Выделение и характеристика отдельных клеток из эмбрионов данио рерио

Большинство современных исследований клеточной и молекулярной биологии основаны на средних показателях населения. Тем не менее, важные биологические события могут быть замаскированы этих традиционных анализов населения на основе, так как небольшие группы населения могут играть важную роль в биологических процессах и исход заболевания. Понимание экспрессии генов в гетерогенных популяций на уровне одной клетки может (и имеет) приводят к соответствующим биологическим и клиническим прозрений ^1,2. Беспокойство исследований эмбрионального развития, в большей популяции клеток, клетки - предшественники часто недостаточно представлены, что делает его сложным для обнаружения тонких изменений в экспрессии генов , которые в конечном счете , инициирующих клеток судьбы решений ^3. Точно так же, один тип клеток , могут иметь различные профили экспрессии в ответ на микроокружение ^4. Например, эндотелиальные клетки - резиденты в том же органе или в различных органах (например., Аорте или почек) проявляют значительную гетерогенность , несмотря на общий обмен morphological и функциональные особенности ^5. Кроме того, раковые клетки , обитающие той же опухоли также могут иметь различные молекулярные профили или мутации на уровне одной клетки ^6.

В модельных системах, транскриптомика в одиночных камерах успешно идентифицировали новые клеточные популяции, характеризуются промежуточными состояниями , которые происходят во время дифференцировки клеток, и выявили дифференциальные клеточные реакции на стимулы ^7,8,9. Такое понимание был бы замаскирован в обычных популяционных исследованиях. Эмбрионы рыбок данио являются чрезвычайно малоиспользуемых источником стволовых, прародителя и дифференцируя клеток для изучения вопросов одной гетерогенности клеточной и молекулярной регуляции клеточных идентичности в процессе развития. Их весьма стереотипны, исключая виво развитие и простота генетических манипуляций делают их отличной моделью системы для такого подхода ^10,11. В частности, основным ограничением для интерпретации одного клеточного гене выражение данных является то , что надежная идентификация новых промежуточных состояний клеток в процессе развития требует очень тщательного сроки сбора ткани ^9. Это необходимо для того, чтобы гарантировать, что гетерогенность между захваченными клетками представляет гетерогенность в пределах ткани в одной точке времени, а не гетерогенность экспрессии гена, представленного возрастного дифференциации клеток. По сравнению с мышами, развитие эмбриона данио рерио могут быть точно синхронизированы через большое количество эмбрионов ^12. Кроме того, при больших размерах сцепления, данио эмбрионы могут быть использованы в качестве обильного источника стволовых и клеток-предшественников.

Этот протокол описан способ выделения клеток из эмбрионов данио и захвата отдельных клеток с использованием коммерчески доступного чипа и autoprep интегрированной системы микрофлюидики схема (МФК) для анализа экспрессии генов QRT-PCR. Этот протокол может быть быстро передаваемом к любым мультиплексирование с высокой пропускной способностью анализов, включая целомтранскриптомный секвенирования , которая позволяет более всесторонний анализ клеточной неоднородности ^13. Он также предлагает ряд преимуществ для традиционных анализов экспрессии генов. Один протокол изоляции клеток дает высокую жизнеспособность после FACS, что уменьшает долю скомпрометированных клеток, которые включены в последующих применений. Используя IFC, захваченные клетки могут наблюдать непосредственно оценить скорости захвата и оценки состояния здоровья клеток морфологически. Кроме того, этот протокол широко применима к данио научное сообщество, требуя только меченый трансгенной линии рыбы и доступ к микрофлюидальных технологии улавливания клеток.

В качестве доказательства принципа, отдельные клетки, полученные из кардиальных предшественников были выделены и захваченный на чипе МФК, а затем относительное обилие кардиомаркеров дифференцировки измеряли с помощью QRT-PCR. Анализ экспрессии генов на уровне одной клетки показывает, что сердечные клетки-предшественники сосуществуют с их differentiating потомством. Понимание того, полученные от одноклеточного профилирования сердечных клеток-предшественников может пролить свет на неоднородности в экспрессии генов моделей среди сердечных клеток-предшественников в процессе развития позвоночных животных, которые могут быть замаскированы в традиционных анализов популяций.

