Методическая статья

Миниатюризированное Glycan Microarray Анализ для оценки авидности и специфичность вируса гриппа А агглютинины

DOI:

10.3791/53847

⸱

29 мая 2016 г.

 ,  , 
1Department of Cell and Molecular Biology, Chemical Physiology and Microbial Science, The Scripps Research Institute, 2Department of Medicinal Chemistry and Chemical Biology, Utrecht Institute for Pharmaceutical Sciences, Utrecht University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Используя стратегию печатного гликанового микрочипа, обычный 96-луночный планшетный анализ был миниатюризирован для анализа авидности гемагглютинина вируса гриппа А и специфичности для рецепторов, содержащих сиаловую кислоту.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вирус гриппа А (ИФО) гемагглютинины признают сиаловых кислот на поверхности клетки, как функциональные рецепторы, чтобы получить вход в клетки. Дикие водоплавающие являются естественным резервуаром для IAV, но IAV может пересечь видовой барьер для птицы, свиней, лошадей и людей. Вирусы птичьего признают сиаловой кислоты, прикрепленную к предпоследней галактозы с помощью α2-3 связи (рецепторы птичьего типа), тогда как человеческие вирусы предпочтительно распознавать сиаловой кислоты с α2-6 подъёмник (рецепторы человеческого типа). Для того, чтобы контролировать, если вирус птичьего адаптируются к рецепторам типа человека, могут быть использованы несколько способов. Glycan микрочипы с различными библиотеками синтетических sialosides все чаще используются для оценки специфичности рецептора. Тем не менее, этот метод не используется для измерения avidities. Измерение авидности обычно достигается путем оценки связывания серийно разведенной гемагглютинина вируса или к гликанов, адсорбированных в обычных полипропиленовых 96-луночных планшетах. В этом анализе гликаны с альфа2-3 или α2-6 сиаловых кислот, в сочетании с биотином и адсорбируют на стрептавидин пластин, или соединены с полиакриламид (ПАА), которые непосредственно адсорбироваться на пластике. Мы значительно миниатюрным этот анализ непосредственно печатание ПАА-сшитый sialosides и их не ПАА-сшитый коллегами на микро-а стеклах. Этот комплект, с 48 массивов на одном слайде, позволяет одновременно анализы 6 Гликан связывающих белков в 8 разведений, опрашивая 6 различных гликанов, в том числе двух не сиалилированных контроля. Это эквивалентно 18x 96-луночные планшеты в традиционном анализе на планшетах. Гликан формат массива уменьшается потребление соединений и биологических препаратов и тем самым значительно повышает эффективность.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дикие водоплавающие являются естественным резервуаром для IAV, но IAV способен пересечь видовой барьер для домашней птицы и млекопитающих, в том числе, человека. Птичий IAVS признают α2-3 связанных сиаловой кислоты (рецепторы птичьего типа), в то время как человеческие вирусы связывают α2-6 связанных сиаловой кислоты (рецепторы человеческого типа). Для того, чтобы иметь возможность эффективно копировать и передавать между людьми птичий IAV должно связываться с рецепторами человеческого типа 1.

IAVS разделены на основе серологических, характеризующей антигенность их гемагглютинина (HA) и нейраминидазы (NA) гликопротеинами оболоч....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: Все стадии проводят при комнатной температуре, если не указано иное.

1. Построение массива

  1. Glycan Подготовка и настройка Plate
    1. Подготовить запас печатного буфера. Во-первых сделать 500 мл 150 мМ исходного раствора двухосновного фосфата натрия. Также сделайте 50 мл 150 мМ исходного раствора одноосновной раствора фосфата натрия. В колбе, с помощью магнитной мешалки и рН-метр, медленно титровать двухосновных раствор фосфата натрия с одноосновной раствором до рН 8,5 не будет достигнута. Добавить Tween-20 до 0,005%.
    2. Подготовьте Гликан образцы. Развести РАА сопряженными гликаны, (diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PA....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Печать, сканирование и анализ данных

