Оптический контроль нейронального белка с использованием генетически кодируемой искусственную аминокислоту в нейронах

Ji-Yong Kang; Daichi Kawaguchi; Lei Wang

doi:10.3791/53818

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оптический контроль нейронального белка с использованием генетически кодируемой искусственную аминокислоту в нейронах

7.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53818

⸱

28 марта 2016 г.

Ji-Yong Kang¹ , Daichi Kawaguchi² , Lei Wang³

¹Department of Neuroscience, School of Medicine, Tufts University, ²Molecular Neurobiology Laboratory, The Salk Institute for Biological Studies, ³Department of Pharmaceutical Chemistry and the Cardiovascular Research Institute, University of California, San Francisco

В этой статье

Краткое содержание

Здесь представлена процедура селективной активации нейронального белка коротким импульсом света путем генетического кодирования фотореактивной неестественной аминокислоты в целевой нейронный белок, экспрессируемый в нейронах в культуре или in vivo.

Аннотация

Фотостимуляция — это неинвазивный способ управления биологическими событиями с превосходным пространственным и временным разрешением. Необходимы новые методы фоторегуляции эндогенных белков, экспрессируемых в их родной среде. В этой статье мы представляем подход к оптическому контролю функции нейронного белка непосредственно в нейронах с помощью генетически кодируемой неестественной аминокислоты (Uaa). Используя ортогональную пару тРНК/аминоацил-тРНК-синтетаза для подавления янтарного кодона, фотореактивный Uaa 4,5-диметокси-2-нитробензилцистеин (Cmn) сайт-специфически встраивается в пору нейронального белка Kir2.1, внутренне выпрямляющего калиевой канал. Громоздкий Cmn физически блокирует пору канала, делая Kir2.1 непроводящим. Световое освещение мгновенно преобразует Cmn в более мелкую естественную аминокислоту Cys, активируя функцию канала Kir2.1. Мы экспрессируем эти p-хото-индуцируемые инаправленно ректирующиекалиевые (PIRK) каналы в первичных нейронах гиппокампа крыс и демонстрируем, что световая активация PIRK прекращает нейронное возбуждение из-за оттока тока K+ через активированные каналы Kir2.1. Используя внутриутробную электропорацию, мы также экспрессируем PIRK в эмбриональном неокортексе мыши in vivo, демонстрируя световую активацию PIRK в нейронах неокортекса. Генетически кодирующая Uaa не накладывает ограничений на тип целевого белка или клеточное расположение, и семейство фотореактивных Uaas доступно для модуляции различных природных аминокислотных остатков. Таким образом, этот метод может быть широко применен ко многим нейронным белкам для достижения оптической регуляции различных процессов в мозге. Текущий протокол представляет собой доступную процедуру для сложного встраивания Uaa в нейроны in vitro и in vivo для достижения фотоконтроля активности нейронных белков на молекулярном уровне.

Введение

По сравнению с обычной электрической стимуляции, фотостимуляции обеспечивает большую временное и пространственное разрешение с минимальным вмешательством в физиологической системе образцов. Так как демонстрации использования лазеров для стимуляции нейронов в 1971 году ^1, многие творческие пути были изобретены , чтобы экзогенно контролировать активность нейронов с помощью света. Оптический выпуск photocaged агонистов уже давно используется для изучения физиологической реакции нейронной сети для лигандов ^2,3,4. Этот метод имеет ограниченную специфичность за счет диффузии проарретированных агонистов. Генетическая специфичность достигается за счет э....