Иммуномагнитного Разделение жировое депо-специфической СЦА1<sup&gt; высокая</sup&gt; Полученные из жировой ткани стволовые клетки (ИСС)

Краткое содержание

Мы представляем методы, необходимые для выделения стромальной васкулярной фракции (SVF) из паховых (подкожных) и перигонадных (висцеральных) депо жировой ткани мышей для оценки их экспрессии генов и коллагенолитической активности. Этот метод включает обогащение стволовых клеток (ASC)^{высокого} уровня жировой ткани Sca1 с использованием иммуномагнитного разделения клеток.

Аннотация

Выделение стволовых клеток жировой ткани (ASC) является важным методом в области биологии жировой ткани, адипогенеза и ремоделирования внеклеточного матрикса (ECM). Среда in vivo, богатая ECM, состоящая из фибриллярных коллагенов, обеспечивает структурную поддержку жировых тканей во время прогрессирования и регрессии ожирения. Физиологическое ремоделирование ВКМ, опосредованное матриксными металлопротеиназами (ММП), играет важную роль в регулировании размера и функции жировой ткани^1,2. Потеря физиологического коллагенолитического ремоделирования ВКМ может привести к чрезмерному накоплению коллагена (фиброзу тканей), инфильтрации макрофагов и, в конечном итоге, к потере метаболического гомеостаза, включая резистентность к инсулину^3,4. Когда фенотипическое изменение жировой ткани наблюдается в моделях мышей, ориентированных на гены, выделение первичных ИСК из жировых депо для исследований in vitro является эффективным подходом к определению роли конкретного гена в регуляции функции ИСС. Далее мы определяем иммуномагнитное разделение ASC^{с высоким уровнем} Sca1.

Введение

Стволовыми клетками антигена за 1 (СЦА1 или Ly6A / E) был впервые идентифицирован как маркера клеточной поверхности , выраженной гемопоэтических и мезенхимальных стволовых клеток ^5,6. Стромальные сосудистый фракция (НВФ) из жировой ткани , полученной от мыши жировых депо представляет собой гетерогенную популяцию клеток , состоящих из фибробластов, макрофагов, эндотелиальных клеток сосудов, нервные клетки и клетки - предшественники адипоцитов ^7. Клетки - предшественники адипоцитов, или полученные из жировой ткани стволовые клетки (ASCs) не являются липидами клетки , которые находятся в коллагеновой богатых периваскулярного внеклеточного матрикса (ECM) ^8. Около 50% СФДВ состоят из ИСС, которые характеризуются как LINEAGE-отрицательной (Lin ^-) и CD29 ⁺ CD34 ^+:: СЦА1 ^{+ 9.} Большинство из этих ячеек являются СЦА1 ^+: CD24 ^- адипоцитов клетки - предшественники, которые способны к дифференциации адипоцитов в пробирке; Однако, только часть клеток (0,08% от SVF) составляет СЦА1 +: CD24 ⁺ клетки , которые в полной мере способны пролиферировать и дифференцироваться в адипоциты в условиях , в естественных условиях ^9. Несмотря на потенциальную предостережением использования СЦА1 ⁺ SVF , не различая CD24 ⁺ клеток из CD24 ^- клетки, изолируя СЦА1 ⁺ ИСС из жировых депо с использованием иммуномагнитный разделения клеток является эффективным и практичным подходом для определения клеточно-автономной фенотип клеток - предшественников первичных адипоцитов.

В области ожирения и диабета, фиброза тканей и воспаления играют решающую роль в развитии и поддержании диабета ³ 2- го типа. В последнее время , Токунага и др. показали , что ^{высокие} СЦА1 клетки , выделенные из паховая (или подкожно, SQ) и perigonadal (или висцеральный, VIS) C57BL6 / J жировых отложениях имеют разные подписи генов и ECM ремоделирования в пробирке ^10. ММР14 (МТ1-ММР), прототипическим член мембранно-Tип семейства металлопротеиназ матрицы (ММР) опосредует развитие белой жировой ткани (WAT) через его коллагенолитического деятельности ^1.