Для обеспечения правильной печати, жизненно важно иметь правильное выравнивание пятнистой сетки внутри маски тефлоном, который очерчивает каждый массив на слайде. Во время печати из-за характера тефлоновым покрытием, пятна не видны невооруженным глазом на MPX слайдами. Обращается внимание то к появлению предварительных пятен на слайдах поли-L-лизин покрытием. Непосредственно после того, как.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оценка специфичности рецептора Iav является важным шагом в анализе потенциал пандемии птичьего вирусов. Признание сиаловой кислоты с помощью вируса связан с несколькими биологическими свойствами, такими, как связывания и высвобождения из клетки. Знание того, какие аминокислотные мутации необходимы для вирусов птичьего для достижения α2-6 связывания и пересекают видовой барьер позволяет готовности к пандемии. Несколько анализов используются для определения специфичности рецептора; Тем не менее, все они имеют свои недоста.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана частично Scripps Microarray Основной фонд, и контракт от Центров по контролю и профилактике заболеваний (JCP). RPdV является получателем гранта Rubicon и Veni от Нидерландской организации научных исследований (NWO). Консорциум по функциональной Glycomics (http://www.functionalglycomics.org/) финансируется за счет гранта NIGMS GM62116 (JCP) представила несколько гликаны, используемых в данном исследовании. Это публикация 29113 из Скриппса научно-исследовательского института.

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
NEXTERION® Горка H MPX-48 Горки Schott1091525Microwell
ProScanArray Plus PerkinElmerснят с производстваконфокальный микрочиповый сканер
Innoscan 1100AL Scanner/Mapix SoftwareInnopsys-конфокальныймикрочиповый сканер
MicroGrid II Digilab-микропринтер
SNAVector LabsB-1305 Растительный лектин
ECAВектор ЛабсB-1145 Растительный лектин
Антитела к стрептококкуIBA2-1509-001 Anitbody для привязки HA
Anti-Mouse Alexa-647LifeA-21235Anitbody for HA binding
Tween-20SigmaP2287 очищающий
двухосновной фосфат натрияSigma255793компонент буфера для печати
одноосновной фосфат натрияSigma229903 Компонент буфера печати
раствор поли-l-лизинаSigmaP8920 Компонент слайда для предварительного пятнистого
Гидроксид натрияSigma221465предварительно пятнистый компонент предметного стекла
этанолSigma493546предварительно пятнистый компонент предметного стекла
фосфат буферный физиологический растворCorning46-013-CMбуфер для инкубации/промывки
SMP4B штифтыTelechemSMP4Bпечатающий штифт
сжатый азот (класс 5)PraxairUN1066общий инструмент для опыления/сушки
Борная кислотаSigmaB6768-500GРеагент для блокировки слайдов
этаноламинSigmaE9508-500MLРеагент для блокировки слайдов
Atto 488AttoTecAD 488-91Маркер сетки на матрице
PAA-LNLNКонсорциум по функциональной гликомикеPA368Пятнистые гликаны
PAA-3SLNLNКонсорциум для Функциональная гликомикаPA362Пятнистые гликаны
PAA-6SLNLNКонсорциум по функциональной гликомикеPA343Пятнистые гликаны
LNLNКонсорциум по функциональной гликомикеTE98Пятнистые гликаны
3SLNLNКонсорциум по функциональной гликомикеTe175Пятнистые гликаны
6SLNLNКонсорциум по функциональной гликомикеTE176Пятнистые гликаны
384-луночная пластина для микротитрованияМатрица TechCorp4361Печатная пластина
VWR лабораторный маркерVWR52877-150Нумерация слайдов
Wheaton Чашка для окрашивания слайдовSigmaZ103969-1EAБлокировка и сушка
нанесения

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tumpey, T. M., et al. A two-amino acid change in the hemagglutinin of the 1918 influenza virus abolishes transmission. Science. 315 (5812), 655-659 (2007).
  2. Xu, R., et al. Functional ba....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Glycan Microarray AssayInfluenza A VirusHemagglutinin BindingAvidity MeasurementSpecificity AnalysisSialic Acid LinkagePAA Conjugated GlycansSerial DilutionFluorescent DetectionData Analysis

Похожие статьи