При повторном металлизированный колонии, 1: с 4 до 1: 6 сплит будет поддерживать оптимальную плотность колоний. Осторожно удалите колонии и среды от плиты и добавить новые, покрытые матригелем скважин.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Начальная часть носа, называется преддверия носа, является область окружена хряще 29. Кисть должна идти гладко мимо этой области носа, за носового клапана (устьем Internum, или "черную дыру" видели в задней части НАРЭ), и образец получается из нижней носовой раковины (рис 1). Носовых раковинах костные структуры , которые увеличивают площадь поверхности носа 29, что делает их идеальным местом для отбора проб. В районе также выстлана васкуля...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Носовые эпителиальные клетки (НПВ) являются доступными платформой для изучения заболеваний дыхательных путей, а также NEC-иПСК предлагают захватывающий авеню , чтобы исследовать развитие болезни, лечение и терапию 1,31,32. НИКС могут быть легко получены без стрессовых или потенциально вредных процедур 6,23. По нашему опыту, отбор проб слизистой оболочки носа, как описано в данном протоколе, как представляется, менее напряженным и лучше воспринимается, чем сбор крови для детей. Таким образом, этот м...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Авторы хотели бы отметить плюрипотентных стволовых клеток Facility и конфокальной микроскопии керн при Детской больницы Цинциннати. Эта работа была поддержана R21AI119236 (HJ), R21AI101375 (HJ), NIH / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ), U19 AI070412 (HJ) и 2U19AI70235 (GKKH).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
15 мл коническийFisher Scientific14-959-49DШаг 1.1.
BEGMLonzaCC-3170Протокол Step 1.1.
Penn/Strep/Fungicide LifeTechnologies15240-062Протокол Шаг 1.1.
Penn/StrepLife Technologies15140-122Протокол Шаг 4.a.
цитологическая щетка cytosoftFisher Scientific22-263-357Протокол Шаг 1.2.
трипановый синийFisher ScientificMT-25-900-CIпротокол Шаг 2.1.
гемацитометрFisher Scientific02-671-54Протокол Шаг 2.1.
PBSFisher ScientificBP2438-4Протокол Шаг 2.2.
Цитологическая воронка ClipsFisher Scientific10-357Протокол Шаг 2.2.
Воронка цитоспинаFisher Scientific23-640-320Протокол Шаг 2.2.
Cytospin 4Fisher ScientificA78300003протокол Шаг 2.2.
пустой предметный листFisher ScientificS95933Протокол Шаг 2.2.
Набор для окрашивания hema 3Fisher Scientific22-122-911Протокол Шаг 2.2.
Коровий дермальный колаген, тип 1Life TechnologiesA1064401протокол Шаг 3.2.
Колба Т25Fisher Scientific08-772-45Протокол Шаг 3.3.
ТрипсинЛонзаСС-5012Протокол Шаг 5.2.
Нейтрализующий трипсин растворLonzaCC-5002протокол Шаг 5.2.
Фетальная бычья сыворотка (FBS), термически стерилизованная при 65 °° C в течение 30 минпротокол Sigma-AldrichF2442Шаг 5.5.
Диметилсульфоксид Hybri-Max™, стерильно-фильтрованный, биореагент, подходит для гибридом, ≥ 99,7%Sigma-AldrichD2650Протокол Шаг 5.5.
полицистоновый лентивирус*например MilliporeSCR511Protocol Step 6.4. 
Указан коммерческий источник вектора перепрограммирования. Мы обычно используем плазмиду 4-в-1, описанную Voelkel et al. (PMID: 20385817), для получения полицистронного лентивируса с псевдотипированием VSV-G. Эту плазмиду можно получить, обратившись в  
полибренСанта Круз Биотехнологияsc-134220Протокол Шаг 6.4.
Облученные CF1 MEFsGlobalStem Протокол GSC-6301G, шаг 6.4.
Смотритерецепт, включенный в протоколШаг 6.11.
SB431542Stemgent04-0010Протокол Шаг 6.11.
