Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Производство человека Norovirus выступающую Домены в

8.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53845

⸱

19 апреля 2016 г.

 ,  ,  , 
1Schaller Research Group, University of Heidelberg and the German Cancer Research Center, 2Department of Infectious Diseases, Virology, University of Heidelberg

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы опишем метод , чтобы выразить и очистить высокое качество Norovirus выступающие (P) доменов в E. палочки для использования в исследованиях рентгеновской кристаллографии. Этот метод может быть применен к другим кальцивируса P доменов, а также неструктурные белки, то есть., Вирусный белок геном-сшитый (ВПГ), протеазы и РНК зависимой РНК - полимеразы (RdRp).

Аннотация

Норовирусная капсид состоит из одного основного структурного белка, названного VP1. VP1 подразделяется на оболочку (S) домена и выступающую (P) домена. Домен S образует непрерывную леску вокруг вирусной РНК, в то время как P доменных форм вирусные шипы на домене S и содержит детерминанты для антигенности и хост-клеточных взаимодействий. Домен P связывает углеводные структуры, то есть., Групповые антигены гисто-крови, которые считаются важными для норовируса инфекций. В этом протоколе, мы описываем способ получения высококачественных норовирус P домены с высокими выходами. Эти белки могут быть использованы для рентгеновской кристаллографии и ELISA с целью изучения антигенных свойств и хост-клеточных взаимодействий.

Домен Р сначала клонирован в вектор экспрессии и экспрессии в клетках бактерий. Белок очищают с помощью трех шагов, которые включают иммобилизованных металл-ионную аффинной хроматографии и эксклюзионной хроматографии. Впринцип, можно клонировать, экспресс, очищают, и кристаллизуются белки менее чем за четыре недели, что делает этот протокол система быстрого анализа вновь возникающих штаммов Norovirus.

Введение

Человеческие Noroviruses являются основной причиной острого гастроэнтерита во всем мире 1. Эти вирусы принадлежат к семейству Caliciviridae, из которых по крайней мере пять родов, в том числе норовирус, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus и Nebovirus. Несмотря на их высокую воздействие на систему здравоохранения и широкое распространение, изучение человеческих норовирусами затруднено из-за отсутствия надежной системы клеточной культуры. На сегодняшний день нет никаких утвержденных вакцин или противовирусных стратегий, доступных.

Норовирусная основной белок капсида, названный VP1, можно разделить на оболочку (S) домена и выступающую (P) домена 2. Домен Р подключен к домену S областью гибкого шарнира (H). Домен S образует леску вокруг вирусной РНК, в то время как домен Р образует дальний от центра часть вирусного капсида. Домен P компонует в биологически соответствующих димеров при экспрессии в бактериях. P dИМЕР взаимодействует с углеводными структурами, называемые антигены групп гисто-крови (HBGAs), которые присутствуют в виде растворимых антигенов в слюне и обнаружили на некоторых клетках - хозяевах 3. Взаимодействие домена HBGA Р считается важным для инфекции 4. В самом деле, недавний доклад показал важность синтетических HBGAs или HBGA экспрессирующих бактерии для инфекции норовирусной человека в пробирке 5.

Современные исследования , касающиеся вложения клетки - хозяина норовирусами в основном осуществляется с вирусоподобных частиц (VLPs) , которые могут быть выражены в клетках насекомых или рекомбинантных P доменов , выраженных в Escherichia coli (E.coli). Для того, чтобы понять P предметно-HBGA взаимодействия с атомным разрешением, P предметно-HBGA сложные структуры могут быть решены с помощью рентгеновской кристаллографии. Здесь мы опишем протокол для выражения Р домена и очистки, что позволяет производить области Р в высоком количестве и качестве, которые будут использоваться для рентгеновской Crystallграфия. Кроме того, этот метод может быть применен для других кальцивируса P доменов и неструктурных белков.

Домен P является кодон-оптимизированной для Е. палочка экспрессии и клонируют в стандартный вектор переноса. Домен Р затем повторно клонирована в вектор экспрессии, который кодирует полигистидиновая (His) тэг и маннозы-связывающий белок (МВР), которые, за которым следует сайт расщепления протеазы. -His-P МВР слитый домен белок экспрессируется в E. палочки, а затем три стадии очистки. Гибридный домен белка ОБМ-His-P очищают с помощью иммобилизованным ионом металла аффинной хроматографии (IMAC). Затем слитый белок расщепляют с человеческим риновирусной (ВРС) -3C протеазы и домен Р отделяется от MBP-His, с помощью дополнительной стадии очистки IMAC. И, наконец, домен Р очищают с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC). Очищенный домен P может затем использоваться для рентгеновской кристаллографии. Скрининг условий кристаллизации белков является Перфоrmed с коммерчески доступными наборами скрининга с использованием различных концентраций белка P домена. Рост кристаллов наблюдается и наиболее перспективные условия оптимизированы.

