Селективный Заготовка Marginating-легочными Лейкоциты

Краткое содержание

Маргинирующие легочные лейкоциты демонстрируют уникальные характеристики и различные иммунологические функции по сравнению с другими популяциями лейкоцитов. Здесь мы описываем селективный сбор этой субпопуляции легочных лейкоцитов путем принудительной перфузии легких у крыс и мышей. Маргинально-легочные лейкоциты, по-видимому, имеют решающее значение в определении восприимчивости к заболеваниям, передающимся через кровь и связанным с легкими.

Аннотация

Маргинаторно-легочные лейкоциты (МП) — это лейкоциты, которые прилипают к внутреннему эндотелию капилляров легких. Было показано, что МП-лейкоциты демонстрируют уникальный состав и характеристики по сравнению с лейкоцитами других иммунных компартментов. Данные свидетельствуют о более высокой цитотоксичности естественных клеток-киллеров и отчетливом про- и противовоспалительном профиле популяции МП-лейкоцитов по сравнению с циркулирующими или селезеночными иммуноцитами. Представленный здесь метод позволяет селективно собирать МП-лейкоциты путем принудительной перфузии легких у мышей или крыс. В отличие от других методов, используемых для извлечения легочных лейкоцитов, таких как измельчение тканей и биологическая деградация, этот метод позволяет получать лейкоциты исключительно из легочных капилляров, не загрязненные паренхиматозными, интерстициальными и бронхо-альвеолярными клетками. Кроме того, метод перфузии лучше сохраняет целостность и физиологическую среду МП-лейкоцитов, не вызывая физиологических реакций из-за обработки тканей. Эта уникальная популяция лейкоцитов MP стратегически расположена для идентификации аномальных циркулирующих клеток и реагирования на них, поскольку все циркулирующие злокачественные клетки и инфицированные клетки задерживаются при прохождении через капилляры легких, физически взаимодействуя с эндотелиальными клетками и резидентными лейкоцитами. Таким образом, селективный сбор МП-лейкоцитов и их изучение в различных условиях может улучшить наше понимание их биологического и клинического значения, особенно в отношении контроля циркулирующих аберрантных клеток и заболеваний, связанных с легкими.

Введение

Лейкоциты , прилипшие к капиллярам легких (т.е. marginating-легочная (МП) лейкоциты) ¹ было показано, проявляют отчетливую состав лейкоцитов и уникальной активностью по сравнению с лейкоцитами из других иммунных отсеков (например, циркуляционной, селезенку, костный мозг) ^{2- 4.} Например, МР-лейкоциты проявляют более высокую природные клетки-киллеры (NK) клетки, цитотоксичность в отношении различных опухолевых клеток, по сравнению с циркулирующими и селезеночной NK-клеток, а также дифференцированы информационной РНК (мРНК уровней) и повышенной секрецией про- и противовоспалительных цитокинов. Состав клеток также отличается от циркулирующих лейкоцитов, как MP-лейкоциты имеют более высокое отношение врожденной / адаптивного иммунитета по сравнению с циркулирующими лейкоцитами (50% против 30%, соответственно). Цель метода, изложенного в настоящем документе, для того, чтобы селективного сбора урожая МП-лейкоциты, чтобы изучить эту важную и уникальную иммунную отделение (популяцией клеток) и elucIDATE влияние различных манипуляций (например, активация иммунной системы ) на этих специфических клеток.

Для того, чтобы понять значение этого уникального населения, важно отметить , что иммунная система может контролировать циркулирующих опухолевых клеток, микрометастазов и остаточной болезни с помощью функций в естественных условиях клеточного иммунитета (CMI). Эта способность проявляется , несмотря на провал прецедент иммунной системы для контроля первичной опухоли, и поддерживается в естественных условиях достаточно доказательств , у онкологических больных и животных моделях ^5. Важно отметить, что эти результаты часто несовместимы с ин витро и исследований исключая виво, которые сообщают о том , что большинство аутогенные опухолевые клетки устойчивы к цитотоксичности путем циркулирующих лейкоцитов в образцах крови от человека и животных (измеряется цитотоксичность) ^6,7. Это несоответствие может быть связано с наличием в естественных условиях различных популяций лейкоцитов, таких как AFOREМП вышеупомянутый лейкоцитарной населения, и в частности , ее субпопуляции активированных клеток NK ^3. Действительно, сингенных опухолевые клетки (MADB106), которые были найдены , чтобы быть устойчивым к циркулирующим и селезеночной лейкоцитах, было показано , что лизировать клетками МП-NK ^3,8. Таким образом, как утверждается, «NK-устойчивые" MADB106 клетки, которые метастазируют в легкие fischer344 (F344) крыс контролируются клетками MP-NK, но не за счет циркуляции или селезеночных клеток NK, которые обычно изучали с учетом их легкость доступа.

