Методическая статья

Оптический контроль нейронального белка с использованием генетически кодируемой искусственную аминокислоту в нейронах

DOI:

10.3791/53818

⸱

28 марта 2016 г.

 ,  , 
1Department of Neuroscience, School of Medicine, Tufts University, 2Molecular Neurobiology Laboratory, The Salk Institute for Biological Studies, 3Department of Pharmaceutical Chemistry and the Cardiovascular Research Institute, University of California, San Francisco

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь представлена процедура селективной активации нейронального белка коротким импульсом света путем генетического кодирования фотореактивной неестественной аминокислоты в целевой нейронный белок, экспрессируемый в нейронах в культуре или in vivo.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Фотостимуляция — это неинвазивный способ управления биологическими событиями с превосходным пространственным и временным разрешением. Необходимы новые методы фоторегуляции эндогенных белков, экспрессируемых в их родной среде. В этой статье мы представляем подход к оптическому контролю функции нейронного белка непосредственно в нейронах с помощью генетически кодируемой неестественной аминокислоты (Uaa). Используя ортогональную пару тРНК/аминоацил-тРНК-синтетаза для подавления янтарного кодона, фотореактивный Uaa 4,5-диметокси-2-нитробензилцистеин (Cmn) сайт-специфически встраивается в пору нейронального белка Kir2.1, внутренне выпрямляющего калиевой канал. Громоздкий Cmn физически блокирует пору канала, делая Kir2.1 непроводящим. Световое освещение мгновенно преобразует Cmn в более мелкую естественную аминокислоту Cys, активируя функцию канала Kir2.1. Мы экспрессируем эти p-хото-индуцируемые инаправленно ректирующиекалиевые (PIRK) каналы в первичных нейронах гиппокампа крыс и демонстрируем, что световая активация PIRK прекращает нейронное возбуждение из-за оттока тока K+ через активированные каналы Kir2.1. Используя внутриутробную электропорацию, мы также экспрессируем PIRK в эмбриональном неокортексе мыши in vivo, демонстрируя световую активацию PIRK в нейронах неокортекса. Генетически кодирующая Uaa не накладывает ограничений на тип целевого белка или клеточное расположение, и семейство фотореактивных Uaas доступно для модуляции различных природных аминокислотных остатков. Таким образом, этот метод может быть широко применен ко многим нейронным белкам для достижения оптической регуляции различных процессов в мозге. Текущий протокол представляет собой доступную процедуру для сложного встраивания Uaa в нейроны in vitro и in vivo для достижения фотоконтроля активности нейронных белков на молекулярном уровне.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

По сравнению с обычной электрической стимуляции, фотостимуляции обеспечивает большую временное и пространственное разрешение с минимальным вмешательством в физиологической системе образцов. Так как демонстрации использования лазеров для стимуляции нейронов в 1971 году 1, многие творческие пути были изобретены , чтобы экзогенно контролировать активность нейронов с помощью света. Оптический выпуск photocaged агонистов уже давно используется для изучения физиологической реакции нейронной сети для лигандов 2,3,4. Этот метод имеет ограниченную специфичность за счет диффузии проарретированных агонистов. Генетическая специфичность достигается за счет эктопически , выражающих светочувствительных Opsin каналов и насосов 5,6,7, и он был успешно применен для модуляции выбранных нейронных сетей в различных модельных организмах. Тем не менее, было бы трудно применить этот метод к оптически контролировать различные другие нейронные белки, так как прививка photoresponsiveness из Opsin белков с другими белками would требуют интенсивного инженерии, которые могут изменить естественные свойства белка в исследовании. Химически привязывать экзогенный светочувствительная лиганда с белком показал еще один способ контролировать функциональность канала белков 8,9,10. Лиганд представлен или выведены из сайта связывания белка через фотоизомеризации азобензола фрагмента. Привязывание химии ограничивает применение главным образом к внеклеточной стороне мембранных белков, за исключением внутриклеточную сторону и внутриклеточных белков.