Этот протокол требует использования живого, взрослых данио для получения эмбрионов. Эмбрионы собирают для сбора ткани. Крайне важно, чтобы получить одобрение соответствующих советов по этике обзора для проведения этого эксперимента.

1. Получить постановочные зародыши

1. За день до начала эксперимента, подготовить здоровую, взрослых данио для разведения. Поместите один мужчина и одна женщина на противоположных сторонах четкого делителя в разведении танк.
2. Повторите 1.1 столько селекционных танках, необходимых для производства достаточного эмбриона для нисходящего применения. Получают из эмбрионов как дикого типа рыбы и трансгенных рыб, которые экспрессируют флуоресцентные белки в типе клеток, представляющих интерес.
   Примечание: Количество эмбрионов, необходимых для последующих применений в шагах 2-8, зависит от относительного содержания клеток, представляющих интерес в момент точки интереса. Хотя это может варьироваться в зависимости от типа клеток, 200 эмбрионов производят 2,000-5,000 отсортированные клетки, когда сгезов, представляющих обоюдный интерес <1,0% от общего числа клеток на 24 HPF (ч после оплодотворения).
3. На следующее утро, менять воду в панировке резервуаре путем переноса рыбы свежей селекционной бак и удалить разделитель. Наклоните бак под углом, чтобы стимулировать размножение.
4. Сбор постановочные эмбрионов.
   1. Каждые 15 мин, собирают эмбрионов путем переноса взрослых на свежий разведение танк и прохождения яйца, которые остались позади через ситечко.
      Примечание: Эмбрионы рыбок данио развиваются синхронно, когда поддерживается при сравнимых плотностей и температур.
   2. Полоскание яйца с яйцом воды (0,21 г / л Мгновенные соли океане в 1 л дистиллированной воды) и переносят в чашку Петри. Передача чашку Петри на влажной инкубаторе при температуре 28,5 ° С с циркуляцией воздуха.
5. Через два часа после последнего сбора, сортировки оплодотворены, многоклеточные эмбрионы в 10 см чашки Петри и уменьшить плотность до 50 эмбрионов на чашку. Выберите эмбрионы из одного, 15мин временное окно сбора ниже по течению приложения. Инкубируйте эмбрионов на 28,5 ° C.
   Примечание: Например, сбор эмбрионов в 8:30, 8:45, 9:00, 9:15, 9:30, 9:45, 10:00 и 10:15. Сравнивая между моментами времени, если наибольшее количество оплодотворенных эмбрионов из тисков, собранных в 9:00, а затем использовать только эти зародыши для последующих применений.

2. Настройка для одного сотового Разобщения

1. Приблизительно за 30 минут до времени точки интереса (18 ФВЧ) удалить эмбрионов из их хориона вручную с тонким пинцетом.
2. Сбор и обозначить следующие действия для каждого условия: два 2 мл микроцентрифужных трубки, один 40 мкм клеточный фильтр, один 35 мм блюдо культуры клеток, и два FACS трубки увенчанный ячейки фильтра 35 мкм.
3. Охладить следующие реагенты на льду: Яйцо Вода, содержащая 0,21 / л соли Instant Ocean в 1 л двойной дистиллированной воды; Де-yolking буфера , содержащего 55 мМ NaCl, 1,8 мМ KCl, и 1,25 мМ NaHCO ₃; и FACS-буфера, содержащего L-15 Лейбовиц, дополненной 5% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки.
4. Принесите 1 мл на образец для диссоциации клеток Реагент 1 до комнатной температуры. Оттепель 1 мл Cell диссоциация Реагент 2 на пробу на льду. Доведите немедленно RT перед использованием.

