Методическая статья

Комбинированный 3D Tissue Engineered

9.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53885

⸱

6 апреля 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Tissue Engineering and Regenerative Medicine (TERM), University Hospital Wuerzburg, 2Department of Cardiothoracic Surgery, University Hospital Wuerzburg, 3Department of Bioinformatics, University Wuerzburg, 4Translational Center Wuerzburg, Fraunhofer Institute Interfacial Engineering and Biotechnology IGB

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем трехмерную (3D) модель рака легких, основанную на биологическом коллагеновом каркасе, для изучения чувствительности к терапии, не направленной на мелкоклеточный рак легких (НМРЛ). Мы демонстрируем различные методы считывания для определения индекса пролиферации, апоптоза и статуса эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП). Собранные данные интегрируются в модель in silico для прогнозирования чувствительности к лекарственным препаратам.

Аннотация

В настоящем исследовании, мы объединили в пробирке модель опухоли легких 3D с силикомарганца в модели для оптимизации предсказания реакции лекарственного средства на основе конкретных мутационный фоне. Модель генерируется на decellularized свиных эшафот, воспроизводящем тканеспецифические характеристики относительно внеклеточной матрицы состава и архитектуры, включая базальную мембрану. Мы стандартизирован протокол, который позволяет генерировать искусственную опухолевой ткани в течение 14 дней, включая три дня лечения наркозависимости. Наша статья содержит несколько подробных описаний 3D считывания методы скрининга , как определение индекса пролиферации Ki67 окрашивания в, апоптоз от супернатантах M30-ELISA и оценки эпителиальной к переходу мезенхимальных (EMT), которые являются полезными инструментами для оценки эффективности терапевтические соединения. Мы могли бы показать по сравнению с 2D-культуры сокращение распространения в нашей 3D модели опухоли, которое RELATред к клинической ситуации. Несмотря на это более низкой пролиферации, модель предсказал EGFR -targeted ответы наркотиков правильно в соответствии со статусом биомаркеров , как показано сравнением линий клеток карциномы легкого HCC827 (EGFR -mutated, KRAS дикого типа) и А549 (EGFR дикого типа, KRAS - мутировали) была обработана ингибитором тирозинкиназы (ИТК) гефитиниб. Для изучения реакции снадобья более продвинутых опухолевых клеток, мы индуцированный EMT путем длительного лечения с TGF-бета-1 по оценке виментина / пан-цитокератина иммунофлуоресцентного окрашивания. Поток-биореактор был использован для регулировки культуры в физиологических условиях, в котором улучшено образование тканей. Кроме того, мы покажем интеграцию реакций лекарственных средств при лечении гефитинибом или TGF-бета-1 стимуляции - апоптоза, пролиферации и индекс ЕМТ - в булевское в силикомарганца модели. Кроме того, мы объясним, как наркотиков реакции опухолевых клеток с определенным мутационного фона и подсчетаerstrategies против сопротивления можно предсказать. Мы уверены , что наша 3D экстракорпоральное подход особенно с его расширением в силикомарганца обеспечивает дополнительную ценность для доклинических испытаний лекарственных средств в более реалистичных условиях , чем в культуре клеток 2D.

Введение

Фармацевтическая промышленность сталкивается с высокими темпами истирание до 95% в области лечения онкологических заболеваний в клинической фазе вызывает огромные затраты на 1-5. Одной из причин этого дефицита является тот факт, что в настоящее время эффективность потенциальных новых соединений оценивают в крупномасштабных скринингов на клеточных культурах 2D-клеточных линий рака или в моделях на животных. Животные модели имеют более высокий уровень сложности , но есть существенные различия между мужчинами мышей и 6,7. В последнее десятилетие, модели рака 3D с использованием различных подходов были сформированы , чтобы преодолеть разрыв между 2D культуры раковых клеточных линий и комплекса в естественных условиях 6,8,9 опухоли. Воздействие 3D среды на дифференциации клеток , а также на передаче сигналов было показано в нескольких исследованиях лет назад (например., С помощью Mina Bissell) 10,11. Сегодня многие 3D - модели клеточной культуры имеются такие , как сфероида культур, гидрогели или микрожидкостных чипов 12-16. Несмотря на то, Фесе модели повышения сложности по сравнению с традиционными системами 2D культуры, в большинстве случаев они испытывают недостаток в микросреду ткани, который, как известно, опухолевые поддерживающие эффекты, а также влияет на эффективность лекарственного средства.