Фоточувствительных УААН, после того, как включаются в белки, обеспечивают общую стратегию манипулирования белки со светом. В начале усилий, химически тРНК ацилируют с photocaged УААН были микроинъекции в ооциты Xenopus включать УААН в мембранных рецепторов и ионных каналов 11, которые продвинули понимание их структурно-функциональных отношений 12,13,14.Этот микроинъекции подход в основном ограничивается крупными ооцитов. Генетическое введение в UAA минует технически сложной ацилирования тРНК и микроинъекции с использованием ортогонального тРНК / синтетазы пару, которая включает в UAA через эндогенного трансляции белков в живых клетках 15,16,17,18. Uaa включение в нейрональных белков было продемонстрировано в первичных нейронов и нервных стволовых клеток 19,20. Совсем недавно, фоточувствительных Uaa генетически включены в нейрональных белка в головном мозге млекопитающих в естественных условиях в первый раз 21. Эти достижения позволяют изучать нейронные белки с УААН в их родной клеточной среде.

Внутренне выпрямления калиевого канала Kir2.1 сильный выпрямитель , который проходит K + токи более легко , чем в из клетки, и это имеет важное значение в регуляции физиологических процессов , в том числе возбудимости клеток, сосудистого тонуса, частоты сердечных сокращений, повторноеNAL поток соли и инсулин - релиз 22. Сверхэкспрессия Kir2.1 hyperpolarizes мембранного потенциала мишени нейрона, который становится менее возбудимой 23,24. Для того, чтобы оптически контролировать Kir2.1 в своих родных клеток, Кан и др. Генетически заложенная фото реагирующих Uaa в Kir2.1 экспрессируется в клетках млекопитающих, нейронов и эмбриональных мозга мыши 21. Краткий импульс света был способен преобразовывать UAA в природной аминокислоты цистеина, таким образом, активации целевого Kir2.1 белка. Когда было высказано это фото-индуцируемый белок канала внутрь выпрямления калия (Pirk) в гиппокампа крысы первичных нейронов, она подавлена ​​нейронов стрельбы в ответ на световой активации. Кроме того, было выражено канал Pirk в эмбриональном неокортекса мыши, и измеряли свет активированного Pirk тока в корковых нейронов. Успешное внедрение технологии UAA в естественных условиях в головном мозге млекопитающих открывает дверь в оптически контролировать нейронные белкив их родной среде, что позволит оптической рассечение нейрональных процессов и механизмов на молекулярном уровне.

В этом протоколе мы опишем процедуры генетической включения УААН в первичных нейронов в культуре , так и в эмбриональном мозге мышей в естественных условиях. Фоточувствительных Uaa Cmn и Kir2.1 используются для иллюстрации процесса. Методы оценки успешного UAA включения и оптический контроль нейрональной активности белка предусмотрены. Этот протокол обеспечивает четкое руководство генетически кодирующий УААН в нейронах и в естественных условиях, а также оптически регулирующие функции нейронов белка с помощью фоточувствительных UAA. Мы ожидаем , что этот протокол для содействия принятию технологии UAA в естественных условиях для нейробиологии и оптогенетика биологических исследований.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры в данном исследовании были проведены с использованием Institutional Уход за животными и использование комитета (IACUC) утвердил протоколы для обработки животных на Солка института биологических исследований, La Jolla, CA.