3. Single Cell диссоциация

1. Используя широкий отверстие стеклянной пипетки переносят 100-300 эмбрионов в 2 мл микро центрифуге трубки в минимальном объеме воды яйцо.
2. Эвтаназии эмбрионов путем замены воды с 1 мл охлажденного льдом Яйцо Вода и погружая трубку во льду в течение 20 мин.
   ВНИМАНИЕ! Очень важно , чтобы получить одобрение от надлежащего институционального комитета по надзору по уходу за животными для этого метода эвтаназии (охлаждения на льду с последующей клеточной диссоциации в качестве вторичного эвтаназии). Стандартный эвтаназии, как правило, требует, чтобы эмбрионы <3-й день после оплодотворения отбеливают после того, как они охлаждаются, которые не подходят для получения жизнеспособных клеток.
3. Промыть эмбрионы два раза 1 мл охлажденного льдом Яйцо Вода. Для мытья используйте широкий отверстие стеклянной пипетки, чтобы удалить яйца воды и P1000, чтобы добавить яйцо воды.
4. Удалите желток путем замены эмбриона воды с 1 мл буфера Deyolking и растиранием 8-12 раз с наконечником P1000, или пока желток не растворится, и только тела эмбрионов видны.
5. Собирают ткани путем центрифугирования при 300 мкг в течение 1 мин. С помощью пипетки, чтобы аккуратно удалить супернатант, не нарушая гранул ткани. Повторное приостановить в 1 мл воды яйцо.
6. Повторите шаг 3.5 в общей сложности на трех промывок, а на последней промывки, вновь приостановить в 1 мл RT диссоциации клеток Реагент 1.
7. Выдержите в диссоциации клеток Реагент 1 в течение 10 мин при комнатной температуре с трубками расположен горизонтально. Каждые 2-3 мин, осторожно растирают с P1000 пипетки, чтобы предотвратить слипание.
   Примечание: Ручка образцы осторожно во время выполнения действий тритурационного. Когда-нибудь один, большой комок будет формировать в трубке из клубка тел эмбрионов. Это будетразойтись с дополнительным переваривания помогший нежным растиранием. НЕ VORTEX.
8. Собрать ткань центрифугированием при 300 х г в течение 3 мин. Удалить супернатант и ресуспендируют в 1 мл клеточной диссоциации реагента 2.
9. Выдержите в течение 5-15 мин при комнатной температуре. Место труб в горизонтальном направлении. Каждые 2-3 мин, аккуратно растереть, чтобы предотвратить слипание. Каждые 5 мин, оценить прогресс пищеварения.
   1. Для того, чтобы оценить прогресс пищеварения, развести 2 мкл супернатанта в 18 мкл FACS буфера и пипеткой в ​​капельке на клеточной культуре блюдо.
   2. Поместите покровное над образцом и наблюдать под микроскопом культуры ткани в 10х и 20х увеличениях.
      Примечание: Препарат должен появиться как смесь отдельных клеток, малых кластеров, больших кластеров, а также время от времени в основном поврежденную тела эмбриона.
   3. Визуально оценить долю препарата, который отдельные клетки и небольшие кластеры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерное пищеварение приведет к снижению жизнеспособности; под-пищеварение приведет к снижению одного выхода клеток. </ Li>
10. Сбор клеточного препарата путем центрифугирования при 300 мкг в течение 5 мин. Удалите супернатант и повторно приостанавливать в 1 мл холодного FACS буфера.
11. Смочить фильтр грубой очистки ячейки 40 мкм с FACS буфером. Передайте клеточной суспензии через сито 40 клеток мкм на 35 мм для культивирования клеток блюдо с. Промыть клеточный фильтр один раз с 1 мл FACS буфера сортировки.
12. Передача Проточный в микроцентрифужных пробирку 2 мл. Собирают клетки центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин и вновь приостановить в 100 мкл FACS буфера.
13. Граф выхода клеток с использованием гемоцитометра. Далее разбавленные образцы до 5х10 ⁶ клеток на мл, или оптимальной концентрации , рекомендованных для FACS машины выбора. Дополнительно, при подсчете выхода клеток на гемоцитометра, контрастное мертвые клетки с трипановым синим, чтобы подтвердить жизнеспособность клеточного препарата до начала FACS сортировки.
    Примечание: Препараты, которые слишком разведенным будут принимать избыточное количество времени для сортировки. Препараты, которые тоже сoncentrated имеют тенденцию группироваться в мультимеры и неоптимальным для сортировки чистую популяцию.
14. Резерв 10-20% от каждого образца, чтобы использовать в качестве неокрашенных элементов управления. Для остальных образцов, пятно мертвых клеток путем добавления / мертвых (L / D) дискриминация флуоресцентный краситель живой в каждом образце. Не мой.
    Примечание: Любой флуоресцентный краситель, который проникает клетки с ослабленной клеточных мембран и пятен нуклеиновые кислоты могут быть использованы в качестве L / D красителя, при условии, что спектры флуоресценции совместим с машиной FACS выбора и маркировки флуорофора интересующих клеток.
    1. Не мойте препарат после добавления красителя, как некоторые клетки умирают в пути к очистке FACS и должны быть исключены из отсортированного населения.
15. Смочить сетчатый фильтр 35 мкм клеток FACS колпачком трубку с 20 мкл FACS буфера. Добавить ячейки в ситечко и собирать под действием силы тяжести. Хранить на льду.