Для решения этой проблемы, мы получили 3D модель опухоли на основе биологического помост под названием SISmuc (малая кишка-подслизистая + слизистую оболочку) , который является производным от decellularized тощей свиньи. Таким образом, архитектура ткани и важными компонентами внеклеточного матрикса , таких как различные коллагенов, а также структуры базальных мембран сохраняются 17. Эта уникальная особенность имеет решающее значение для опухолевой модели генерации карцином, которые возникают из эпителием и содержат около 80% твердых опухолей. Кроме того, скорость распространения в нашей модели опухоли тканевой инженерии снижается по сравнению с искусственно высокими показателями, достигнутыми в 2D культуре. Поскольку распространение является важным параметром при оценке эффективности лекарственных средств, тестирование на наркотики включена в нашей модели более похожиусловия в естественных условиях 17 опухолей.

Для того , чтобы оценить потенциал нашей модели , чтобы правильно спрогнозировать биомаркеров-зависимый эффективность препарата, мы здесь представить данные для двух различных клеточных линий рака легких , которые отличаются по своему статусу EGFR -biomarker. Этот мутационный статус начал определяться рутинно у пациентов с немелкоклеточным раком легких. Целенаправленные процедуры с ИТК , такие как EGFR Ингибитор гефитинибом против опухолей , несущих мутации EGFR активируя показать более высоких результатов по сравнению с теми , с платиновой химиотерапии на основе 18-21.

Мы создали несколько методов для чтения, что имеют отношение к оценке эффективности соединения. Кроме того, после того, как TGF-бета-1 стимуляции мы можем исследовать сложные действия в опухолевых клетках , которые начали процесс ЕМТ, который , как полагают, является важным шагом в злокачественной трансформации 22,23 и который соединен с оМ наркотиковCE 24.

3D модель опухоли позволяют мониторинг клеточных конкретных ответов целевых методов лечения, химиотерапии или комбинации препаратов с хорошими контрастов. В целях дальнейшего укрепления и ускорения наркотиков скрининга и столкнуться с сопротивлением, это дополняется в силикомарганца моделирования. На основе нескольких экспериментов, реакция опухоли может быть предсказано в силикомарганца относительно результатов для полного спектра лекарственных средств и их комбинаций.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Двумерная (2D) Культура клеток

  1. Коммерчески получить линии опухолевых клеток HCC827 (DSMZ). Культура легких клеток аденокарциномы линии HCC827 (EGFR , мутировали, KRAS дикого типа) в среде RPMI-1640 с добавлением 20% FCS. Изменение средней каждые 2 - 3 дня. Разделите клетки два раза в неделю. Клетки используют до прохода 20 не будет достигнуто.
  2. Коммерчески получить опухолевых клеток линии А549 (DSMZ). Культура карциномы легких клеток линии А549 (EGFR дикого типа, KRAS мутантного) в среде RPMI-1640 с добавлением 10% FCS. Выполните культуру, как указано выше. Клетки используют до прохода 20 не будет достигнуто.
  3. Проверьте клетки регулярно (каждые 4 - 6 недель) для загрязнений, таких как микоплазмы загрязнениями.
  4. Культивирование A549 или HCC827 клеток на покровные стекла
    1. Поместите 1 стерильный покровного стекла в каждую лунку 24-луночного планшета с использованием пинцет.
    2. Семенной 50000 опухолевых клеток обеих клеточных линий в объеме 500 мкл в лунках сстеклянные покровные, соответственно.
    3. Культуры клеток , пока они не достигают слитности 70% при стандартных условиях культивирования (37 ° С, 5% СО 2). За это время отсасывает старой среды с использованием пипетки Пастера и добавляют 500 мкл свежей среды, через каждые 2 - 3 дня культивирования.