1. Uaa Включение в Kir2.1 и экспрессия результирующей Pirk в первичной культуре нейронов

  1. ДНК Строительство
    1. Выберите целевой сайт Kir2.1 для UAA включения. Exploit предварительных знаний и информации о структуре и функции Kir2.1, так что выбранный сайт с фоточувствительных UAA Инкорпорейтед позволяет оптической модуляции Kir2.1 функции 21.
    2. Построить рекомбинантный ген Kir2.1 ДНК, кодирующей с выбранного участка мутантного к TAG янтарного стоп-кодона. С помощью стандартных методов клонирования 25 для клонирования ДНК Kir2.1-TAG в плазмиды экспрессии млекопитающего.
    3. гены / синтетазы Клон т-РНК, которые являются специфическими для UAA и введения UAA в ответ наТКГ стоп - кодон в другой экспрессии млекопитающих плазмидной 21.
      Примечание: Для получения оптимального UAA включения, различные промоторы и комбинации генов кассет (для тРНК, синтетазы и Kir2.1) могут быть испытаны в различных плазмид.
    4. Получение высокого качества с использованием плазмидных ДНК минипрепаративную или maxiprep коммерческих наборов в соответствии с протоколом производителя. Около 1,9 соотношения 260/280 является оптимальным для очищенной ДНК. При необходимости выполнения электрофореза в агарозном геле , чтобы проверить чистоту ДНК 25 нацелен. Суперспиральная плазмидные ДНК с высокой степенью чистоты являются лучшими для нейронного трансфекции.
  2. Культура гиппокампа крысы Первичная Нейроны
    1. Место покровные стекла (круги, 12 мм в диаметре) в 24-луночных планшетах, один покровное на каждую лунку и пальто каждую лунку 250 мкл 0,5 мг / мл поли-D-лизином (в 100 мМ боратного буфера: 1,24 г Борна кислоты и 1,90 г тетраборат натрия в 400 мл деионизованной дистиллированной H 2 O или DDH 2 О при рН 8,5) в течение более 10 часов при комнатной температуре, запечатанный. Приготовьте около 10-12 покровные покрытые за щенком.
    2. В день вскрытия, собирать неонатальные мозги от послеродовых крысят (1-4 день после рождения) после того, как обезболивающее их с изофлуран и обезглавливание. Обезболить щенкам в обезболиванием камере, содержащей изофлуран (2-4%). Подождите, пока они не теряют сознание и не реагируют на тактильные раздражители и защемление лап.
    3. С помощью стандартной методики 26, рассекают гиппокампа из мозга в теплой (~ 37 ° С) физиологический раствор (10 мМ HEPES и 20 мМ D-глюкозы добавили в сбалансированном солевом растворе Хэнкса), и собирают гиппокампа в коническую пробирку с 4,5 мл теплого солевого раствора ,
    4. Добавьте 500 мкл 2,5% трипсина в гиппокампе (0,25% конечная концентрация трипсина), и инкубируют в течение 10 мин на водяной бане при 37 ° С.
    5. Тщательно промойте ткань с солевым раствором (3 х 10 мл), и измельченного в порошок.
    6. Восстановление диссоциированного нейронов в 1 мл шСреды для выращивания рука, содержащие минимальную поддерживающую среду (MEM), дополненной 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 21,2 мМ D-глюкозы, 2 мМ L-глутамина, 2% B-27, и 0,1% сыворотки расширители.
