Method Article

Анализ функциональной дополнительности (FCA): A Laboratory Упражнение Разработана и внедрена к дополнению Учение биохимических путей

DOI:

10.3791/53850

⸱

June 24th, 2016

 ,  , 
1Thomas H. Gosnell School of Life Sciences, Rochester Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Проверка достоверности ферментативных активностей, участвующих в биохимических путей, могут быть объяснены с помощью функционального анализа комплементации (FCA). Описанное в этой рукописи является анализ FCA демонстрирующий ферментативную активность ферментов, участвующих в метаболизме аминокислот, бактериальный строгие реакции и бактериального пептидогликана биосинтеза.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Функциональный анализ комплементационная (FCA) представляет собой анализ в естественных условиях , который широко используется для выяснения функции / роль генов / ферментов. Этот метод является очень распространенным явлением в области биохимии, генетики и многих других дисциплин. Подробный обзор техники в дополнение к преподаванию биохимических путей, имеющих отношение к аминокислотам, пептидогликана и бактериальная жесткие ответ сообщается в этой рукописи. Два кДНК из модели растительного организма Резуховидка Таля, которые участвуют в обмене веществ лизина (L, L-диаминопимелатдегидрогеназу аминотрансферазы (ДАПЛ) и тирозин - аминотрансферазы (tyrB) , участвующих в обмене тирозина и фенилаланина выдвинуты на первый план. Кроме того, бактериальные пептидогликана анаболический путь выделен через анализ -acetylmuramoyl-L-аланил-D-glutamate- мезо -2,6-диаминопимелатдегидрогеназу лигазная (Мюр) гена UDP- N из бактерии Verrucomicrobium Spinosum , участвующих в скрещивании-linking пептидогликана. Бактериальный жесткие реакции также сообщается посредством анализа РСЗ (г ELA / с горшка ч УДОСТОВЕРЕ) бифункциональный ген , ответственный за гипер-слизистый фенотипа бактерии Novosphingobium зр. Четыре примера FCA представлены. Видео будет сосредоточена на трех из них, а именно лизин, пептидогликана и жестким ответом.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Функциональная комплементационный в контексте выяснении функцию (и) / роли (ролей) гена определяется как способность конкретного гомологичные или ортологичными гена для восстановления конкретного мутанта с наблюдаемой фенотипа к состоянию дикого типа, когда гомологичные или ортологичными ген вводят в цис- или транс - в мутантный фоне. Этот метод широко используется для выделения и идентификации функции (ы) / роли (ролей) многих генов. Одним из конкретных примеров является выделение и идентификация оротидин-5-фосфат - декарбоксилазы от Candida Albicans использованием URA3 мутант S. CEREVISIAE и pyrF мутант Е. п....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: Авторы готовы предоставить бактериальные штаммы и рекомбинантные плазмиды с целью содействия включению функционального анализа комплементационной для целей обучения для лиц, которые заинтересованы. Плазмиды , которые были использованы для облегчения проведения функциональных экспериментов комплементационной приведены в таблице 1.

1. Конструирование плазмид для функциональной дополнительности

  1. Клонирование диаминопимелатдегидрогеназу аминотрансферазы (ДАПЛ) для функциональной дополнительности.
    1. Усилить ДАПЛ открытую рамку считывания (ORF) из V. Spinosum и от A. кДНК thali....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Бактериальные штаммы, которые используются в различных функциональных анализах комплементации, перечислены в таблице 2.

Функциональный анализ комплементационная: L, L-диаминопимелатдегидрогеназу аминотрансферазы (ДАПЛ)

E. палочка двойной мутант AOH1 (Δ DAPD :: Kan2, dapE6) таит в себе мутации в гене DAPE и полное удаление .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Многие из курсов, которые являются неотъемлемой частью биотехнологии и молекулярной Bioscience учебного плана в Рочестерского технологического института имеют лабораторный компонент в дополнение к лекционной части курса. Учебный план на учебный 2014-2015 год содержит в общей сложности 48 курсов, 29 из которых содержат лабораторный компонент, который составляют примерно 60%. Одним из таких курс Основы биохимии растений и патологии (FPBP), смешанной лекции / лабораторного курса и Bioseparations: Принципы и практика (BPP),.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AOH и MAS признает колледж науки и Томас Х. Госнелл Школа естественных наук в Рочестерского технологического института для поддержки. Эта работа была частично поддержана со стороны США Национального научного фонда (NSF) награду AOH MCB-1120541.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
E. coli мутантыHudson/Savka lab или CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)
ЭлектропораторBiorad-США1652100
Электропоратор КюветыBiorad-США1652082
Инкубатор с регулируемой температуройДженерик
Luria AgarThermofisher Scientific22700025
Бульон LuriaThermofisher Scientific12795084
M9 MediumSigma-Aldrich63011
Картофельная декстроза MediumFisher Scientfic DF0013-15-8
Канамицинсигма-ОлдричK1377
ДиаминопимелатСигма-Олдрич92591
ТиминСигма-ОлдричT0376
ХлорамфениколСигма-ОлдричC0378
ТирозинСигма-ОлдричT3754
ФенлилаланинСигма-ОлдричP2126
АспартатСигма-ОлдричA9256
ВалинСигма-ОлдричV0500
ЛейцинСигма-ОлдричL8000
ИзолейцинСигма-ОлдричI2752
УрацилСигма-ОлдричU0750
ГилцеролСигма-ОлдричG5516
АрабинозаSigma-AldrichA3256
ТетрацилинSigma-Aldrich87128
Taq ДНК-полимеразаThermofisher Scientific10342-020
Платина pfx ДНК-полимеразаThermofisher Scientific11708-013
T4 ДНК-лигазаThermofisher Scientific15224-041
E. coli Dh5-альфаThermofisher Scientific18258012
E. coli Top10Thermofisher ScientificC4040-03
pET100D/топовекторThermofisher ScientificK100-01
pCR2.1 ВекторThermofisher ScientificK2030-01
Микроцентрифуга Дженерик

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gillum, A. M., Tsay, E. Y., Kirsch, D. R. Isolation of the Candida albicans gene for orotidine-5'-phosphate decarboxylase by complementation of S. cerevisiae ura3 and E. coli pyrF mutations. Mol Gen Genet. 198, 179-182 (1984).
  2. Hudson, A. O., Singh, B. K., Leustek, T., Gilvarg, C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Functional ComplementationEnzyme Activity AssayGene Function AnalysisElectroporation TransformationBacterial Mutant SelectionIn Vivo ConditionsAmino Acid MetabolismPeptidoglycan SynthesisStringent Response PathwayArabidopsis Thaliana

Related Articles