Очищенные и активные MP-лейкоциты недоступны через стандартные методы уборки лейкоцитов из легких, которые основаны на измельчении легочной ткани или биологической деградации ^9. Наш подход имеет два основных преимущества по сравнению с подходами к обработке тканей. Во-первых, перфузия подход выборочно собирает MP-лейкоциты, отделяя их от других клеток, которые происходят из паренхимы легких, интерстициальная и бронхо-альвеолярной COMPARtments. Во-вторых, метод перфузии лучше сохраняет целостность и физиологическую среду МП-лейкоциты, в отличие от измельчения и биологической обработки подходов, которые повреждают клетки, изменяют их морфологию, и индуцируют выработку и выделение различных факторов, которые модулируют иммунную активность и, в частности подавляют NK цитотоксичность ^10.

Легкие являются основным органом-мишенью для метастазирования рака и различных инфекционных заболеваний. Все циркулирующие злокачественные клетки и инфицированные клетки проходят через капилляры легких, где они должны деформироваться и взаимодействовать с капиллярных эндотелиальных клеток и лейкоцитов резидентов. В этих условиях, циркулирующие клетки могут быть легко мишенью резидентных MP-лейкоцитах. Таким образом, представляется биологически выгодно иметь активированные лейкоциты в этом иммунном отсеке, и важно, чтобы изучить этот уникальный MP-население в различных биологических, экспериментальных и клинических условиях. Стоит отметить, что SYstemic активация иммунной системы с помощью различных биологических-реакция модификаторов (например, полиинозиновая-полицитидиловая кислоты (поли I: С) или С-типа CpG олигодезоксинуклеотиды (CPG-С ODN)) было показано , чтобы активировать MP-лейкоциты более циркулирующих лейкоцитах ^{3, 8,11.}

Протокол

Процедуры с участием субъектов животных были одобрены по уходу и использованию комитета Institutional Animal (IACUC) в Тель-Авивском университете по.

1. Крыса протокола

1. Препараты
   1. Устройте 2 бабочки 21 G иглы. Необязательно готовить 2 с тупыми краями бабочка 21 G иглы путем подачи острый край иглы.
   2. Стерилизовать хирургических инструментов: 2 пары ножниц, притупляются обрезные щипцов, кровоостанавливающего, пинцет зубной ткани, стерилизованные в автоклаве при температуре 121 ° С в течение по меньшей мере 30 мин на тяжести (сухой) настройки.
   3. Подготовка гепарином PBS (30 ед / мл), добавлением 30 единиц гепарина на мл раствора фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) 1x. Используйте при комнатной температуре. 35 мл является минимальный объем требуется на одно животное.
   4. Поток гепарином PBS в перистальтических линии насоса и иглы бабочки, чтобы избежать воздушных пузырей.
2. Перфузия Легких и коллекции МП-лейкоциты
   1. Усыпить животное передозировкой 8% изофлуран, Подтвердить эвтаназию путем мониторинга дыхания прекращения.
   2. После прекращения дыхания, немедленно откройте брюшины и грудной полости, используя стерильные ножницы и пинцет зубной ткани. Выполните по средней линии живота разрез вдоль живота до мечевидного отростка.
   3. Поднимите грудину с помощью пинцета, осторожно разрезания грудной клетки с обеих сторон, не прокалывая любого внутреннего органа или крупных кровеносных сосудов. Зажмите кровоостанавливающего на грудину, и ростральным сложить грудную клетку, чтобы выставить комплекс сердечно-легочной.
   4. Вставьте бабочку иглу в правый желудочек сердца, и в течение примерно одной минуты собрать максимальный объем крови в шприц (~ 6 мл из 250 г животного).
   5. Зажмите полую вену с кровоостанавливающего , чтобы избежать обратной перфузию печени (см Обсуждение).
   6. Держите бабочка иглу в правый желудочек при замене шприц, содержащий кровь с выпускной трубкой из рeristaltic насос.
   7. Вставьте вторую бабочку иглу, соединенную с уборочной шприцем 5 мл в левый желудочек, избегая проникновения межжелудочковой перегородки.
   8. Включите шланговый насос со скоростью около 5 мл / мин и осторожно собирают в шприц первые миллилитров перфузату, загрязненных кровью. Продолжайте, пока перфузат цвет не станет от темного до светло-красного. (Выбросите крови зараженных perfuste).
   9. Без прекращения перистальтического насоса, быстро заменить 5 мл уборочное шприц с 20 мл шприцом уборочной и собирают 20 мл перфузата легких с использованием более высокую скорость перфузии (до 7 мл / мин). Постоянно контролировать поток перфузату в сборном шприц, во избежание образования вакуума.
   10. Прекратить подачу перистальтического насоса.
3. Лейкоциты Добыча
   1. Центрифуга перфузата в течение 10 мин при 400 × г.
   2. Аспирируйте жидкость.
   3. Добавьте 10 мл PBS или средой, центрифугируют при 400 х г в течение 10 мин, и отсасывает жидкость. Повторите этот шаг дважды. Использование PBS или среды зависит от последующего использования образца.
   4. Добавьте 20 мл PBS или средой, центрифугируют при 400 х г в течение 10 мин, и отсасывает жидкость.
   5. Развести клетки до нужной концентрации, основанные на использовании образца (FACS, ПЦР и т.д.).