С методами, описанными здесь, можно перейти от гена к белку структурировать в течение менее четырех недель. Таким образом, наш метод выражения P домена, очистки и кристаллизации подходит для изучения взаимодействия норовирус-хозяина на молекулярном уровне и обеспечивают важные данные для оказания помощи в последнюю дату разработкой вакцин и наркотиков скрининг.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. P Домен Клонирование

  1. Определение кодирующей области P домена путем выравнивания последовательностей штаммов норовируса (например, штамм GII.10, GenBank: AF504671, PDB-ID: 3ONU) 6. Кроме того, удалите гибкую область на С-конце домена P (фиг.2А). Кодон-оптимизируют ДНК для E. палочки экспрессии и включают BamHI (N-терминал) и NotI (C-терминал) сайтов рестрикции для того , чтобы суб-клона области Р кодирующей области в вектор экспрессии pMalc2x 6,7.
    Примечание: Область кодирования Р домен оптимизировано и синтезируются коммерческой службы. Домен P кодирования области (вставка) составляет примерно 1 кб в длину и поставляется в стандартном векторе переноса.
  2. Дайджест 2 мкг вектора переноса с каждого 1 мкл BamHI (20000 ед / мл) и NotI (10000 ед / мл), ферменты рестрикции в течение 1 ч при 37 ° С с производителем поставляется буферов.
  3. Отделить переваренной вставку на агарозном геле 1%в течение 20 мин при 135 В и очищают ДНК-вставки из геля с использованием коммерческого набора.
  4. Готовят вектор экспрессии pMalc2x расщеплением 2 мкг этого вектора с каждым 1 мкл BamHI (20000 ед / мл) и NotI (10000 ед / мл) ферментов рестрикции в течение 1 ч при 37 ° С. Очищают вектор из агарозного геля, как было описано выше (1.3). Примечание: Оба образца (1.2 и 1.4) можно хранить при -20 ° С.
  5. Лигирования Очищенную вставку в расщепленного вектора pMalc2x на сайтах рестрикции BamHI и NotI с 1 мкл лигазы Т4-ДНК (400000 ед / мл) в течение 15 мин при комнатной температуре (RT) (рис 2В и 2С). Использование по меньшей мере 20 нг вектора pMalc2x и вектор: вставка соотношение 1: 3 (молекулярный вес). Смесь Лигирование обычно ~ 20 мкл.
  6. Transform 2 мкл сшитой смеси на 50 мкл химически компетентную E. палочки DH5 & бактериальные клетки с использованием стандартного протокола преобразования (10 мин на льду, теплового шока 45 сек при 42 ° С) и растут в 600мкл SOC среда в течение 1 ч при 37 ° С. Центрифуга трансформированные клетки в течение 3 мин при 1000 об XG, отбросить супернатант, и ресуспендируют осадок в 30 мкл SOC среды.
    1. Пластинчатый смесь преобразования на LB-чашки с агаром, содержащей 100 мкг / мл ампициллина для селекции, и расти в течение ночи при 37 ° С. Выберите по крайней мере пять колоний.
  7. Для каждого из пяти колоний, прививают 2-3 мл культуры LB-среде, дополненной 50 мкг / мл ампициллина (LB-Amp) и растут при встряхивании в течение ночи при 160 оборотах в минуту при 37 ° С.
  8. Извлечение Плазмиды из ночной культуры с использованием коммерческого набора. Проверьте наличие P домена вставки путем секвенирования с прямого праймера pMalc2x (5'-TCAGACTGTCGATGAAGC-3 ') и обратного праймера (5'-GATGTGCTGCAAGGCGAT-3').

