Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Развитие

10.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53907

⸱

6 апреля 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Optometry and Vision Science, University of Waterloo, 2Medella Health

В этой статье

Краткое содержание

Современные модели в пробирке для оценки контактных линз (КНК) и других приложений , связанных с глаз сильно ограничены. Представленная глазное платформа имитирует физиологическую поток разрыв, слезоточивый объем, воздействия воздуха и механического износа. Эта система является универсальным и может быть применен к различным в пробирке анализов с CLs.

Аннотация

В настоящее время оценка in vitro контактных линз (КЛ) для доставки лекарств обычно проводится во флаконах большого объема,1-6 которые не могут имитировать физиологические объемы слезы. 7 В традиционной модели также отсутствует естественная составляющая слезного потока и мигающий рефлекс, которые являются определяющими факторами глазной среды. В этом исследовании описывается разработка новой модели, которая состоит из уникальной конструкции из двух частей, глазного яблока и века, способной имитировать физиологический объем слезы. Модели создаются из напечатанных на 3D-принтере форм (политетрафторэтиленовых или тефлоновых форм), которые можно использовать для создания моделей глаз из различных полимеров, таких как полидиметилсилоксан (PDMS) и агар. Дальнейшие модификации окуляров, такие как интеграция эксплантированной роговицы человека или животного или конструкции роговицы человека, позволят проводить более сложные исследования глаз in vitro. Коммерческий микрофлюидный шприцевой насос интегрирован с платформой для имитации физиологической секреции слезы. Воздействие воздуха и механический износ достигаются с помощью двух механических приводов, один из которых перемещает наконечник века в сторону, а другой перемещает окуляр в круговом направлении. Модель была использована для оценки КЛ на предмет доставки лекарств и осаждения компонентов слезы на КЛ.

Введение

Два важных областях, представляющих интерес в пределах контактных линз (CL) арене включают дискомфорт и разработку новых приложений CL. Выяснение механизмов , лежащих в основе CL дискомфорта является вопросом , который ускользает поле в течение многих десятилетий. 8 Развитие новых, функциональных КН, такие как устройства доставки лекарственных средств 1,3,9 и биосенсоров, 10-12 является областью растущего интереса, с существенными потенциальными рынками. В обоих случаях, сложная и в модели пробирке будет предоставлять соответствующую информацию для оказания помощи в выборе материалов подходит для объективов или конструктивных характеристик на этапе разработки. К сожалению, в настоящее время моделях пробирке для оценки КН и других приложений , связанных со зрением являются относительно грубыми и бесхитростно. Традиционно, в пробирке исследования CL , оценивающие слезоточивым осаждения пленки или доставки лекарственного средства выполняются в статических, больших флаконах объемом , содержащих фиксированный объем жидкости, который GreaTLY превышает физиологические количества. Кроме того, эта простая модель не естественный компонент потока на разрыв и мерцающего рефлекс, оба из которых являются определяющими факторами глазного среды.

Разработка сложных, физиологически соответствующих глаз "модели" потребует междисциплинарного подхода и требуют существенной в естественных условиях проверки. По этим причинам, фундаментальная основа для нашей экстракорпорального модели глаза в очень универсальна, так что модель может быть постоянно улучшена за счет будущих обновлений и модуляций. На сегодняшний день модель способна имитировать слезоточивый объем, слезоточивый поток, механического износа и воздействия воздуха. Цель состоит в том, чтобы создать модель в пробирке , которая обеспечит значимые результаты, что является предсказанием и бесплатно в естественных условиях и естественных условиях наблюдений бывших.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты были завершены в соответствии и с соблюдением всех соответствующих руководящих принципов, изложенных в Университете Ватерлоо исследований животных комитета по этике. Бычьего глаза щедро пожертвовали от местного бойне.