2. Протокол Mouse

1. Препараты
   1. Устройте 2 бабочки 25 G иглы. Необязательно готовить 2 с тупыми краями бабочка 25 G иглы путем подачи острый край иглы.
   2. Стерилизовать хирургических инструментов: 2 пары ножниц, притупляются обрезные щипцов, кровоостанавливающего, пинцет зубной ткани, стерилизованные в автоклаве при температуре 121 ° С в течение по меньшей мере 30 мин на тяжести (сухой) настройки.
   3. Подготовка гепарином PBS (30 ед / мл), добавлением 30 единиц гепарина на мл раствора 1X PBS. Используйте при комнатной температуре. 25 мл является минимальный объем требуется на одно животное.
   4. Streя гепарином PBS в перистальтических линии насоса и иглы бабочки, чтобы избежать воздушных пузырей.
2. Перфузия Легких и коллекции МП-лейкоциты
   1. Усыпить животное передозировкой 8% изофлуран. Подтвердить эвтаназию путем мониторинга дыхания прекращения.
   2. После прекращения дыхания, немедленно откройте брюшины и грудной полости, используя стерильные ножницы и пинцет зубной ткани. Выполните по средней линии живота разрез вдоль живота до мечевидного отростка.
   3. Поднимите грудину с помощью пинцета, осторожно разрезания грудной клетки с обеих сторон, не прокалывая любого внутреннего органа или крупных кровеносных сосудов. Зажмите кровоостанавливающего на грудину, и ростральным сложить грудную клетку, чтобы выставить комплекс сердечно-легочной.
   4. Зажмите полую вену с кровоостанавливающего, чтобы избежать обратной перфузию печени (см Обсуждение).
   5. Вставьте бабочку иглу, соединенную с выпускной трубкой перистальтического насоса в правый Достtricle сердца, а вторая бабочка игла соединена с уборочной шприца 2 мл в левый желудочек сердца, avoidingpenetration межжелудочковой перегородки.
   6. Включите насос до скорости около 2 мл / мин и собирают первые миллилитров крови загрязненных перфузату в уборочной шприца, пока не получается Перфузат от темного до светло-красного (Утилизировать загрязненные кровью perfuste).
   7. Без прекращения перистальтического насоса, быстро заменить 2 мл уборочное шприц с 10 мл шприцом уборочной и собирают 10 мл перфузата легких с использованием более высокую скорость перфузии (до 4 мл / мин). Постоянно контролировать поток перфузату в сборном шприц, во избежание образования вакуума.
   8. Прекратить подачу перистальтического насоса.
3. Лейкоциты Добыча
   1. Центрифуга перфузата в течение 10 мин при 400 × г.
   2. Аспирируйте жидкость.
   3. Добавьте 10 мл PBS или среду, центрифуге при 400XG в течение 10 мин, и отсасывает жидкость. Повторите этот шаг три раза. Использование PBS или среды зависит от последующего использования образца.
   4. Добавьте 10 мл PBS или средой, центрифугируют при 400 х г в течение 10 мин, и отсасывает жидкость.
   5. Развести клетки до нужной концентрации, основанные на использовании образца (FACS, ПЦР и т.д.).

Результаты

MP-купе обладают различной лейкоцитарной подмножеством состав по сравнению с циркулирующим лейкоциты. С помощью проточной цитометрии анализа субпопуляций лейкоцитов были идентифицированы и количественно охарактеризовать состав и циркулирующих и лейкоцитах МП. Гранулоциты и лимфоциты были определены на основе прямых и боковых рассеивателей. В - лимфоцитов, NKRP-1 ^{светлые} клетки были идентифицированы как клетки NK, CD3 ⁺ , как Т - клетки, RM1 ⁺ как моноцито...

Обсуждение

Метод, представленный здесь, позволяет выборочный сбор урожая и изучение уникальной популяции МП-лейкоцитами. По сравнению с циркулирующим или селезеночной лейкоцитах, население МП характеризуется отчетливым составом субпопуляций лейкоцитов, более высокие уровни активации, более высокий высвобождение различных цитокинов, а также более высокие уровни мРНК про- и противовоспалительных цитокинов ^2,3. В частности, мы показали , что МР-NK - клетки являются более токсичным , чем кровеносной NK клеток против различн...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Автоклюд Перистальтический насос
Игла бабочка	OMG		26G
Игла бабочка	OMG		21G*3/4
"Шприц	Pic раствор		1 мл
Шприц	Pic раствор		2,5 мл
Шприц	Pic раствор		5 мл
Шприц	Пик раствор		10 мл
Шприц	Пик раствор		25 мл
Тупые щипцы
Ножницы
гемостат
Тканевые щипцы
Гепарин натрия свиная слизистая (без консервантов)	Сигма Олдрич