Выражение 2. P Домен

  1. Transform 1 мкл (150 нг / мкл - 400 нг / мкл) векторного кодирования pMalc2x для MBP-His-P доменслитый белок в 50 мкл компетентную E. Клетки палочки BL21 с использованием стандартного протокола преобразования (10 мин на льду, теплового шока 45 сек при 42 ° С) и растут в 600 мкл SOC среды в течение 1 ч при 37 ° С. Субкультура в 120 мл LB-амп в течение ночи при 160 оборотах в минуту и ​​37 ° С.
  2. Привить девять литров (например, 6 х 5 л колб с 1,5 л среды каждая) LB-усилителя с субкультуры (1: 100). Grow клетки качалке при 160 оборотах в минуту и 37 ° С до тех пор , OD 600 не достигнет 0,4 - 0,6. Затем снижают температуру до 22 ° С в течение ~ 1 ч и затем индуцируют экспрессию белка с 0,66 мМ изопропил-бета-D-тиогалактопиранозида (IPTG) 8. Grow клеток в течение ночи при 22 ° С (~ 18 ч).
    Примечание: температура может быть разнообразным, но мы рекомендуем использовать 22 ° C или ниже.
  3. Урожай клеток путем центрифугирования (10,543 XG, 15 мин, 4 ° С). Жидкость над осадком сливают и замораживают осадок клеток при -20 ° С.

3. 1 - й Стадия очистки и протеаз Расщепление

  1. Подготовка буферов, которые используются во время стадий очистки белка из маточных растворов, чтобы гарантировать воспроизводимость и стабильность экспериментов. Подготовьте четыре различных буферов для ионно-аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом (IMAC), каждая из которых содержит различную концентрацию имидазола (10 мм, 20 мм, 50 мм и 250 мм). Для SEC, подготовить гель-фильтрационной буфер (CFB) с более высокой концентрацией соли, но без имидазола. С помощью деионизованной воды и фильтровать все буферы перед использованием с размером пор 0,45 мкм.
    Примечание: Для получения детальной схемы подготовки буфера, обратитесь к таблице 1.
  2. Растаяйте осадок клеток из литровой культуры девяти и растворяют в 150 мл PBS при 4 ° С. Разрушать ультразвуком суспензии клеток три раза в течение 2 мин (мощность 130 Вт, амплитуда 20%, частота следования импульсов 50%) для разрушения клеток. Держите клеточной суспензии на льду во время озвучивания.
  3. CentrifuGE Озвученную суспензии клеток (43667 XG, 30 мин, 4 ° С), чтобы отделить клеточные остатки от супернатанта, содержащего экспрессируемый белок. Соберите супернатант и отбросить осадок.
  4. Мытье и уравновешивают 10 мл (= 1 объем колонки [CV]) суспензии никеля (Ni) -NTA агарозных шариков с 10 мМ имидазола буфера в хроматографическую колонку. Добавить уравновешенную Ni бусинки к надосадочной жидкости с этапа 3.3, содержащего выраженный MBP-His-P домен слитого белка и инкубировать в течение 30 мин при температуре 4 ° С при медленном вращении.
  5. После инкубации применить всю смесь Ni-бусинка-белка в хроматографическую колонку. Промывают колонку медленно с каждые 5 колоночными объемами 10 мМ, 20 мМ и 50 мМ имидазола буферы, начиная с 10 мм, затем 20 мМ , и последние 50 мМ (фиг.3А).
  6. Элюции ОБМ-His-P слитый домен белка с использованием 250 мМ имидазола буфера (фиг.3А). Во время элюирования, проверьте OD 280 нм , чтобы проверить , вымывание слитого белка (рост OD 280nm). Продолжайте элюирование до OD 280 нм не упадет до ~ 0,1. Промыть шарики с чрезмерным количеством 250 мМ имидазола буфера (по крайней мере, 10 ППО), а затем по крайней мере, 10 колоночными объемами 10 мМ имидазола буфера. Сохраните шарики для второй стадии очистки (раздел 4).
  7. Проверьте наличие ОБМ-His-P домен белка , слитого с SDS-PAGE с использованием 12% SDS-полиакриламидном геле в присутствии (10 х 8 см) 9 (рисунок 3А). Выполните гель-электрофореза на 45 А и 200 В в течение 45 мин.
  8. Концентрат (например, с использованием коммерческого концентраторы) элюированного ОБМ-His-P домен слитого белка до конечной концентрации ~ 3 мг / мл. Сколите домен слияния МВР-His-P с ВСР-3С протеазы во время диализа против 2 л 10 мМ имидазола буфера (~ 1: 100) в течение ночи при 4 ° С (фиг.3А). В зависимости от конечного объема концентрированного белка, выполняют диализ в диализный кассете или диализной трубке.
    Примечание: количество HRV-3C протеазы для белкаРасщепление рассчитывается по удельной активности протеазы (2 ед / мкл, 1 U достаточно, чтобы расщепить 100 мкг белка), и количество вымываемого слитого белка, который изменяется от уровня экспрессии и могут быть оценены из результата SDS-PAGE (3.7 ).