4. FACS Обогащение

1. Используйте FACS для обогащения одного, Живые клетки, экспрессирующие флуоресцентный маркер.
   1. Установить ворота, чтобы отличить клетки от мусора на график рассеяния вперед рассеяния (FSC-A) амплитуды против бокового рассеяния амплитуды (SSC-A), как с линейного масштабирования.
      Внимание! Рыбок данио клетки , как правило , меньше , чем мышь или человеческих клеток. Это нашло отражение в более низкой базальной разделения между клетками и мусором.
   2. От ворот, установленного в 4.1.1, установить ворота для обогащения отдельных клеток и исключить мультимеры, используя график рассеяния высоты переднего рассеяния (FSC-H) и низкой высоты бокового рассеяния (SSC-H), как с линейного масштабирования.
      Примечание: Клетки с непропорционально высоким FSC-H и низкой SSC-H являются вероятными мультимеры и исключены из сортировки.
   3. Из множества ворот в пункте 4.1.2, используя одиночные элементы управления цветом, установите ворота, чтобы включать только живые клетки, используя график рассеяния FSA-А с линейным масштабированием и амплитуды канала, используемого для обнаружения L / D пятно с масштабированием журнала. Включите L / D-отрицательных клеток.
   4. Изворота установлены в п.4.1.3, с помощью одного средства управления цветом, установите ворота, чтобы включать только живые клетки с положительной флуоресценции, используя график рассеяния FSA-А с линейным масштабированием и амплитуды канала, используемого для обнаружения флуоресцентного белка клеточный маркер с масштабированием журнала , Включайте позитивные клетки.
   5. Установите любые элементы управления компенсации, в случае необходимости, для учета помех между L / D пятно и флуоресцентного белка спектров.
2. Набор логики сортировки к клеткам, которые попадают во все ворота, установленные на шаге 4.1.
   1. Использование двойной меченых клеток, проверить стробирования для сортировки клеток.
      Примечание: Клетки для сортировки будут клетки, а не мусор, отдельные клетки, а не мультимеры, L / D отрицательные и положительные флуоресценции клеток.
3. Сортировка 2000-4000 клеток из популяции интерес в 5 мкл холодного FACS буфера в микроцентрифужных трубки на льду. Чтобы свести к минимуму стрижку и напряжение на клетки во время сортировки, используйте самые низкие давления возможно для клеткисортировщик.
   Примечание: 5 мкл капелька FACS буфера служит в качестве подушки безопасности для клеток, покидающих машину FACS. Сбор 2000-4000 клеток непосредственно в FACS буфера устраняет необходимость центрифугирования перед загрузкой на чипы МФК. Эта стратегия рекомендуется, так как центрифугирование может привести к образованию мультимеров, если клетки прилипать друг к другу в осадке.
4. Оценка анализа жизнеспособности после сортировки.
   1. Передача 1 мкл сортируется клеток в свежую FACS пробирку с 100 мкл FACS буфера сортировки и 1: 1000 разбавлении L / D пятно. Проходят клетки через сортировщика FACS со стратегией стробирования на шаге 4.1. Используйте соотношение L / D отрицательного к положительному для оценки жизнеспособности отсортированных клеток.