1. Модель глаз

  1. Проектирование и производство пресс - форм 13
    1. Дизайн модели глаз в соответствии со средними физиологических размеров взрослого глаз человека. 13
    2. Отступ 250 мкм между глазным яблоком и веко куски модели глаза. Конструкция соответствующих пресс-форм с помощью разработки программного обеспечения автоматизированного (САПР).
    3. Создать новый файл .cad или .sldprt файл с AutoCAD или Solidworks. Создание 3D модели человеческого глазного яблока / веко. Создание форм из моделей и сохранять формы в виде .stl файлов.
    4. Импорт .stl файлов в программное обеспечение принтера 3D (например, makeware для replicator2). Укажите параметры печати (местоположение, разреженность, масштаб, ориентация, гладкость и т.д. ) 13.
    5. Сохраните файл под именем G-кода файла для 3D-принтеров для чтения. Выберите материалы , такие как АПТ (полимолочной кислоты), ABS (акрилонитрил - бутадиен - стирол), PC (поликарбонат), или их комбинации, для печати пресс - формы 13.
    6. Установить желаемую нить материала выбора. Импорт файла G-кода в 3D-принтер для чтения. Печать пресс-формы.
      Примечание: В качестве альтернативы, производят глазные формы с помощью компьютера числовым программным управлением (ЧПУ) машина, если гладкая поверхность на модели глаза желательно. Для изготовления пресс-форм с ЧПУ, материалы для пресс-форм, больше не ограничивается тепловыми пластике, но распространяется на металл, керамика, а также химически резистивных полимеров, таких как политетрафторэтилена.
    7. Открытый программный интерфейс с ЧПУ, который соединен с режущим сверлом. Построить 3D формы в соответствии с передней, сверху, сбоку и вид в перспективе ранее построенной модели глазного яблока / веко форм в программном интерфейсе управления. Выберите соответствующие параметры дляобработка (немного размер, материал подложки, толщина материала) и приступить к вырезать форму.
  2. Синтез Окуляры с использованием PDMS
    1. С помощью шприца, измерить 10 мл объема PDMS (полидиметилсилоксана) базы и заполнить его в центрифужную пробирку 15-50 мл. Добавьте 10% вес / объем раствора эластомера от общей массы PDMS. С помощью палочки-мешалки, смешать растворы хорошо.
    2. Налейте раствор PDMS в глазное яблоко и веко формы. Разрешить PDMS, чтобы поселиться в РТ O / N (или, по крайней мере, 12 ч) для начала полимеризации и позволить пузырьки, чтобы растворить из полимера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том, что нет никаких пузырей, оставленных в PDMS, которые могут расти или расширяться.
    3. Затем поместите пресс-формы в 75 ° С (167 ° F) духовке в течение 1 ч, или 150 ° C (302 ° F) в течение 5 мин. Для получения более мягкого геля, пусть PDMS сидеть при комнатной температуре в течение по крайней мере 48 часов, чтобы полностью полимеризуется.
    4. Поместите образцы в морозильной камере в течение нескольких минут; это будет сжать PDMS и упроститьВскрытие образцов из пресс-форм. Извлеките окуляры из пресс-форм с помощью тонкого шпателя.
    5. Для доставки раствора в пространство между глазным яблоком и веко куски, соединить 1/16 "х 1/8" политетрафторэтилена трубку с разъемом 1/16 «равной ноге стяжка трубы и прикрепить его к веко кусок в отверстие трубки ,
  3. Синтез Eyeball Кусок Использование агарозном
    Примечание: Глазное яблоко часть может быть синтезирована с использованием других полимеров, таких как агароза. Следующая процедура также может быть изменен, чтобы произвести глаз кусочки из различных типов агар, таких как PDA (картофельный агар с декстрозой) или SDA (декстрозный агар Сабуро).
    1. Для получения 2% (2 г / 100 мл) гель, мера 2 г агарозы и смешивают с 100 мл сверхчистой воды. Доведите раствор до кипения (100 ° C) таким образом, что агарозном растворяется полностью. Дают раствору остыть в течение 5 мин.
    2. Налейте раствор в глазное яблоко формы и дайте раствору остыть в течение 30 мин при комнатной температуре. Удалить глазного яблока кусочки с помощью шпателя. Хранить агар глазного яблока в -20 ° С с морозильной камерой для последующего использования. Для исследований микробиологических, стерилизовать глазного яблока формы автоклавированием и / или УФ-облучения.
  4. Включение бычьего роговицу на PDMS Eyeball
    Примечание:. Этот протокол был адаптирован из Parekh и др 14
    1. Выполните рассечение и включение говяжьих роговицу в стерильных условиях под колпаком с ламинарным потоком. Приобретать глаза и рассекать их в тот же день.
    2. Поверните кожух потока на 10 мин до использования и дезинфицировать с 70% -ным спиртом этанола. Убедитесь в том, что все материалы и инструменты стерильны автоклавированием при 273 ° F / 133 ° С в течение 45 мин, и расположены не менее 4 дюймов от входа капота потока.
    3. Опустить глаза крупного рогатого скота в химический стакан, содержащий разбавленный повидон-йода в течение 2 мин. Промыть глаза в химический стакан, содержащий фосфатно-буферный раствор (PBS), рH 7.4. Использование щипцов осторожно положите глаз на стеклянную чашку Петри, роговице лицевой стороной вверх.
    4. Удалите излишки мышц и жировой ткани путем разрезания на склеры точек крепления с тупым концом рассечение ножницами. Утилизацию избыточной ткани в стерильный стакан, предназначенную для отходов животного происхождения.
    5. С помощью микро-ножницы, удалите конъюнктиву из глаза. Оберните глаз стерильной марлей, сохраняя расстояние не менее 1 см от лимба.
    6. Используя скальпель, надрезать склеры примерно 2 мм от лимба области и поверхностно таким образом, чтобы избежать проникновения нижележащей сосудистой оболочке глаза и стекловидного тела. Осторожно продлить разрез на 360 ° с помощью скальпеля или рассечение ножницами, не деформируя роговицу от его естественной кривизны.
    7. С тонким пинцетом, удалите роговую оболочку из глаза. Использование щипцов, тщательно удалить любые остатки увеальной ткани и промойте роговицу с PBS.
    8. Храните роговицу при 31ºC в стерильный контейнер с культуройсреда (например, среде 199), содержащий 3% фетальной бычьей сыворотки, чтобы поддерживать влажность тканей и клеток питание.
    9. До начала экспериментов, отдохнуть вырезанную роговицу на глазное яблоко PDMS, и зажимают две части вместе со специализированным Петличный.