2. Генерация Опухоль тест-систем на биологическом Коллаген строительные леса

  1. Статические условия культивирования
    1. Генерирование decellularized небольшой кишка-подслизистой + слизистую оболочку (SISmuc) и закрепить их между двумя металлическими кольцами, так называемые клеточные коронок, как описано в предыдущей публикации 25.
    2. Семенной 100000 клеток либо HCC827 или клеток А549 в общем объеме 500 мкл на сторону бывших просвете кишечника зафиксированной в клеточных коронок.
    3. Разрешить опухолевым клеткам прилипать в течение 2 ч при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2. Добавьте 1 мл среды внутри клеток короны и 1 мл снаружи.
    4. Культура опухольмодель в статических условиях при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 в инкубаторе в течение 14 дней. Изменение культуральной среды через каждые 2 - 3 дня. Поэтому, аспирация среды с помощью пипетки Пастера и пипеткой 1 мл свежей RPMI с соответствующим количеством FCS (А549: 10%, HCC827: 20%) внутри клеток короны и 1,5 мл той же среды снаружи.
  2. Динамические условия культивирования
    1. Настройка тестовой системы опухоли с decellularized матрицей внутри клетки коронок и посевом клеток, как описано в подразделе 2.1.1 2.1.3.
    2. Культура модель опухоли в статических условиях при 37 ° С, 5% СО 2 в инкубаторе в течение 3 -х дней.
    3. Соберите автоклавного биореактор и вставьте посеяны SISmuc, опубликованной ранее 25.
    4. Пипетка 45 мл RPMI с соответствующим количеством FCS (A549: 10%, HCC827: 20%) в колбу и соединяют безигольчатой ​​устройство для взятия проб в системе трубопроводов между биореактора асреда колбу.
    5. Поместите биореактор в инкубаторе, подключить его к насосу и культуре модель опухоли в дополнительных 14 дней с постоянным потоком среды (3 мл / мин) при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2.
    6. Изменить всю культуральную среду после того, как 7 дней. Для этого переместите биореактор из инкубатора под колпаком с ламинарным потоком. Аспирируйте среду в СМИ колбу с помощью пипетки Пастера. Поднимите биореактор, аспирируя избавиться от среды в системе трубопроводов. Пипетка 45 мл свежей среды в колбу. Поместите биореактор обратно в инкубатор и подключить его к насосу.

3. Лечение статической модели с опухолью Gefitinib

  1. Культура модель опухоли, как описано в разделе 2.1.
  2. На 11-й день культуры, подготовить RPMI / FCS с 1 мкМ гефитинибом (2,5 мл для каждой ячейки короны). Аспирируйте старую среду из лунок с помощью пипетки Пастера и добавляют 1 мл приготовленного RPMI / FCS / гефитинибом внутри тон клетка короны и 1,5 мл той же самой среды снаружи.
    Примечание: размораживали гефитиниб раствор можно хранить при температуре 4 ° С в течение одной недели.
  3. Изменение среды на 13-й день, как описано в пункте 3.2.

4. Стимулирование статической модели с опухолью TGF-бета-1 для ЕМТ Induction

  1. Культура модель опухоли, как описано в разделе 2.1.
  2. На 3-й день культуры, подготовить RPMI / FCS с 2 нг / мл TGF-бета-1 с носителем (2,5 мл для каждой ячейки коронки). Аспирируйте старой среды из скважин с использованием пипетки Пастера и добавляют 1 мл приготовленного RPMI / FCS / TGF-бета-1 внутри клетки короны и 1,5 мл той же среды снаружи. Измените среда с добавлением TGF-бета-1 каждые 2 - 3 дня до 14-й день, как описано в разделе 4.2.