5. Тензодатчики на Microfluidics Chip

1. С помощью гемоцитометра, измерять как концентрацию и размер отсортированных клеток.
   1. Развести отсортированных клеток по меньшей мере 10 мкл. Развести аликвоту 5 мкм; Л клетки с 5 мкл трипанового синего. Нагрузка на гемоцитометра и применять покровное.
   2. Собирают яркие полевые изображения всех ячеек в 4 х 4 сетками гемоцитометра. Подсчитайте количество живых клеток и вычислить живых клеток / мл. Живые клетки не занимают трипановым синим.
      Примечание: Используйте любое стандартное программное обеспечение для анализа изображений для измерения диаметра всех живых клеток. Рассчитайте среднее и стандартное отклонение размера ячейки и выберите пластину IFC, подходящую для диапазона размеров клеток, представляющих интерес. Если диапазон размеров ячейки колеблется в диапазоне размеров ячейки пластины IFC, используют несколько пластин, чтобы охватить весь диапазон ячеек, представляющих интерес.
2. Дозаторы к пластине IFC в соответствии с инструкциями производителя (см Материалы).
   1. Развести клетки 1x10 ⁶ клеток / мл , и выполнить оптимизацию плавучести в соответствии с инструкциями изготовителя.
      Примечание: оптимизация Плавучесть гарантирует, что клетки, ни один не оседают на дно и не всплывают на верхней части загрузочной достл для оптимальной загрузки на чипе IFC. Отношение буфера к клеткам, может варьироваться в зависимости от типа клеток, но обычно находится в пределах 6: 4-7: 3 ячеек: буфер.
   2. Добавить клетки к загрунтованную-IFC пластины. Загрузка пластины в совместимые гидросистемы машины, и запустить скрипт нагрузки сотовой ячейки, чтобы подтолкнуть клетки через микрофлюидики цепи и в захват полос движения.
3. Убедитесь, что клетки поселены в захвате участков на пластине МФК.
   1. Удалить МФК пластину от гидросистемы машины. Установите пластину МФК на микроскоп, снабженный адаптером пластины.
   2. Собирают снимки светлого поля и флуоресценции для каждого участка захвата на 10-кратным увеличением.
      Примечание: Светлое раз захвата может находиться в диапазоне от 10-50 мс, в зависимости от интенсивности лампы. раз захват флюоресценции может находиться в диапазоне от 250-750 мс, в зависимости от яркости флуорофора. Избегайте передержки клеток, чтобы предотвратить фотоповреждения.