PD0325901Stemgent04-0006Протокол Шаг 6.11.
Тиазовивин Stemgent04-0017Протокол Шаг 6.11.
Сертифицированный hESC MatrigelBD Biosciences354277Протокол Шаг 6.13.
Пластина Corning, 6 лунокFisher Scientific08-772-1BПротокол Шаг 6.13.
Протокол mTeSR1StemCell5850Шаг 6.13.
Одноразовая фильтрующая колба 250 мл (0,22 &; m)FisherSCGP-U02-RE 
dispalyStemCell7923Protocol Шаг 7.3.
DMEM/F12Life Technologies11320-033Протокол Шаг 7.3.
клеточный подъемникFisher Scientific08-100-240Протокол Шаг 7.4.
Компоненты hESC Media**Протокол Шаг 6.11.
должны быть смешаны, а затем стерилизованы фильтром. Носители могут храниться при температуре 4 и °°; C на срок до двух недель. При разогреве сред не оставляйте при 37°°; C длиннее 15 мин
DMEM-F12 50/50 средаInvitrogen  11330-032Окончательная концентрация
KO заместительная сыворотка (KO-SR)Invitrogen10828-0280,2
200 мМ L-глутаминInvitrogen25030-0811 мМ
55 мМ ß-меркаптоэтанолInvitrogen21985-0230,1 мМ
100x заменимые аминокислотыInvitrogen11140-0501x
2 &; г/мл Основной фактор роста фибробластов (b-FGF)Invitrogen13256-0294 нг/мл
протокол

Ссылки

  1. Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell stem cell. 10 (6), 678-684 (2012).
  2. Boulting, G. L., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  4. Guenther, M. G., et al. Chromatin structure and gene expression programs of human embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell stem cell. 7 (2), 249-257 (2010).
  5. Polo, J. M., et al. Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 28 (8), 848-855 (2010).
  6. Ono, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector. PloS one. 7 (8), e42855(2012).
  7. Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
  8. Brennand, K. J., et al. Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells. Nature. 473 (7346), 221-225 (2011).
  9. Mou, H., et al. Generation of multipotent lung and airway progenitors from mouse ESCs and patient-specific cystic fibrosis iPSCs. Cell stem cell. 10 (4), 385-397 (2012).
  10. Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. Science. 322 (5903), 945-949 (2008).
  11. Huangfu, D., et al. Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds. Nat Biotechnol. 26 (7), 795-797 (2008).
  12. Kuperman, D. A., et al. Direct effects of interleukin-13 on epithelial cells cause airway hyperreactivity and mucus overproduction in asthma. Nat Med. 8 (8), 885-889 (2002).
  13. Braunstahl, G. J., et al. Segmental bronchoprovocation in allergic rhinitis patients affects mast cell and basophil numbers in nasal and bronchial mucosa. American journal of respiratory and critical care medicine. 164 (5), 858-865 (2001).
  14. Compalati, E., et al. The link between allergic rhinitis and asthma: the united airways disease. Expert review of clinical immunology. 6 (3), 413-423 (2010).
  15. Crimi, E., et al. Inflammatory and mechanical factors of allergen-induced bronchoconstriction in mild asthma and rhinitis. Journal of applied physiology. 91 (3), 1029-1034 (2001).
  16. Djukanovic, R., et al. Bronchial mucosal manifestations of atopy: a comparison of markers of inflammation between atopic asthmatics, atopic nonasthmatics and healthy controls. The European respiratory journal : official journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology. 5 (5), 538-544 (1992).
  17. Gaga, M., et al. Eosinophils are a feature of upper and lower airway pathology in non-atopic asthma, irrespective of the presence of rhinitis. Clinical and experimental allergy : journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. 30 (5), 663-669 (2000).
  18. Hurst, J. R., Wilkinson, T. M., Perera, W. R., Donaldson, G. C., Wedzicha, J. A. Relationships among bacteria, upper airway, lower airway, and systemic inflammation in COPD. Chest. 127 (4), 1219-1226 (2005).