5. Read-ауты

  1. Взятие проб для ELISA измерений
    1. Отбирают образцы из супернатантов статической (раздел 2.1) и динамической (раздел 2.2) культуры во времяЛечение с гефитинибом (раздел 3) в дни 11-14 культуры , как показано на рисунке 2. Кроме того, взять пробу перед обработкой (Т0).
    2. В статических условиях культивирования, можно получить до 100 мкл пробы из внутренней части клеточной короны. В динамических условиях культивирования, винт шприц на устройстве для отбора проб и принимать по 1 мл среды из системы биореактора. Хранить все собранные супернатанты при -80 ° С до тех пор, ELISA, не выполняется.
  2. M30-ELISA для Апоптоз Количественное
    1. Для количественной оценки апоптоза в супернатанты выполнения анализа гибели клеток в соответствии с инструкциями изготовителя. Разрешить все реагенты для достижения RT перед выполнением анализа.
    2. Vortex все реагенты. Разведите промывочную таблетку в 500 мл свежей деионизированной водой. Развести конъюгат пероксидазы хрена с 9,2 мл Сопряженных разбавляющего буфера и перемешать. Пипетка 25 мкл стандарта или пробы на лунку.
    3. Добавьте 75 мкл разведенного HRP ConjuВорота раствора в каждую лунку. Закройте планшет и инкубировать ее на шейкере в течение 4 ч при комнатной температуре. Промыть пластины вручную, в 5 раз с 250 мкл приготовленного промывочного раствора.
    4. Добавить 200 мкл 3,3 ', 5,5'-тетраметилбензидин (ТМВ) субстрата в каждую лунку. Инкубируют в темноте при комнатной температуре в течение 20 мин. Добавьте 50 мкл стоп-раствора в каждую лунку. Встряхните планшет в течение 10 секунд и оставьте микропланшет в течение 5 мин перед чтением абсорбцию. Определяют оптическую плотность при длине волны 450 нм в ридере для микропланшетов. Вычислить стандартную кривую и концентрации в образцах, используя соответствующую программу для обработки данных типа ELISA, такие как происхождение.
  3. образец Окрашивание
    1. Крепление, Парафин-вложение и раздел Подготовка 3D - модели
      1. Закрепите посеяны SISmuc с использованием 2,5 мл 4% параформальдегида (PFA) на клетку корону в течение 2 ч и вставлять его в парафин
      2. Подготовьте секции 3 мкм ткани для окрашивания, опубликованных ранее25.
    2. Фиксация клеток , выращенных в 2D условиях культуры
      1. Когда 70% сплошности достигается, мыть клетки, культивируемые на покровных стеклах в 24-луночный планшет один раз PBS и зафиксировать их с 500 мкл 4% PFA / лунку в течение 10 мин.
      2. Удалить PFA и хранить покровные стекла в хорошо пластину, покрытую PBS при 4 ° С до окрашивания не выполняется.
    3. H & E Окрашивание
      1. Пятно регидрировали секции гематоксилином / эозином как обзор окрашивания в соответствии со стандартными протоколами.
    4. Иммунофлуоресцентного Окрашивание 3D - модели
      1. Для иммунофлуоресцентного окрашивания, выполнить поиск антигена путем размещения депарафинировали и регидрировали слайды в пароварке с предварительно нагретым цитратного буфера (рН 6,0) в течение 20 мин.
        Примечание: Смотрите таблицу материалов и оборудования для приготовления цитратного буфера.
      2. Передача слайдовв промывочном буфере (0,5 М PBS буфер + 0,5% Tween), круг участки с РАР ручкой, чтобы свести к минимуму необходимый объем для окрашивания растворов и поместить слайды в камере влажности.
      3. Блок срезов ткани с 5% сыворотки от хозяина видов вторичных антител, используемых в подразделе 5.3.4.6 в течение 20 мин при комнатной температуре.
      4. Удалить блокирующий сыворотку прижав слайды бумажной салфеткой и нанести первичное антитело к окруженным секций в разведении в соответствии с инструкцией производителя (кролик анти Ki67 1: 100, кроличьими анти виментину 1: 100, мышь анти пан-цитокератином 1 : 100). Выдержите O / N при температуре 4 ° С. Для получения двойного окрашивания, необходимо использовать первичные антитела из разных видов хозяев.