6. Синтез кДНК

1. Выполнение лизис клеток на месте в соответствии с IИнструкция ФК пластинчатого производителя.
   1. Добавить лизиса буферы в лунки на пластину МФК. Загрузка пластины на совместимые гидросистемы машины и лизиса сценарий запуска ячейки в соответствии с инструкциями изготовителя.
2. Выполнение обратной транскрипции в соответствии с инструкцией МФК пластинчатого изготовителя.
   1. Добавить обратной транскрипции реагенты пластины IFC. Загрузка пластины на совместимые гидросистемы машины. Выполнить скрипт обратной транскрипции. Примеры Циклическую: 1 цикл при 25 ° С в течение 10 мин, 1 цикл при 42 ° С в течение 1 ч, а затем 1 цикл при 85 ° С в течение 5 мин.
3. Выполнение предварительного усиления с помощью зондов геноспецифических в соответствии с инструкциями МФК пластинчатого изготовителя.
   Примечание: Из-за их большей специфичности с номерами низкокопийных, используйте флуорогенные-меченых зондов, а не датчики, оптимизированные для использования с интеркалятором красителей.
   1. Бассейн праймеров и разбавить до конечной 180 нМ каждого. Добавить объединенных праймеров к пластине IFC. Загрузка пластины на совместимых fluidiCS машина. Запуск предусиление сценария.
4. Выполнение предварительного усиления со следующими условиями цикла: 1 цикл при 95 ° С в течение 10 мин, затем 18 циклов при денатурации при 95 ° С в течение 15 с последующим отжигом и удлинение при 60 ° С в течение 4 мин. Хранить предварительно усиливается кДНК при 4 ° С до сбора урожая. Урожай кДНК из микрожидком пластины в соответствии с инструкциями изготовителя и хранить при температуре -20 ° С до использования.

7. Выберите кДНК из одиночных клеток для одиночной мишени QRT-PCR

1. Развести кДНК в 25 мкл реагента для разведения в соответствии с инструкциями изготовителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Примерный конечный выход составляет 28 мкл предварительно амплифицированный кДНК на клетку. Резервный аликвоты разбавителя для использования в качестве контроля не-шаблона в QRT-PCR.
   1. Ссылаясь на светлом поле и флуоресцентных изображений, записанных на этапе 5.3.2, оценка каждого участка захвата. Вручную подсчитывать и записывать количество клеток. Проведение оценки и записи каждая клетка является ли гриппorescent.
      Примечание: Каждый отдельный сайт может содержать 0, 1 или> 1 ячейку, где> 1 ячейка включает в себя сайты захвата, которые содержат несколько ячеек и / или неопределяемый мусора. Если изображения достаточное качество, значение пикселя также может быть назначен для количественного определения интенсивности флуоресцентного сигнала.
2. Выбор образцов для анализа QRT-PCR.
   1. Выбор образцов кДНК из участков захвата, идентифицированных в шаге 7.2, которые содержат точную 1 ячейку с положительной флуоресценции. Пул 1 мкл аликвоты кДНК из каждого образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это положительный контроль "бассейн", используемый для определения того, выражены гены интерес в любом из выбранных ячеек.
   2. Выберите кДНК из по меньшей мере одного участка захвата, который содержит ровно 0 клеток в качестве отрицательного контроля. Использование разбавителя из стадии 7.1.2 в качестве контроля не-шаблона.
3. Запуск QRT-ПЦР.
   1. Используйте только зонды, используемые для предварительного усиления на этапе 6.4.1. Загрузите все образцы в triplicatе. Циклическую для реакции 10 мкл на 384-луночного планшета: 1 цикл 50 ° С 2 мин, 1 цикл 95 ° С в течение 10 мин, 40 циклов с денатурации при 95 ° С 15 сек, то отжиг и удлинение при 60 ° С в течение 1 минимум

Анализ 8. Данные

1. Проверка продуктов QRT-PCR с помощью стандартного гель-электрофореза. Подтверждение продукт представляет собой одну полосу при ожидаемой молекулярной массы (изменяется для каждого зонда).
   Примечание: Если зонд производит несколько полос или одну полосу в неподходящий размер, то специфичность вызывает сомнения, и это исключает ген из анализа.
2. Изучите все кривые усиления и счета для любых аномалий ^14. Вычислить среднее значение CT для каждой комбинации образец / гена ^15.
   Примечание: значения CT для положительного контроля, как правило, в диапазоне от 10-30. значения CT для отрицательных контролей обычно находится в диапазоне от 35-40 (без усиления). Значения CT 30-35 считаются очень низкая экспрессияи их следует интерпретировать с осторожностью ^14.
3. данные отчетов
   1. Если образцы попадают в КТ = 10-30, данные могут быть также представлены как кратное изменение в транскрипт численности по сравнению с контрольным образцом.
      Заложите изменение равна 2 ^ ^{(- ΔΔCT)} , где & Delta ; CТ относительно к гену домашнего хозяйства путем вычитания среднего КТ образца из гена домашнего хозяйства и ΔΔCT является разница в & Delta ; CТ между образцом и положительным контролем ^15.