      Примечание: Добавить L-глютамин и B-27 в день диссекции, чтобы подготовить свежую культуральную среду.
    7. Подсчитайте нейроны с помощью гемоцитометра, и пластины их на покровных стеклах в 24-луночные планшеты в количестве 1,0-1,5 х 10 5 клетки / лунку плотности с 500 мкл среды роста после того, как фильтруют через нейлоновое сито 40 мкм.
    8. Выдержите нейронную культуры при 35 ° С в 5% CO 2: 95% воздуха увлажненном термостате в течение 2-3 недель. Для достижения наилучшего результата, не тревожить культуру как можно больше во время инкубации.
  3. фосфат кальция (Ca-P) Трансфекция первичной культуры нейронов
    1. Сделать растворы и хранят при температуре 4 ° С: 0,5 М BES (N, N - бис- [2-гидрокси-этил] -2-аминоэтансульфоновая кислота) буфера (10x); 150 мМ Na 2 HPO 4 (100x); 2,8 М NaCl (10x); стерильной DDH 2 O; Стерильный 1 N NaOH.
    2. В день трансфекции, сделать свежий 2,5 М раствора CaCl 2 в DDH 2 O и стерильный фильтр с размером пор 0,22 мкм фильтр. Сделать свежий 2x БЭС-буфером (ББ) буфера , содержащего 50 мМ BES, 1,5 мМ Na 2 HPO 4, и 280 мМ NaCl при рН 7,00 (доведения рН с помощью NaOH) и стерильный фильтр с размером пор 0,22 мкм фильтр.
      Примечание: Вычислить количество раствора CaCl 2 и BBS буфере в зависимости от количества покровных для трансфекции. Также обратите внимание на 1.3.4.
    3. Замените носитель роста культуры с 500 мкл свежей подогретого питательной среды для трансфекции. (Трансфекция носители могут быть сделаны с MEM плюс 21,2 мМ D-глюкозы).
      Примечание: Не выбрасывайте старые СМИ.
    4. Рассчитать количество DDH 2 O и подготовить для добавления для того , чтобы сделать раствор для трансфекции (33 мкл на каждом покровном) , содержащую 1,65 мкл CaCl 2, 0,7 мкг ДНК, и 16,5 &# 181; л 2x BBS.
    5. Приготовьте раствор для трансфекции непосредственно перед добавлением его к культуре. Чтобы приготовить, сначала объединить CaCl 2 и DDH 2 O при медленном перемешивании трубку. Продолжить перемешивание и медленно добавляют ДНК в раствор. Наконец, добавьте 2x BBS буфера по каплям при перемешивании.
    6. Сразу же добавить 30 мкл раствора для трансфекции в каждом покровном нейронального культуры.
    7. Рок культуры блюдо несколько раз , чтобы перемешать раствор и инкубировать при 35 ° С в 5% CO 2: 95% воздуха увлажненном инкубаторе в течение 45 мин-1 час. После того, как нейроны инкубируют с раствором для трансфекции, очень тонкие Ca-P преципитаты будет формировать слой покрытия нейронов.
    8. Заменить трансфекция носитель с 500 мкл предварительно нагреты промывочным буфером (135 мМ NaCl, 20 мМ HEPES, 4 мМ КСl, 2 мМ CaCl 2, 1 мМ MgCl 2, 1 мМ Na 2 HPO 4, 10 мМ глюкозы при рН 7,3, стерильный фильтруют через фильтр 0,22 мкм) и инкубируют при температуре 356; С в 5% CO 2: 95% воздуха увлажненном инкубаторе в течение 15-20 мин. Ca-P осадки исчезнут после стадии промывки.
    9. Замените промывочный буфер с 500 мкл свежей питательной среды. Опять же, замените носитель роста с сохраненным исходного носителя.