      5. Тщательно смыть несвязанного антитела с промывочным буфером три раза в течение 5 мин.
      6. Для выявления специфических антиген-антитело привязок, применяют вторичные антитела в разведении 1: 400 до секций и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа.
      7. Смыть УНБкруглый вырез антитела с промывочным буфером три раза в течение 5 мин.
      8. Установите слайды с водной средой, содержащей DAPI для ядер контрастное и дайте им высохнуть O / N.
    5. Иммунофлуоресцентного Окрашивание 2D культивируемых клеток
      1. Удалить PBS и покрывают сеяных стекла покровных стеклах с 0,2% Triton-X100 в PBS в течение 5 мин для пермеабилизации. Вымойте стеклянную крышку слипы с промывочным буфером (0,5 М PBS буфера + 0,5% Tween) в течение 5 мин.
      2. Выполните шаги 5.3.4.3 на 5.3.4.7. Выполните все действия, описанные в луночного планшета на качающейся платформе и удаления реагентов опрокидыванием планшета.
      3. Для монтажа, определить каплю водной среды, содержащей DAPI для контрастное ядер на немелованной предметное стекло и передать покровное к нему с клетками, с которыми сталкивается монтажную среду с помощью щипцов. Дайте ему высохнуть, прежде чем визуализации.
  4. Определение индекса пролиферации
    1. Выполните иммунофлуоресцентногоокрашивание против Ki67 в соответствии с разделом 5.3.4. или 5,3 5.
    2. Возьмем флуоресцентных изображений срезах тканей или 2D культивированных клеток с помощью инвертированного микроскопа. Используйте различные фильтры для съемки изображений DAPI окрашиванием и из Ki67 окрашиванием. Для количественной оценки, использовать 10 изображений 3D-секций или 5 изображений 2D культур (увеличение 20х) каждого состояния из непересекающихся частей образца.
    3. Определить количество ядер и количество ядер положительно для Ki67 в 2D
      1. Граф Ki67 положительных ядер вручную , используя счетчик плагин ячейки программного обеспечения Фиджи 26. Поэтому, откройте изображение и нажмите кнопку "Плагины" → "Анализ" → "Счетчик клеток". Нажмите кнопку "Initialize" и выберите тип счетчика. Нажмите на каждую Ki67 положительного ядра. Количество кликов отображается рядом с выбранным типом счетчика.
      2. Для автоматического подсчета клеток от общего числа ядер создать макрокоманду , используя Фиджи 27,28. Adjусть макрос для каждого окрашивания и клеточной линии. Ниже смотрите пример того, как создать макрос.
        1. Начало записи макросов. Откройте DAPI-изображение и преобразовать его в 8-битном формате, нажав кнопку "Изображение" → "Тип" → "8 бит". Нажмите "Повышение контрастности", установите "насыщенный", как "1" и "нормализации".
        2. Установите "нерезкой маски" для повышения резкости изображения. Используйте 'радиус' "1" и "маски" из "0,60". Нажмите кнопку "автоматический порог", выберите метод "RenyiEntropy" с "белые объекты на черном фоне", чтобы binarise изображение.
        3. Нажмите кнопку "Плагины" → "BioVoxxel" → "водосборные нерегулярные особенности" с радиусом эрозии "5", чтобы отделить клетки. Нажмите кнопку "Анализ" → "Анализ частиц" и установить "размер" на "0,02-Infinity".
          Примечание: Число частиц / клетокприведены в сводной таблице в виде графов.
        4. Нажмите кнопку "Создать", чтобы сохранить макрос для анализа дальнейших изображений.
    4. Определить количество ядер и количество ядер положительных для Ki67 в 3D вручную, как описано в подразделе 5.4.3.1.
    5. Рассчитывают индекс средней пролиферации (ИП) в соответствии со следующей формулой:
      figure-protocol-1
      п = количество изображений (3D: 10, 2D: 5)