В качестве доказательства принципа, экспрессия генов оценивали исследовать динамику дифференциации во время развития сердца. В данио, сердечные клетки-предшественники возникают из мезодермы популяции клеток, которые мигрируют к передней боковой пластинки мезодермы, где они сливаются, образуя линейную сердечную трубку. До слияния, сердечные клетки - предшественники начинают выражать фактор транскрипции Nkx2.5 (NK2 гомеобоксных 5), который , как полагают, является самым ранним маркером сердечных клеток - предшественников 16,17. Здесь, описано ранее BAC трансгенная рыба Tg (Nkx2.5: ZsYellow) 18, сокращенно Nkx2.5: ZSY был использован для изучения сердечных маркеров дифференцировки в одиночных камерах на 18 сомитов, 18 ч после оплодотворения (ФВЧ) 12. Это было самое раннее время точка, в которой ZsYellow сигнал был визуально обнаружить. Как было описано ранее для этой трансгенной линии, ZsYellow этикетки сердечные клетки-предшественники, так как мыLL как несколько экстра-сердечных клеток , которые приводят к жаберные дуги эндотелиальные клетки на 28 ФВЧ 19 (рис 1A-B, данные не показаны). В 18 часов после оплодотворения, Nkx2.5: ZSY эмбрионы были диссоциированы в единую клеточную суспензию затем окрашивали Sytox синим , чтобы исключить мертвые клетки. Живой, ZsYellow положительный, Sytox Синие отрицательные клетки были FACS отсортированы с использованием либо MoFloXDP или Sony SH800Z сортировщик , оснащенный насадкой 100 мкм (рис 1C-F). Для оценки чистоты отсортированной населения и после сортировки жизнеспособности аликвоту отсортированных клеток окрашивали Sytox синим и оценивали процент событий, выпавшую в пределах первоначального сортировочной ворот (рис 1G-J).

После сортировки клетки были введены в единую цепь Микрожидкостных (IFC) чип рабочего потока (рис 2А) в соответствии с инструкциями изготовителя. Гемоцитометра, в сочетании с трипановым синим exclusioп использовали для измерения диаметра клеток, концентрацию и жизнеспособность (Фигура 2В, и данные не показаны). Cell плавучести был оптимизирован (6,5: 3,5 клетки: буфер) в соответствии с инструкцией изготовителя, и клетки были загружены на МФЦ, чтобы захватить клетки диаметром 5-10 мкм. Для оценки эффективности улавливания, флуоресценции и / или яркие полевые сигналы были обследованы на всех объектах захвата, функция плиточные в ФИДЖИ использовалась, чтобы сшить одну картину пластины микрофлюидики. Каждый сайт захвата содержал 0, 1 или> 1 отдельные клетки (рис 2C-F). Как и следовало ожидать от FACS обогащения, захваченные клетки экспрессируют ZsYellow (рис 2G). Эффективность захвата превышала 90% в течение 5 отдельных экспериментов с использованием Nkx2.5: ZSY отсортирован клетки, и по меньшей мере 70% участков захвата были заняты одной клетки (данные не показаны). Клетки лизируют, РНК, выделенной, кДНК синтезировали и специфические гены-мишени были усилены, все в соответствии с инструкциями производителя.