Примеры экспериментов , которые могут проводиться с клетками , выделенными и обогащенных по следующему протоколу включают трехмерную культуру, исследования дифференциации, анализы деградации коллагена и РНК последовательности ^10,11. Деградация анализы следует проводить с кислотой экстрагируют коллагена , чтобы обеспечить сохранение телопептидом ^11,12. Следующий протокол продемонстрирует методы для выделения первичных сосудистых стромальных клеток из различных жировых депо и обогащения клеток-предшественников адипоцитов с использованием иммуномагнитный разделения клеток. Справедливость сортировки клеток будет оцениваться с проточной цитометрии и путем использования СЦА1-GFP мышей , которые выражают GFP в СЦА1 ⁺ клеток, движимый СЦА1 промотора ^13.

Протокол

Этика Заявление: Мичиганского университета Комитета по использованию и уходу за животными (UCUCA) одобрил все методы и протоколы в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных (Институт лабораторных исследований животных, Национальный исследовательский совет). Мыши поддерживаются в Мичиганском университете вивария и получают свободный доступ к пище и воде и выдерживают на 12 ч темнота / свет цикла.

1. Подготовка

1. Подготовка первичной медиакультуру с DMEM, 10% FBS, 1x P / S / G, и 1x антибиотики / противогрибковые средства. Это будет использоваться, чтобы держать ткани в перед пищеварением. Поместите запас и аликвоты в водяной бане 37 ° С.
2. Приготовьте пять миллилитров типа III раствора коллагеназы при 5 мг / мл, растворенного в HBSS (+ Са + Mg) для каждого типа жировое изолируя до пяти мышей. Например, при выделении SQ и Вис от одного генотипа, делают 10 мл, если дикого типа и мутанта SQ и Вис, сделать 20 мл. Отрегулируйте рН до 7,4 и STEразозлить фильтр. Алиготе в 50 мл пробирки. Отложите подальше от света.
3. Используйте 70% этанола для дезинфекции операционного поля. Протереть и крышка с синим площадку. Спрей некоторое количество этанола на синей панели.
4. Используйте 22 G иглы придавить абсорбирующую прокладку на пенопластовой доске и обрезать ножницами. Спрей накладку с этанолом, затем установить доску на синей площадке и накрыть другим синим площадку до начала рассечение.
5. Наполните две 50 мл пробирки с этанолом и место в стойке, примыкающей к операционному полю. Поместите ножницы и пинцет в этаноле.
6. Заполните другую 50 мл пробирку с PBS плюс 1x анти-анти для полоскания этанол от хирургических инструментов.
7. В капот, этикетка 60 мм блюда для каждого типа ткани и заполнения культуральной средой нагревают до 37 ° С. Место пластин, прилегающих к хирургической области.

2. Выделение подкожного (SQ) жировым

1. Эвтаназии мышь с передозировкой изофлуран и пневмоторакса.
2. нежноспрей мышь с 70% этанола и лежал навзничь. Закрепление лапы к пенополистирол с 22 г хвои.
3. Сделать небольшой разрез в коже нижней части живота. Держа верхнюю часть разреза с помощью пинцета, возьмите ножницы и отделить кожу от брюшины.
4. После того как кожа отделяется от брюшину от живота к грудной клетке, отражают кожу от брюшины к голове, сделав боковые разрезы в коже вдоль стороны тела.
5. Отражать оставшуюся кожу держит паховой жир прочь от тела и придавить к плате 22 G иглы.
6. Переключиться на тонких ножниц и пинцетов. Захват паховой жировой ткани с помощью пинцета в начале координат около брюшины и надрез прочь между кожей и паховых жира движется к паховой области, избегая загрязняя SQ с кожей.
7. Поместите инсолируемой паховой жировой ткани в мм блюдо маркированы 60.

3. Выделение Visceral (VIS) жировым

1. Аналогичным образом к шагу 2.5, разрезать брюшину открытую подвергать висцерального жира колодки и кишечника.
2. Переместить кишку прочь к грудной клетке.
3. Захватите VIS жировой ткани на дальнем конце и осторожно потяните вверх. Рассеките из VIS жировой ткани, стараясь при этом, чтобы исключить эпидидимальной (или матки, при использовании самок мышей) ткани.
4. Место в меченого блюдо и повторите шаг 3.3 для оставшейся VIS площадки.