6. В Silico поколения Опухоль модели и моделирование Анти- EGFR терапии в клетках HCC827

  1. Сетевое поколение с помощью анализа сетевого программного обеспечения
    1. Используйте различные известные базы данных для формирования сети опухоли на основе важных экспериментальных параметров Считывание и мутационный фоне HCC827 клеточной линии.
    2. Открытое программное обеспечение 21 сетевого анализа , чтобы визуализироватьсеть.
      1. Нажмите кнопку "Файл" → "Новый" → типа "модели JoVE_tumor" → нажмите кнопку "OK", чтобы создать новую сеть. Нажмите "Квадрат крупного плана Север" → "OK", чтобы визуализировать рецептор в двойной мембраной. Нажмите кнопку "Generic белок" для визуализации узлов (= белки) в виде прямоугольников → типа 'EGFR' → нажмите кнопку "OK"; повторите эту процедуру для каждого узла в сети.
      2. Добавьте узлы в сети: Щелкните правой кнопкой мыши → "Изменение цвета и формы ..." → выбрать для узлов EGFR и (EGF-EGFR) цветовым кодом "255,0,0" (цвет красный); для узлов с-МЕТ и (с-Met) код цвета "0,255,0" (цвет зеленый); для гефитинибом цветового кода "255,255,0" (желтый цвет); для PI3K-Inh цветовым кодом "204204204" (цвет светло-серый); для МЕК-Inh цветовой код "102102102" (цвет темно-серый); для всех остальных узлов в сети выберите цветовой код4; 255255255 "(цвет белый).
      3. Нажмите кнопку "фенотип", чтобы визуализировать параметры считывающие в виде шестиугольников → 'распространения' типа → нажмите кнопку "OK" → правой кнопкой мыши → "Изменить цвет & Shape ..." → выбрать цвет код "255204204" (цвет лосося); повторить это для параметра апоптозу → выберите цветовой код "255,51,204" (фиолетовый цвет).
      4. Визуализируйте кромками (= взаимодействий): Нажмите кнопку "State Transition" для активаций (стрелки), нажмите кнопку "Торможение" для торможений (притупилось стрелки); повторите эту процедуру для каждого взаимодействия в сети.
    3. Нажмите кнопку "Файл" → "Сохранить как ..." → тип 'JoVE_tumor models.xml' → нажмите кнопку "Сохранить", чтобы сохранить сгенерированный сигнализации сети в формате .xml.
  2. В Silico моделирование с использованием SQUAD
    Примечание: SQUAD представляет тысэлектронной топологии сети в виде дискретной логической булевой системы (AND, OR, NOT) и выполняет постоянный анализ состояния. Установившаяся анализ отражает систему равновесия и ответственность на сигнальные раздражители (например., Применение препарата или мутации).
    1. Open ОТРЯД 17 программного обеспечения, нажмите кнопку "Load Network" → загрузки 'models.xml JoVE_tumor' файл. Нажмите кнопку "Выполнить анализ":
      Примечание: Далее ОТРЯД применяется экспоненциальная функция для интерполяции логическое подключение к сети, что позволяет динамическое моделирование поведения сети с течением времени (цветные кривые сигмовидной активности).
    2. Нажмите кнопку "Дополнительно" → "Возбудитель", чтобы написать протокол моделирования. Имитировать сопротивление анти - EGFR: Нажмите кнопку "Изменить протокол"
      1. Нажмите кнопку "возмущением" → использовать стандартные "InitialState = SS-4" (стационарное состояние 4) → Нажмите кнопку "Добавить", чтобы добавить "новый постоянный импульс '→ SeLect параметр "состояние" → Выбор целевого "FLIP" → Выбор времени "0" → Выберите значение "0,4" → Нажмите кнопку "OK".
      2. Повторите эту операцию: Нажмите кнопку "Добавить" → Выберите параметр "состояние" → Выбор цели "C-MET" → Выбор времени "0" → Выберите значение "0,4" → Нажмите кнопку "OK"; Нажмите кнопку "Добавить" → Выберите параметр "состояние" → "Выбор цели" гефитинибом → Выбор времени "0" → Выберите значение "1" → Нажмите кнопку "OK".
      3. Установить значение состояния для активного узла (EGF-EGFR): Нажмите кнопку "activenode" → Нажмите кнопку "Изменить" → Выберите состояние "0,8" → Нажмите кнопку "OK"; для всех остальных узлов: Нажмите кнопку "Изменить" → Выберите состояние "0" → Нажмите кнопку "OK". Нажмите кнопку "OK" для сохранения протокола.
      4. Отображение конкретных кривых: Перейти к панели "Настройки" → Выберите "(EGF-EGFR)", "* (EGF-EGFR)", "* МЕК", "каспазы", "(с-МЕТ)", "PI3K", "гефитиниб", "апоптоз", "распространение", "МЕК-инг" и "PI3K-инг" для графического представления. Нажмите кнопку "Initialize" → "Выполнить", чтобы начать полное моделирование реакции системы. Нажмите кнопку "Reset", чтобы начать новую моделирования.
    3. Имитировать комбинированный PI3K и MEK лечение ингибиторами: Нажмите кнопку "Изменить протокол"
      1. Используйте тот же параметр узла, как описано в разделе 6.2.2.1 - 6.2.2.3. Нажмите кнопку "возмущением" → Нажмите кнопку "Добавить", чтобы добавить "новый постоянный импульс '→ Выберите параметр" состояние "→ Выберите целевой" PI3K-Inh "→ Выбор времени" 0 "→ Выберите значение" 1 "→ Нажмите кнопку" OK "; Нажмите кнопку "Добавить"добавить 'новый постоянный импульс' → Выберите параметр "состояние" → Выбор цели "МЕК-инг" → Выбор времени "0" → Выберите значение "1" → Нажмите кнопку "OK".