4. 2 - й Стадия очистки

  1. Уравновешивания Ni-бусинки со стадии 3.6 в 10 мМ имидазола буфере.
  2. Выдержите Диализованный белок из шага 3.7 (содержащий расщепляется домен P, белок MBP и HRV-протеазы) с уравновешенной Ni бусинок (4.1) в течение 30 мин при температуре 4 ° С при медленном вращении.
  3. Нанесите Ni-шарик смеси в колонну и собирать проточные (расщепляется P домена) (Рисунок 3B). Измерение концентрации белка , как это происходит с колонки до OD 280 нм не достигает ~ 0,1.
    Примечание: MBP-His должен оставаться связанным с Ni-шариков (рис 3б).
  4. Проверьте наличие домена расщепляют P с помощью SDS-PAGE с 12% гель , как описано выше (фиг.3В). Концентрат элюированного домен Р до ~ 3 мг / мл и диализ в течение ночи при 4 ° C против GFB для последующей очистки SEC.

5. 3 - я стадия очистки

  1. Мытье насосы и трубопроводы системы очистки ВЭЖХ и предварительно уравновешивают SEC-колонку (см список материалов) с GFB.
  2. Вводят области Р на колонку при скорости потока 1 мл / мин с использованием superloop (до 12 мл) или цикл (до 3 мл), в зависимости от объема концентрированного образца. После инъекции закончено, увеличить расход до 2,5 мл / мин.
  3. По мере того как OD увеличивается и область P отрывается колонку, собирают фракции 1,5 мл. Проверка фракций с помощью SDS-PAGE с 12% геле (рис 4А и 4Б). Бассейн только чистые фракции и концентрируют до ~ 3 мг / мл и ~ 8 мг / мл.
    Примечание: После ~ 110 мл (объем пустот) большинство примесей элюируют из колонки SEC с объемом 320 мл слоем.домен Р обычно элюируют в виде димера. Элюирование время / объем димера Р домена зависит от степени преп (Pg) колонны SEC.

6. Кристаллизация P домена

  1. Используйте домен P на ~ 3 мг / мл и 8 мг / мл для первичного скрининга кристаллизации. Подготовьте по крайней мере, 100 мкл области P в концентрации для начальных экранов с 384 коммерчески доступных условий скрининга. Провести скрининг при 18 ° С в 96-луночного формата пластины, где резервуар содержит 100 мкл маточного раствора и каплю состоит из 0,2 мкл раствора маточного и 0,2 мкл белка.
  2. Повторить и оптимизировать успешных условий кристаллизации. Таким образом, использовать 15-луночные планшеты, которые содержат 3 ряда. Установите первую строку с 100% -ным раствором матери, во втором ряду с 90% -ным раствором матери и 10% воды, а в третьем ряду с 80% -ным раствором матери и 20% воды. Используйте размер капли 2 мкл (1 мкл белка + 1 мкл маточного раствора) и 50081; л маточного раствора в объеме резервуара.
  3. Используйте оптимизированные условия для кристаллических сокристаллизующееся домен P с лигандами. Подготовка пластин, как это описано в пункте 6.2. Вместо 2 мкл размера капель, установить капли, содержащие 1 мкл раствора маточного 1 мкл белка, и 1 мкл лиганда при концентрации 1 мг / мл.
  4. Соберите наборы данных монокристаллов с использованием синхротронного излучения. Выполните молекулярную замену с использованием опубликованных структур P доменов с высоким сходством последовательности в качестве исходной модели поиска 6,10-13.
    Примечание: Наличие лиганда показывает, как ООН смоделированный сгустка электронной плотности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Схема описанного протокола изображен на рисунке 1. Протокол охватывает 6 основных частей , которые включают клонирование гена - мишени, экспрессия, очистка трехступенчатую и кристаллизацию. Рисунок 2 иллюстрирует конструкцию экспрессионной конструкции (ЕС) и характеристики вектора экспрессии pMalc2x. Последовательность сайта множественного клонирования (MCS) вектора pMalc2x показывает рестрикции и протеазы сайтов расщепления. Рисунок 3 п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы опишем протокол для экспрессии и очистки норовируса P доменов в высоком качестве и количестве. Норовирусы недостаточно хорошо изучены и постоянно необходимы структурные данные. Насколько нам известно, производство домен P с использованием других протоколов (например, GST-меченый P домены) было проблематичным, до сих пор, и достаточные структурные данные о взаимодействии норовирус-хост пропали без вести. С метод, описанный здесь, недавно мы внесли значительный вклад в понимание молекулярных деталей норо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Финансирование этого исследования было предоставлено фондом CHS. Мы выражаем признательность за платформу кристаллизации белков в рамках передового кластера CellNetworks Гейдельбергского университета для скрининга кристаллов и Европейского центра синхротронного излучения за предоставление установок для синхротронного излучения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
P домен DNALife TechnologiesGeneArt Синтез гена
pMalc2x  векторПо запросу
BamHINew England BiolabsR0136L
NotINew England BiolabsR0189L
T4 DNA LigaseNew England BiolabsM0202S
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27104
S.O.C. MediumLife Technologies15544-034
Econo-Column Chromatography ColumnBio-Rad73725122,5 x 10 см, возможно использование другого размера
Ni-NTA AgaroseQiagen30210
Vivaspin 20GE Healthcareразличноеотсечки 10 кДа, 30 кДа и 50 кДа используемой
субклонированной эффективности DH5α Компетентные клеткиLife Technologies18265-017
One Shot BL21(DE3) Химически компетентный E. coliLife TechnologiesC6000-03
HRV 3C ПротеазаMerck Millipore71493
HiLoad 26/600 Superdex 75 PGGE Healthcare28-9893-34SEC
колонка JCSG Core suitesQiagenразличные4 экраны с каждой 96 лунками
УглеводыDextra Laboratories, Великобританияразличныепродукты группы крови