4. коллагеназы жира колодки

1. Перемещение 60 мм блюд в капот культуре ткани и аспирата от средств массовой информации.
2. Фарш жировые подушечки с изогнутыми ножницами затем добавить в раствор коллагеназы. Обязательно полоскать ножницы и пинцет между типами тканей с этанолом и PBS.
3. Встряска при 300 оборотах в минуту и ​​37 ° С в течение 10-20 мин, пока ткани не перевариваются. Это приемлемо, если некоторые части SQ еще видны. Этот вопрос будет рассмотрен на более позднем этапе.
4. Добавить 25 мл культуральной среды в раствор коллагеназы, чтобы остановить collagenase лечение, и пипетку вверх и вниз 10 раз с 10 мл серологической пипетки, чтобы разогнать переваренные ткани.
5. Штамм клеток с использованием ячейки фильтра 100 мкм. Центрифуга в течение 10 мин при 300 х г.
6. Тщательно переливать от средств массовой информации, чтобы не нарушить осадок и добавляют 5 мл стерильной воды к осадку и осторожно пипеткой приостановить клетки. Подождите 2 мин для лизиса эритроцитов.
7. Добавьте 25 мл среды с 10% FBS и деформации клеток через новый 100 мкм клеточный фильтр.
8. Центрифуга в течение 10 мин при 300 х г. Декантируйте СМИ и ресуспендируют осадок в 1 мл культуральной среды.
9. Граф клеток с помощью гемоцитометра, использу 1: 1 трипановым синим.
10. Пластина 1 х 10 ⁶ клеток в одну лунку на 6-луночный планшет.

5. Магнитная разделение клеток

1. После того, как приблизительно от 4 до 6 ч клеточной адгезии, ополоснуть клетки дважды HBSS (-ca, -Mg). Диссоциируют прилипших клеток с использованием 0,05% трипсина. Развести суспензии клеток трипсина в буфере разделения 1 мл и спина для5 мин при 300 х г.
2. Отберите супернатант. Ресуспендируют клеток в 500 мкл буфера. Удалить 10 мкл аликвоты и подсчета клеток с использованием гемоцитометра.
3. Спин клетки в течение 5 мин при 300 х г.
4. Отберите супернатанту полностью. Ресуспендируют клеток в 90 мкл буфера. Добавляют 10 мкл анти-СЦА1-FITC первичное антитело. Хорошо перемешать и инкубировать в течение 10 мин при 4 ° С в темноте.
5. Промыть клетки с 1 мл буфера и центрифугировать клетки в течение 5 мин при 300 х г. Удалить супернатант полностью.
6. Ресуспендируют клеток в 80 мкл буфера. Добавьте 20 мкл анти-FITC микрогранулы. Хорошо перемешать и инкубировать в течение 15 мин при 4 ° С в темноте.
7. Промыть клетки с 1 мл буфера и центрифугировать клетки в течение 5 мин при 300 х г.
8. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 500 мкл буфера.
9. Поместите колонку в магнитный держатель и полоскать колонку с 500 мкл буфера.
10. Добавить клеточной суспензии в колонну. Избегайте пузырей в то время как пипеткой.
11. Соберите немеченого СЦА1 ^{- <}/ SUP> клетки и мыть колонке 3 раза 500 мкл буфера. Только добавить новый буфер, когда резервуар пуст. Избегайте пузырей в то время как пипеткой.
12. Удалить столбец из магнитного держателя и поместить в 15 мл коническую трубку.
13. Добавьте 1 мл буфера в колонку и элюции СЦА1 ^+, нажав поставляемый поршень через резервуар колонны.
14. Спин вниз клеточных фракций в течение 5 мин при 300 х г. Ресуспендируют клеток в 1 мл культуральной среды.
15. Удалить 10 мкл аликвоты из меченых и немеченых фракций и подсчета клеток с использованием гемоцитометра.
16. Пластинчатый каждую фракцию клеток в 1 лунку 6-луночного планшета.

6. Проверка иммуномагнитного Разделение СЦА1 ^{высокой} с АСУ проточной цитометрии

1. Промойте клетки дважды HBSS (-ca, -Mg) и диссоциируют клеток с использованием 0,05% трипсина.
2. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин. Ресуспендируют клеток в 1 мл среды культивирования и подсчет с помощью гемоцитометра.
3. Получить> 10 ⁶ клеток в 1 мл культуральной среды и центрифугирования при 300 мкг в течение 5 мин.
4. Удалить супернатант и повторите шаг 6,3 еще два раза.
5. Ресуспендируют клетки с 1 мл 2% козьей сывороткой + 2% бычьего сывороточного альбумина и блок в течение 30 мин при комнатной температуре.
6. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин.
7. Удалите блокирующий раствор.
8. Добавить крысу IgG2a Alexa Fluor 647 (0,25 мкг, 1: 400) или анти-СЦА1 Alexa Fluor 647 (0,25 мкг, 1: 400), в 100 мкл PBS с 2% сыворотки козьего молока и 2% БСА + PBS при 4 ° C в течение 30 мин в темноте.
9. Добавьте 1 мл холодного PBS к клеткам. Центрифуга 300 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
10. Удалить супернатант и повторите шаг 6,9 еще два раза.
11. Ресуспендируют клеток в 1 мл PBS. Pass клеточные суспензии через сито 100 клеток мкм в рамках подготовки к проточной цитометрии анализа.