      2. Нажмите кнопку "OK" для сохранения протокола. Перейти к панели «Параметры»: Используйте те же узлы для графического представления, как описано в разделе 6.2.2.4. Нажмите кнопку "Initialize" → "Выполнить", чтобы начать полное моделирование реакции системы. Нажмите кнопку "Сброс", чтобы закончить моделирование.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На основе эшафот SISmuc (фиг.2А-С), мы установили , стандартизованный протокол работы для формирования, стимуляции и лечения тест - системы опухоли 3D (рис 2D). Эта модель позволяет определить индекс пролиферации и количественной оценки апоптоза с использованием M30-ELISA , как показано на фиг.1 и 3, соответственно. На рисунке 3 показана представитель H & E окрашивание A549 и HCC827 ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы установили комбинированный в пробирке / в силикомарганца тестовой системе опухоли для биомаркеров наведением предсказаний лечения. Модель в пробирке оценивает различные важные аспекты сложных действий , таких как изменение пролиферации опухолевых клеток и апоптоз на конкретном мутационного фона , который может быть также смоделированных в силикомарганца 17. Здесь мы представляем стандартизированный протокол для 3D поколения модели опухоли и соединения тестирования включая количес...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было организовано Центром междисциплинарных клинических исследований (грант IZKF, BD247) больницы университета Вюрцбурга и программы Bayern Fit (предоставленных Хайке Уоллеса).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
БиореакторыКафедра тканевой инженерии и регенеративной медицины, Wü rzburg (GER)Установка биореактора
BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji)Ян Брочер, Торстен Вагнер, кафедра
Cell Crowns, Wü rzburg (GER)для статической 3D культуры
CellDesignerhttp://www.celldesigner.org/-Это программное обеспечение использовалось для рисования сети.
Цитратный буферный исходный раствор (10x)собственного производства42 г/л моногидрата лимонной кислоты, гранулы гидроксида натрия 17,6 г/л в деионизированной воде, pH 6,0, хранятся в RT. 
Цитратный буферный рабочий растворсобственного производства10% Цитратный буферный стоковый раствор в деминерализованной воде, хранящийся в RT.
Моногидрат лимонной кислотыVWR, Darmstadt (GER)1002441000используемый для цитратного буфера
Cover slipsVWR, Darmstadt (GER)631-1339
DAPI Fluoromount-GTMSouthernBiotech, Birmingham (США)SBA-0100-20
Базы данных, такие как KEGG, HPRD и QIAGEN (Genes & Pathways)http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/-Для создания топологии сети были использованы базы данных различной известной литературы.
Сука Luer Lug Style TeeMednet, Mü nster (GER)FTLT-1Установка биореактора
Female Luer Thread Style с шестигранником 5/16" до 1/4-28 UNF ThreadMednet, Mü nster (GER)SFTLL-J1A Установка биореактора
Фетальная сыворотка теленкаBio& SELL, Feucht (GER)FCS. ADD.0500не термоинактивированный
ГефитинибAbsource Diagnostics GmbH, Mü nchen (GER)S1025-100 мг100 мМ стоковый раствор с колбой DMSO
Glas (Schott, GER) в комплекте со стеклянным шланговым соединениемWeckert, Kitzingen (GER)изготовлен
Histofix 4% (параформальдегид)Carl Roth, Karlsruhe (GER)P087.1
Шланговая муфтаMednet, Mü nster (GER)CC-9Установка биореактора
Инкубатор для биореакторовКафедра тканевой инженерии и регенеративной медицины, Wü rzburg (GER)Биореакторная установка
M30 CytoDeathTM ELISAPeviva, Bromma (SWE)10900
Male Luer Integral Lock RingMednet, Mü nster (GER)MTLL230-J1AУстановка биореактора
Влажная камераизготовленная
Мышиный анти-пан-цитокератинSigma-Aldrich, Мюнхен (GER)   C2562-2MLКлон C-11+PCK-26+CY-90+KS-1A3 +M20+A53-B/A2, используется 1/100 для иммунофлуоресцентного
безыгольного свабируемого клапана Female LuerMednet, Mü nster (GER)NVFMLLPCУстановка для биореактора, для отбора проб, гамма-стерилизованное
уплотнительное кольцо MVQ 10 красное 37 x 3 ммArcus Dichtelemente, Seevetal (GER)21444Уплотнительное кольцо большое, Уплотнительное кольцо биореактора
MVQ 70 красное 27 x 2,5 ммArcus Dichtelemente, Seevetal (GER)19170Уплотнительное кольцо маленькое, Биореактор
PAP pen Dako, Гамбург (GER)S002
ПарафинКарл Рот, Карлсруэ (Германия)6642.6
Перистальтический насосIsmatec, Вертхайм-Мондфельд (Германия)Установка биореактора
Фосфатный буферный физиологический растворSigma-Aldrich, Мюнхен (GER)   D8537-6x500ml
Кассета для насосных трубокIsmatec, Wertheim (GER)IS 3710Биореакторная установка
Rabbit anti Ki67Abcam, Кембридж (Великобритания)ab16667Клон SP6, используется для 1/100 для IF
Rabbit anti VimentinAbcam, Кембридж (Великобритания)ab92547используется 1/100 для IF
RPMI-1640 mediumLife technologies, Дармштадт (GER)61870-044тепло в 37 градусов; C водяная баня перед использованием
Силиконовая трубкаCarl Roth GmbH, Карлсруэ (GER)HC66.1Установка биореактора
Гидроксид натрияSigma-Aldrich, Mü nchen (GER)30620-1KG-Rиспользуемый для цитратного буфера
SQUADhttp://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm-Этопрограммное обеспечение использовалось для выполнения полуколичественного моделирования.
Фильтр стерильного воздуха, размер пор 0,2 и микро; mSartorius Stedium Biotech, Gö ttlingen (GER)16596-HYKУстановка для биореактора
Шприц Luer Lok 5 млBD Biosciences, Heidelberg (GER)309649для отбора проб из биореактора
Тестовые планшеты для культуры тканей: 6-,          12-, 24-, 96-скважиннаяТПП Техно Пластик Продактс АГ, Трасадинген (Германия)92006, 92012, 92024, 92048 
Трансформирующий фактор роста-бета 1 (TGF-β 1) с носителемCell Signaling, Frankfurt (GER)8915LCстоковый раствор в стерильном цитратном буфере pH 3.0
Triton X-100Sigma-Aldrich, Mü nchen (GER)X100-1L
Tween-20Sigma-Aldrich, Mü nchen (GER)P7949-500млдля промывочного буфера иммунофлуоресцентного окрашивания
тканевой инженерии и регенеративной медицины https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox на заказ, на заказ, ,