Ссылки

  1. Ahmed, S. M., et al. Global prevalence of norovirus in cases of gastroenteritis: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infect. Dis. 14, 725-730 (2014).
  2. Prasad, B. V., Matson, D. O., Smith, A. W. Three-dimensional structure of calicivirus. J. Mol. Biol. 240, 256-264 (1994).
  3. Choi, J. M., Hutson, A. M., Estes, M. K., Prasad, B. V. Atomic resolution structural characterization of recognition of histo-blood group antigens by Norwalk virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9175-9180 (2008).
  4. Marionneau, S., et al. Norwalk virus binds to histo-blood group antigens present on gastroduodenal epithelial cells of secretor individuals. Gastroenterology. 122, 1967-1977 (2002).
  5. Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346, 755-759 (2014).
  6. Hansman, G. S., et al. Crystal structures of GII.10 and GII.12 norovirus protruding domains in complex with histo-blood group antigens reveal details for a potential site of vulnerability. J. Virol. 85, 6687-6701 (2011).
  7. Fath, S., et al. Multiparameter RNA and codon optimization: a standardized tool to assess and enhance autologous mammalian gene expression. PLoS One. 6 (e17596), (2011).
  8. Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).
  9. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  10. Kabsch, W. Automatic Processing of Rotation Diffraction Data from Crystals of Initially Unknown Symmetry and Cell Constants. J. Appl. Crystallogr. 26, 795-800 (1993).
  11. Mccoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674 (2007).
  12. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 486-501 (2010).
  13. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 213-221 (2010).
  14. Koromyslova, A. D., Hansman, G. S. Nanobody binding to a conserved epitope promotes norovirus particle disassembly. J. Virol. 89, 2718-2730 (2015).
  15. Hansman, G. S., et al. Structural basis for broad detection of genogroup II noroviruses by a monoclonal antibody that binds to a site occluded in the viral particle. J. Virol. 86, 3635-3646 (2012).
  16. Singh, B. K., Leuthold, M. M., Hansman, G. S. Human noroviruses' fondness for histo-blood group antigens. J. Virol. 89, 2024-2040 (2015).
  17. Leuthold, M. M., Dalton, K. P., Hansman, G. S. Structural analysis of a rabbit hemorrhagic disease virus binding to histo-blood group antigens. J. Virol. 89, 2378-2387 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

P-домен норовирусаэкспрессия белкаэкспрессия в E. coliэксклюзионная хроматографияиммобилизованный металл-аффинный анализSDS-PAGE анализочистка белковисследования антигенностивзаимодействие с клетками хозяина
Производство человека Norovirus выступающую Домены в
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.