  19. Gaga, M., V, A. M., Chanez, P. Upper and lower airways: similarities and differences. European respiratory monograph. 18, 1-15 (2001).
  20. Lopez-Guisa, J. M., et al. Airway epithelial cells from asthmatic children differentially express proremodeling factors. J Allergy Clin Immunol. 129 (4), 990-997 (2012).
  21. Doi, A., et al. Differential methylation of tissue- and cancer-specific CpG island shores distinguishes human induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells and fibroblasts. Nature genetics. 41 (12), 1350-1353 (2009).
  22. Poole, A., et al. Dissecting childhood asthma with nasal transcriptomics distinguishes subphenotypes of disease. J Allergy Clin Immunol. , (2014).
  23. Ji, H., et al. Dynamic transcriptional and epigenomic reprogramming from pediatric nasal epithelial cells to induced pluripotent stem cells. J Allergy Clin Immunol. 135 (1), 236-244 (2015).
  24. Guajardo, J. R., et al. Altered gene expression profiles in nasal respiratory epithelium reflect stable versus acute childhood asthma. The Journal of allergy and clinical immunology. 115 (2), 243-251 (2005).
  25. Yamanaka, S. Patient-specific pluripotent stem cells become even more accessible. Cell Stem Cell. 7 (1), 1-2 (2010).
  26. Kim, K., et al. Donor cell type can influence the epigenome and differentiation potential of human induced pluripotent stem cells. Nature. 29 (12), 1117-1119 (2011).
  27. Warlich, E., et al. Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming. Mol Ther. 19 (4), 782-789 (2011).
  28. Wicell. Wicell Feeder Based (MEF) Pluripotent Stem Cell Protocols. , (2003).
  29. Harkema, J. R., Carey, S. A., Wagner, J. G. The nose revisited: a brief review of the comparative structure, function, and toxicologic pathology of the nasal epithelium. Toxicol Pathol. 34 (3), 252-269 (2006).
  30. Allegrucci, C., Young, L. E. Differences between human embryonic stem cell lines. Hum Reprod Update. 13 (2), 103-120 (2007).
  31. Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
  32. Pasca, S. P., et al. Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome. Nature medicine. 17 (12), 1657-1662 (2011).
  33. Lai, P. S., et al. Alternate methods of nasal epithelial cell sampling for airway genomic studies. J Allergy Clin Immunol. , (2015).
  34. Shi, Y., et al. A combined chemical and genetic approach for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 2 (6), 525-528 (2008).
  35. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature. 8 (5), 409-412 (2011).
  36. Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, (2015).
  37. Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).
  38. Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nature biotechnology. 30 (9), 876-882 (2012).
  39. Marchetto, M. C., et al. Transcriptional signature and memory retention of human-induced pluripotent stem cells. PloS one. 4 (9), e7076(2009).
  40. Nukaya, D., Minami, K., Hoshikawa, R., Yokoi, N., Seino, S. Preferential gene expression and epigenetic memory of induced pluripotent stem cells derived from mouse pancreas. Genes Cells. 20 (5), 367-381 (2015).
  41. Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. 'Epigenetic memory' phenomenon in induced pluripotent stem cells. Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).
  42. Bar-Nur, O., Russ, H. A., Efrat, S., Benvenisty, N. Epigenetic memory and preferential lineage-specific differentiation in induced pluripotent stem cells derived from human pancreatic islet beta cells. Cell Stem Cell. 9 (1), 17-23 (2011).
  43. Jandial, R., Levy, M. L. Cellular alchemy: induced pluripotent stem cells retain epigenetic memory. World Neurosurg. 75 (1), 5-6 (2011).
  44. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  45. Ohi, Y., et al. Incomplete DNA methylation underlies a transcriptional memory of somatic cells in human iPS cells. Nat Cell Biol. 13 (5), 541-549 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

hESCMEF
Выращивают Первичный Носовые эпителиальные клетки от детей и перепрограммировать в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.