    10. Добавьте UAA Стп (предварительно перемешанные в 50 мкл теплой питательной среды) к культуре достигнет 1 мМ конечной концентрации.
    11. Выдержите трансфи- культуры при 35 ° С в 5% CO 2: 95% воздуха увлажненном термостате в течение 12-48 ч перед анализами.
  4. Цельноклеточные Запись с помощью активации светом
    1. Подготовьте дополнительные / внутриклеточные решения. Внутриклеточный раствор содержит 135 мМ глюконат калия, 10 мМ NaCl, 2 мМ MgCl 2, 10 мМ HEPES, 1 мМ EGTA, 2,56 мМ K 2 АТФ и 0,3 мМ Li 2 ГТФ при рН 7,4. Внеклеточный раствор записи содержит 150 мМ NaCl, 3 мМ KCl, 5 мМ MgCl 2, 0,5 мМ CaCl 2, 5 мМ глюкозы, и 10 мМ HEPES при рН 7,4.
    2. Настройка электрофизиологии буровой установки для цельноклеточная патч зажима: микроскоп, оборудованный 4X и 20X целей, дифференциального интерференционного контраста (DIC) и mCitrine фильтра (возбуждение: 495/10 нм, эмиссия: 525/25 нм); манипулятор; патч-зажим усилителя; цифровой преобразователь; сбор данных и анализ программного обеспечения.
      1. Установите светоизлучающий диод (LED) с излучением 385 нм с помощью микроскопа на буровой, чтобы доставить свет координатору от 1 см в сторону под углом 45 °. Проверьте питание светодиода с легким измерителем мощности.
    3. Извлечь патч пипетки из стеклянных электродов с использованием коммерческого микропипетки съемник иметь 3-6 МОм сопротивление пипеток. Следуйте инструкциям производителя, чтобы настроить микропипетки съемник.
      1. Чтобы проверить сопротивление пипеток, сначала заполнить пипетку с внутриклеточным раствором и поместите его на держатель электрода. Dip пипетки в чашку для культивирования 35 мм, заполненную внеклеточной раствор, помещенный на предметное рlatform. Погружают заземляющий электрод в блюдо, чтобы завершить контур.
      2. Включите усилитель / дигитайзером и начать программное обеспечение для сбора данных. Монитор сопротивления пипетки с помощью контрольной мембраны протокола.
    4. Вынимают покровное культуры нейрон из инкубатора и прополоскать один раз во внеклеточном растворе. С помощью вакуумной смазки, удерживая покровное в середине чашки для культивирования 35 мм, наполненную свежим внеклеточной раствором.
    5. Поместите покровное / блюдо на электрофизиологии микроскопа платформы.
    6. Используя стандартные методы патч зажима, патч нейрон с mCitrine флуоресценции 27. Запись нейронную активность, используя текущий зажим метод (I-зажим). Во-первых, регулировать потенциал покоя до около -72 мВ, вводя небольшой ток. Затем впрыскивают шаг тока (10-200 Pa), чтобы вызвать непрерывную стрельбу (5-15 Гц) потенциалов действия.
    7. Вручную или с помощью программного обеспечения для сбора данных, флэш-импульс (грехгле импульса 100 мс -1 длительностью сек) светодиода к нейрону во время записи, и посмотреть , если потенциалы действия будут затронуты.
    8. Добавьте 0,5 мМ BaCl 2 в ванну и убедитесь, что потенциалы действия восстанавливаются.