Подмножество сайтов захвата клеток были отобраны для анализа QRT-PCR, как описано в протоколе выше. В частности, фактор элонгации 1а (efl1a) 20 и глицеральдегид 3-(GAPDH) 21 анализировали в качестве генов домашнего хозяйства , как ожидается, будут выражены в каждой клетке; GATA - связывающий белок 4 (GATA4) 22 и NK2 гомеобоксный 5 (Nkx2.5) , как ранние сердечные маркеры предшественников; ISL LIM гомеобоксный 1 коробка 1 (Isl1) в качестве второго поля сердца маркера 23,24; и легкой цепи миозина (myl7) и желудочковой тяжелой цепи миозина (vmhc) 25 , чтобы отметить желудочковых кардиомиоцитов. Гено-специфические зонды были проверены с использованием кДНК из 48 эмбрионов HPF (рисунок 3). QRT-ПЦР использовали для оценки относительного экспрессии генов этих генов в 45 отдельных клеток от 18 HPF эмбрионов, отрицательный контроль не-шаблон, и объединенный популяции положительных containi контролянг кДНК из всех 96 участков захвата. Значения Сырое CT для 40 репрезентативных клеток и органов управления, приведены в таблице 1. Следует отметить, что из пула 46 клеток исследованных 6 клеток были исключены из анализа, так как все значения КТ экспрессии генов превышена CT = 35,0, и неизвестно, являются ли эти высокой КТ значения могут быть отнесены к истинным, очень низким уровнем экспрессии или деградации образца. Поскольку диапазон значений CT для гена домашнего хозяйства, ef1a, был слишком широким , чтобы сравнить экспрессию генов между образцами, и многие значения CT превысили 30, значения CT визуализировали как тепловой карте (рисунок 3). Сравнение по образцам, наблюдалось существенное гетерогенность экспрессии генов, и клетки классифицировали клетки как тип 1-5 на основе паттерна экспрессии (рисунок 3).

Рисунок 1. Одиночные изоляцию клеток данио положительных клеток на 18 HPF Всего горе изображения Tg (представительном Nkx2.5: ZsYellow). эмбриона на 18 часов после оплодотворения с (А) ZsYellow только флуоресценции или (В) объединены с ярким изображением поля. (CF) представитель FACS стратегия стробирования для обогащения ZsYellow положительных клеток и (GJ) анализ после сортировки с (C, G) FSC / SSC размер стробирования, (D, H) дублет дискриминации, (E, I) Live / Dead литниковой и (F, J) сортируется населения. Шкала бар составляет 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2. Одноразовый захвата ячейки данио Nkx2.5: ZSY Онг> положительные клетки. (A) поток работы. (B) распределение по размерам ячеек для отсортированных клеток от Tg (Nkx2.5: ZsYellow) эмбрионов , выделенных на 18 часов после оплодотворения. (CF) Представительные захвата клеток событий пластины МФК , где (C) является пустой хорошо, (D) содержит две ячейки, (Е) имеет одну ячейку , поданную в канале гидросистемы в качестве "канала захвата", и (F) является один захваченный клеток. Фиолетовый ящики для отмечаете вставка увеличенного изображения объектов захвата. (G) Single захвата клеток с светлопольному, ZsYellow и слита изображения. (CF) Белая шкала бар 50 мкм; желтый Шкалы составляет 10 мкм. (G) Шкала бар составляет 10 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

igure 3 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 53877 / 53877fig3.jpg "/>
Не Рисунок 3. Экспрессия генов анализ захвата одного данио Nkx2.5:. ZSY положительных клеток экспрессии генов QRT-PCR в положительных контролей (эмбрионов на 2 дня-после оплодотворения, объединенные кДНК из одиночных клеток), отрицательный контроль (не-шаблон ) и 40 отдельных клеток (Cell 01-40). Значения Сырое CT были закодированы на основе цвета , как это описано в ключе. Ef1a = фактор элонгации 1а, GATA4 = GATA - связывающий белок 4, Nkx2.5 = NK2 Гомеобоксный 5, myl7 = легкой цепи миозина 7, vmhc = желудочковой тяжелой цепи миозина, GAPDH = глицеральдегид-3 фосфат и Isl1 = ISL LIM гомеобоксный 1. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 1. Значения Raw CT.

Авторам нечего раскрывать.