Результаты

Обогащение СЦА1 ^{высоких} ИСС из разных жировым.

Сосудистые стромальные клетки , выделенные из жира SQ дисплей фибробластоподобных, растянуты форму клетки , независимо от уровня экспрессии СЦА1 (рис 1А). С другой стороны, Вис (eWAT происхождения) СЦА1 ^{высокие} и ^низкие СЦА1 клетки демонстрируют отчетливую разницу в их форме клетки. Как и SQ (iWAT происхождения) СЦА1 ^{высоких}

Обсуждение

Здесь мы демонстрируем изоляцию и иммуномагнитный разделение клеток мышиных ИСС от различных жировых отложений и их использование для проведения экспериментов в лабораторных условиях . Представленный метод эффективен для быстрого выделения большого количества СЦА1-положительных ИСС, что является преимуществом по технически сложной и дорогой FACS-опосредованной изоляции ИСС ^9,14. В отличие от FACS, иммуномагнитный разделения клеток не позволяет использовать несколько антигена для идентификации популяц...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Коллагеназа 3 типа	Worthington Биохимическая	LS004182	переваривание тканей
DMEM	Gibco	11965-092	Питательная среда с высоким содержанием глюкозы
Pen/Strep/Glutamine (100x)	Gibco	10378-016	Медиа-антибиотик
Anti-anti-anti (100x)	Gibco	15240-062	Медиа противогрибковый
FBS	Gibco	16000-044
PBS (1x, pH 7,4)	Gibco	10010-023
Трипсин (0,05%)	Gibco	25300-054
Клеточный фильтр	BD Bioscience	352360	100-μ m клеточный фильтр
60 мм пластины	BD Falcon	353004
Ножницы	FST	14001-12	Большие
ножницы	FST	14091-11	Тонкий, изогнутый наконечник
Большие щипцы	FST	11000-12
Тонкие щипцы	любого производителя
25G иглы 5/8"	BD	305122
Иглы 22G 1,5"	BD	305159
конические пробирки 15 мл	BD Falcon	352097
конические пробирки 50 мл	BD Falcon	352098
разделительные колонки MACS	Miltenyi Biotec	130-042-201
Набор микрогранул Anti-Sca1 (FITC)	Miltenyi Biotec	130-092-529	FITC-anti-Sca1 1º Ab и анти-FITC микрогранулы 2º Ab
AutoMACS беговой буфер	Miltenyi Biotec	130-091-221
Сепаратор MiniMACS	Miltenyi Biotec	130-042-102
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Синие подкладки	Fisher	276-12424
Абсорбирующие прокладки	Fisher	19-165-621
Пенополистироловая плита			Использование из пробирок 50 мл
70% этанол
Изофлуран	любого производителя
Крыса IgG2a Alexa Fluor 647	Invitrogen	R2a21
Крыса IgG2a антимышиный Sca1 Alexa Fluor 647	Invitrogen	MSCA21
Крыса IgG2a R-PE	Invitrogen	R2a04
Крыса IgG2a антимышиный F4/80 R-PE	Invitrogen	MF48004
трубка с круглым дном	BD Falcon	352058
HBSS (– Ca, – Mg)	Gibco	14175-095
HBSS (+Ca, +Mg)	Gibco	14025-092	Для раствора коллагеназы
типа I коллаген (2,7 мг/мл в 37 мм уксусной кислоты	Готовьте дома12
10x MEM	Gibco	11430-030
1 M HEPES	Gibco	15630-080
0,34 N NaOH	Готовьте дома
Покровные стекла	Corning	2870-22
Alexa Fluor 594 карбоновая кислота, сукцинимидиловый эфир, смешанные изомеры	Invitrogen	A-20004
0,89 М NaHCO3	Gibco	25080-094