2. Uaa Включение в Kir2.1 и экспрессия результирующей Pirk в мышиных эмбриональных мозга в естественных условиях

  1. ДНК Строительство
    1. Дизайн плазмидной ДНК так же, как на стадии 1.1. Для экспрессии в естественных условиях, используют сильный промотор , такой как ПНП (курица промотор бета-актина с CMV энхансер).
    2. Очищают ДНК с эндотоксинов maxiprep коммерческого набора в соответствии с протоколом производителя. Выполнение экстракции фенолом-хлороформом с последующим осаждением этанолом 25 для получения чрезвычайно высокого качества ДНК (сокращенную до 2-5 мкг / мкл).
  2. Внутриутробно электропорации к мышиных эмбриональных неокортекса
    Примечание: Основная технидие для внутриутробно электропорации было описано ранее 28.
    1. Обезболить приурочен беременной мыши на эмбриональной день 14,5 (E14.5) с фенобарбиталом натрия (внутрибрюшинное введение, 50 мкг на грамм массы тела) или изофлуран (ингаляции, 2-4%). Мониторинг глубины анестезии путем проверки потери сознания и не реагирует на тактильные раздражители и защемление лап.
    2. Сделайте небольшой надрез в брюшной средней линии. Осторожно разоблачить рога матки с щипцами и кончиками пальцев.
    3. Вводят около 1 мкл раствора ДНК (2-5 мкг / мкл каждой плазмиды, в зависимости от конструкции) в боковой желудочек каждого однопометница со стеклянной пипетки, вставленной через стенку матки. В большинстве случаев, около 60-80% от общего количества эмбрионов инъецируют.
    4. Электропорации эмбрионов с электропоратора (33-35 V, 50 мсек, 950 мсек интервала, 4-8 импульсов).
    5. Возвращение рога матки в брюшную полость осторожно дляCEPS и кончики пальцев. Шовный мышечную стенку, а затем кожа с хирургическим швом, чтобы позволить эмбрионы продолжать развитие.
  3. Uaa Микроинъекция
    1. Сделайте небольшой надрез в брюшной средней линии снова на E16.5, и мягко разоблачить рога матки с щипцами и кончиками пальцев.
    2. Вводят около 2-5 мкл CMN-Ala (500 мМ) до электропорации или с обеих сторон бокового желудочка со стеклянной пипеткой, вставленной через стенку матки. Для увеличения Cmn биодоступности, используйте дипептид Cmn-Ala (Cmn-аланин) , чтобы доставить Стп в естественных условиях 21.
    3. Опять же, вернуть рога матки в брюшную полость осторожно пинцетом и кончиками пальцев. Шовный мышечную стенку, а затем кожа с хирургическим швом, чтобы позволить эмбрионы продолжать развитие.
  4. Получить Острый Brain Ломтики
    1. Сделать 1 л искусственную спинномозговую жидкость (ACSF) , содержащий 119 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,3 мМ MgCl 2, 2,5 мМ CaCl 2, 1 мМ NaH 2 PO 4, 26,2 мМ NaHCO 3, и 11 мМ глюкозы при рН 7,3.
    2. Возьмите 200 мл ACSF и быстро замерзает при -80 ° С в течение 20-30 мин. Пузырь остальные ACSF с 5% CO 2: 95% O 2 газа при комнатной температуре.
    3. Подготовить и стерилизовать хирургические инструменты, чтобы собрать мозги из эмбрионов. Также приготовьте ведро льда.
    4. Сделать ~ 100 мл 4% -ного раствора агарозы с низкой температурой плавления в колбе при нагревании в микроволновой печи. Охладить раствор в течение приблизительно 5 минут, прежде чем он начинает затвердевать.
    5. Эвтаназии мыши 12-24 ч после инъекции Cmn-Ала СО 2 передозировки. Сделайте большие разрезы в брюшной области, и рассекать из электропорации / микроинъекции эмбрионов из матки с мелкими ножницами и пинцетом.
    6. Урожай головной мозг эмбрионов с мелкими ножницами и пинцетом.
    7. Поместите каждый мозг на блюдо культуры 10 см, размещенной на ведро льда. Разделить два полушария, используя острый нож, и место каждогополусфера на блюдо с среднесагиттальных плоскости касаясь дно тарелки. Быстро полить раствора агарозы над мозгом (около 500 мкл на полушарие).
    8. Используя острый нож, квадрат разрезать агарозы вокруг мозга, чтобы сделать мозг встраиваемый агарозном блок.
    9. Используя клей ткани, клей вниз Среднесагиттальная плоскую поверхность блока агарозы на горе для vibratome. Заполните vibratome камеру с предварительно охлажденным ACSF и нарезать 200 мкм сагиттальных мозга.
    10. Выдержите острые ломтики в ACSF , дополненной 3 мМ мио -inositol, 0,4 мМ аскорбиновой кислоты и 2 мМ пирувата натрия при 33 ° С в течение 42 мин при продувании с 5% CO 2: 95% O 2 газа.
    11. Через 42 мин, выключить нагреватель и продолжают инкубировать срезы при комнатной температуре с барботированием. Начало цельноклеточная ЗАПИСЬ заплату по меньшей мере, через 15 мин после выключения нагревателя.