Ссылки

  1. Bhattacharjee, Y. Biomedicine Pharma firms push for sharing of cancer trial data. Science. 338, 29(2012).
  2. Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nat Rev Drug Discov. 3, 711-715 (2004).
  3. Arrowsmith, J. Trial watch: Phase II failures: 2008-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 328-329 (2011).
  4. Arrowsmith, J. Trial watch: phase III and submission failures: 2007-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 87(2011).
  5. Arrowsmith, J., Miller, P. Trial watch: phase II and phase III attrition rates 2011-2012. Nat Rev Drug Discov. 12, 569(2013).
  6. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
  7. Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, 208-212 (2009).
  8. Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 485-489 (2013).
  9. Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 675-680 (2013).
  10. Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30, 247-255 (2003).
  11. Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochem Cell Biol. 74, 833-851 (1996).
  12. Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. Int J Mol Sci. 16, 5517-5527 (2015).
  13. Kim, J., Tanner, K. Recapitulating the Tumor Ecosystem Along the Metastatic Cascade Using 3D Culture Models. Front Oncol. 5, 170(2015).
  14. Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels - Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92(2015).
  15. Tanner, K., Gottesman, M. M. Beyond 3D culture models of cancer. Sci Transl Med. 7, 283ps9(2015).
  16. Stadler, M., et al. Increased complexity in carcinomas: Analyzing and modeling the interaction of human cancer cells with their microenvironment. Semin Cancer Biol. , (2015).
  17. Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Mol Oncol. 8, 351-365 (2014).
  18. Mok, T. S., et al. Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma. N Engl J Med. 361, 947-957 (2009).
  19. Maemondo, M., et al. Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR. N Engl J Med. 362, 2380-2388 (2010).
  20. Rosell, R., et al. Erlotinib versus standard chemotherapy as first-line treatment for European patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (EURTAC): a multicentre, open-label, randomised phase 3 trial. Lancet Oncol. 13, 239-246 (2012).
  21. Sequist, L. V., et al. Phase III study of afatinib or cisplatin plus pemetrexed in patients with metastatic lung adenocarcinoma with EGFR mutations. J Clin Oncol. 31, 3327-3334 (2013).
  22. Lee, J. M., Dedhar, S., Kalluri, R., Thompson, E. W. The epithelial-mesenchymal transition: new insights in signaling, development, and disease. J Cell Biol. 172, 973-981 (2006).
  23. Wells, A., Yates, C., Shepard, C. R. E-cadherin as an indicator of mesenchymal to epithelial reverting transitions during the metastatic seeding of disseminated carcinomas. Clin Exp Metastasis. 25, 621-628 (2008).
  24. Janne, P. A., et al. AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 372, 1689-1699 (2015).
  25. Moll, C., et al. Tissue engineering of a human 3D in vitro tumor test system. J Vis Exp. , (2013).
  26. Funahashi, A., et al. CellDesigner 3.5: A Versatile Modeling Tool for Biochemical Networks. Proceedings of the IEEE. 96, 1254-1265 (2008).
  27. Auto Threshold(ImageJ)v.v1.15. , Source: http://fiji.sc/Auto_Threshold (2013).
  28. BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji). , Source: http://fiji.sc/BioVoxxel_Toolbox (2015).
  29. Buettner, R., Wolf, J., Thomas, R. K. Lessons learned from lung cancer genomics: the emerging concept of individualized diagnostics and treatment. J Clin Oncol. 31, 1858-1865 (2013).
  30. Engelman, J. A., et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science. 316, 1039-1043 (2007).
  31. Mukohara, T., et al. Differential effects of gefitinib and cetuximab on non-small-cell lung cancers bearing epidermal growth factor receptor mutations. J Natl Cancer Inst. 97, 1185-1194 (2005).
  32. Noro, R., et al. Gefitinib (IRESSA) sensitive lung cancer cell lines show phosphorylation of Akt without ligand stimulation. BMC Cancer. 6, 277(2006).
  33. Gill, B. J., et al. A synthetic matrix with independently tunable biochemistry and mechanical properties to study epithelial morphogenesis and EMT in a lung adenocarcinoma model. Cancer Res. 72, 6013-6023 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

3DEGFRKi6730in silico

Похожие статьи