  5. Цельноклеточные Запись с помощью активации светом
    1. Подготовка ИНТРАКellular раствор , содержащий 130 мМ глюконат калия, 4 мМ MgCl 2, 5 мМ HEPES, 1,1 мМ EGTA, 3,4 мМ Na 2 АТФ, 10 мМ креатин фосфата натрия и 0,1 мМ Na 3 ГТФ при рН 7,3 , скорректированной с KOH.
    2. Извлечь патч пипетки из стеклянных электродов с использованием коммерческого микропипетки съемник иметь 3-6 МОм сопротивление пипеток.
    3. Настройка ломтик электрофизиологии буровой установки для цельноклеточной патч зажима и переливать записи камеры с ACSF в 2 мл / мин скорости с перфузионного насоса. Отрегулируйте температуру в камере до 33 ° C.
      Примечание: Срез электрофизиологическое установка оснащена перфузионной камеры, с целью погружения в воду и регулятор температуры. Кроме того, фильтр GFP (возбуждение: 480/30 нм, эмиссия: 535/40 нм) и mCherry фильтр (возбуждение: 580/20 нм излучение: 675/130 нм) обязательны для заполнения.
      1. Установка светодиодной подсветкой с излучением 385 нм с помощью микроскопа на буровой, чтобы доставить свет координатору от 1 см в сторону под углом 45 °угол. Проверьте питание светодиода с легким измерителем мощности.
    4. Тщательно подобрать кусочек мозга со стеклянной пипетки и место в перфузионной камере. Удерживая кусочек с арфой.
    5. Патч нейрон с mCherry / GFP флуоресценции от неокортекса области 27. Pirk активность Запись с помощью зажима напряжения (метод V-зажим). Во-первых, держать мембранного потенциала при -60 мВ. Затем запись токов при фиксированных отрицательных мембранных потенциалов (-100 мВ) или пандусы напряжения (-100 мВ до +40 мВ). В частности, мониторинг Kir2.1 конкретные внутренние токи при -100 мВ.
    6. Вручную или с помощью программного обеспечения для сбора данных, флэш - импульс (один импульс 100 мс -1 длительностью сек) света СИД к нейрону во время записи, и посмотреть , если Pirk белки активируются. После того, как Pirk активируется, внутренние токи при -100 мВ, значительно возрастет.
    7. Добавьте 0,5 мМ BaCl 2 в ванну и проверить , является ли Pirk инактивируется снова.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для того, чтобы генетически включать UAA в белок в нейронах, первый важный шаг для разработки соответствующих генных конструкций для доставки и эффективно экспрессировать гены в нейронах. Существуют три генетические компоненты для UAA включения: (1) ген-мишень с тэгом янтарный стоп-кодон, введенной в выбранном месте для UAA включения (2) ортогональная тРНК признать мутировавший TAG стоп-кодон, и (3) ортогональный аминоацил -tRNA синтетазы для зарядки UAA на ортогональное тРНК. Каждый ком...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для достижения эффективного фото-модуляции, важный начальный шаг должен решить, где включить фоточувствительных UAA в белка-мишени. Структурно-функциональная информация целевого белка очень полезно, чтобы служить ориентиром при выборе возможных участков. В то же время, цель Светорегулирование бы определить, какой сайт является наиболее подходящим. После выбора кандидатов сайтов, мы рекомендуем , чтобы проверить сайты в клеточных линиях млекопитающих , таких как эмбриональной почки человека (НЕК) клеток для облегчения ку...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим доктора С. Соботу за полезную дискуссию о культуре нейронов и трансфекции Ca-P. Л.В. выражает благодарность за поддержку со стороны The Salk Innovation Grant, Калифорнийского института регенеративной медицины (RN1-00577-1) и Национальных институтов здравоохранения (1DP2OD004744).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Чехол Очки, круги, 12 мм, толщина 0,13-0,17 ммCarolina Biologicals633029
Corning BioCoat Poly-D-лизинCorning Discovery Labware354210
D-(+)-раствор глюкозыSigma-AldrichG8769
Ирис Шпательизогнутый Fine Science Tool10092-12
Нож для препарирования - тонкий угловой кончикFine Science Tool10056-12
GlutaMAX-I SupplementLife Technologies35050-061
MITO+ Усилитель сывороткиBD Biosciences355006
Falcon 40 µ m Клеточный фильтрCorning Life Sciences352340
BES (N,N-Bis(2-гидроксиэтил)-2-аминоэтансульфоновая кислота, N,N-Bis(2-гидроксиэтил)таурин)Sigma-AldrichB6420
СВЕТОДИОДНЫЙ ИСТОЧНИК СВЕТА – Черный светодиод 385Prizmatix Ltd.
Агароза, низкая температура плавления, аналитический классPromegaV2111

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fork, R. L. Laser Stimulation of Nerve Cells in Aplysia. Science. 171 (3974), 907-908 (1971).
  2. Callaway, E. M., Katz, L. C. Photostimulation using caged glutamate reveals functional circuitry in living brain slices. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (16), 7661-7665 (1993).
  3. Cambridge, S. B., et al. Doxycycline-dependent photoactivated gene expression in eukaryotic systems. Nat. Methods. 6 (7), 527-531 (2009).
  4. Yoshimura, Y., Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Excitatory cortical neurons form fine-scale functional networks. Nature. 433 (7028), 868-873 (2005).
  5. Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends Cogn. Sci. 15 (12), 592-600 (2011).
  6. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34 (1), 389-412 (2011).
  7. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  8. Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. Nat. Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).
  9. Volgraf, M., et al. Allosteric control of an ionotropic glutamate receptor with an optical switch. Nat. Chem. Biol. 2 (1), 47-52 (2006).
  10. Szobota, S., Isacoff, E. Y. Optical control of neuronal activity. Annu. Rev. Biophys. 39 (1), 329-348 (2010).
  11. England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (20), 11025-11030 (1997).
  12. England, P. M., Lester, H. A., Dougherty, D. A. Mapping disulfide connectivity using backbone ester hydrolysis. Biochemistry. 38 (43), 14409-14415 (1999).
  13. Philipson, K. D., Gallivan, J. P., Brandt, G. S., Dougherty, D. A., Lester, H. A. Incorporation of caged cysteine and caged tyrosine into a transmembrane segment of the nicotinic ACh receptor. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 281 (1), C195-C206 (2001).
  14. Tong, Y., et al. Tyrosine decaging leads to substantial membrane trafficking during modulation of an inward rectifier potassium channel. J. Gen. Physiol. 117 (2), 103-118 (2001).
  15. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu. Rev. Biochem. 79 (1), 413-444 (2010).
  16. Wang, L., Brock, A., Herberich, B., Schultz, P. G. Expanding the genetic code of Escherichia coli. Science. 292 (5516), 498-500 (2001).
  17. Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35 (1), 225-249 (2006).
  18. Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. Expanding the genetic code for biological studies. Chem. Biol. 16 (3), 323-336 (2009).
  19. Shen, B., et al. Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons. Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).
  20. Wang, W., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nat. Neurosci. 10 (8), 1063-1072 (2007).
  21. Kang, J. Y., et al. In vivo expression of a light-activatable potassium channel using unnatural amino acids. Neuron. 80 (2), 358-370 (2013).
  22. Bichet, D., Haass, F. A., Jan, L. Y. Merging functional studies with structures of inward-rectifier K(+) channels. Nat. Rev. Neurosci. 4 (12), 957-967 (2003).
  23. Burrone, J., O'Byrne, M., Murthy, V. N. Multiple forms of synaptic plasticity triggered by selective suppression of activity in individual neurons. Nature. 420 (6914), 414-418 (2002).
  24. Johns, D. C., Marx, R., Mains, R. E., O'Rourke, B., Marban, E. Inducible genetic suppression of neuronal excitability. J. Neurosci. 19 (5), 1691-1697 (1999).
  25. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. , 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
  26. Beaudoin, G. M. III, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).
  27. Molleman, A. Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , John Wiley & Sons, Ltd. (2003).
  28. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. (6), e239(2007).
  29. Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat. Chem. Biol. 3 (12), 769-772 (2007).
  30. Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).
  31. Takimoto, J. K., Xiang, Z., Kang, J. Y., Wang, L. Esterification of an unnatural amino acid structurally deviating from canonical amino acids promotes its uptake and incorporation into proteins in mammalian cells. Chembiochem. 11 (16), 2268-2272 (2010).
  32. Parrish, A. R., et al. Expanding the Genetic Code of Caenorhabditis elegans Using Bacterial Aminoacyl-tRNA Synthetase/tRNA Pairs. ACS Chem. Biol. 7 (7), 1292-1302 (2012).
  33. Lu, H., Klaassen, C. Tissue distribution and thyroid hormone regulation of Pept1 and Pept2 mRNA in rodents. Peptides. 27 (4), 850-857 (2006).
  34. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  35. Plaster, N. M., et al. Mutations in Kir2.1 cause the developmental and episodic electrical phenotypes of Andersen's syndrome. Cell. 105 (4), 511-519 (2001).
  36. Priori, S. G., et al. A novel form of short QT syndrome (SQT3) is caused by a mutation in the KCNJ2 gene. Circ. Res. 96 (7), 800-807 (2005).
  37. Beene, D. L., Dougherty, D. A., Lester, H. A. Unnatural amino acid mutagenesis in mapping ion channel function. Curr Opin Neurobiol. 13 (3), 264-270 (2003).
  38. Hoppmann, C., et al. Genetically encoding photoswitchable click amino acids in Escherichia coli and mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).
  39. Hoppmann, C., et al. In Situ Formation of an Azo Bridge on Proteins Controllable by Visible Light. J Am Chem Soc. 137 (35), 11218-11221 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Kir2 1PIRKin utero

Похожие статьи