2. Blink-платформа

  1. Проектирование и производство Blink-платформы
    Примечание: Мигание-платформа состоит из трех функциональных частей: модель глаза (как описано в разделе 1), трансмиссионные системы, а также электронная система.
    1. Проектирование и производство моргания платформу с использованием САПР и 3D-печать, аналогичную описанной для модели глаза (раздел 1.1). Конструкция системы передач таким образом, что она транслирует простое вращение двигателей в боковых и вращательных движений в окуляры. 15
    2. С помощью шестерней и передаточный механизм, перевести вращательное движение шагового двигателя в боковом движении зубчатого колеса, которое соединено с веко штук.
    3. Используясопряженная система передач, усиливать одно вращательное движение от шагового двигателя на три (или более) ротационных движений для трех различных частей глазного яблока.
    4. Совместите два передаточных систем, один для веко и один для глазного яблока, таким образом, чтобы расстояние между двумя постоянными. Соберите электронную систему с микроконтроллером, щитом двигателя и двух двигателей.
      Примечание: Используйте два шаговых двигателей, чтобы обеспечить вращательных двигателей, что переводится системой передачи в мигающем движения.
    5. Соедините два шаговых двигателей с системой, состоящей из двигателя щита устанавливаются на микроконтроллер. Подключение и настройка электронных компонентов для работы с открытыми исходными кодами программных продуктов.
    6. Программирование системы для контроля параметров двигателя, таких как выстрелов в минуту (RPM), количество раундов вперед, количество раундов назад и поворота стиля.
      Примечание: Обратитесь к дополнительному "Arduino файл кода" для подробностей.
    7. Загрузите программное обеспечение системы с масайт nufacturers.
    8. Установка программного обеспечения и открыть его. Написать код для управления шаговым двигателем в нужной конфигурации. Подключение системы с источником для питания электронной системы, так что двигатели двигаться в желаемом порядке, как это определено исследователем.
      Примечание: Обратитесь к дополнительному "Arduino файл кода".
  2. Монтаж с Microfluidics (Tear Искусственное Solution)
    1. Возьмите синтезированный глазного яблока и век кусочки и скольжения их на соответствующие им клип дополнения для глаз модели. Подключите трубку, которая соединяется с помощью шприца и расположенный на микрожидком насоса с веко части (раздел 1.2.5). Пробный запуск платформы и проверить для последовательного движения.
    2. Премьер-трубки и проверьте наличие стационарного потока искусственного раствора слезной (ATS). Рецепт для САР уже сообщалось ранее. 16
    3. Вручную переместить модели глаза вместе частей на ровной поверхности, таким образом, что глазное яблоко, и глазкрышки находятся в контакте. Установить расход микрожидком насоса до требуемых значений. Установить физиологические скорости потока в 1-1.5 мкл / мин. 17
    4. Включите насос и исполнительные механизмы, чтобы начать эксперимент. Для экспериментов доставки лекарственного средства, место, содержащим лекарственное средство контактные линзы на глазное яблоко кусок.
    5. Дайте проточный жидкости капать в 12-луночный планшет. В нужный набор интервалов времени, количественного определения анализируемого вещества или концентрации лекарственного средства с использованием обычных методов обнаружения , таких как УФ-Vis спектроскопии или флуоресценции. 1,4,18
    6. Для исследований, оценивающих осаждение компонентов слезных на контактные линзы, поместите контактные линзы на "глазного яблока" кусок. Собирают проточную жидкость, которая может быть отброшен.
    7. После того, как желаемые промежутки времени, снимите контактные линзы от глазного яблока кусок и подготовить объектив для дальнейшего анализа, таких как конфокальной микроскопии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Синтезированные глазные формы , полученные из механического цеха и от 3-D печати показаны на рисунке 1. Эти формы могут быть использованы с различными полимерами, такими как PDMS и агарозы, чтобы произвести окуляра с требуемыми свойствами. Поманил сборка модели глаза платформы с микрожидком шприцевой насос , показан на рисунке 2. Платформа имитирует механический износ за счет вращения глазного яблока части, и воздействия воздуха через боковые в и из движ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Есть три важных шагов в рамках протокола, которые требуют особого внимания: разработка и изготовление пресс-форм (раздел 1.1), монтажная платформа (раздел 2.2.1-2.2.3), а также мониторинг экспериментальный пробег (раздел 2.2.4-2.2.7 ). С точки зрения проектирования и производства пресс-форм (раздел 1.1), глазное яблоко кусок должен быть разработан в соответствии с размерами человеческой роговицы. Тем не менее, может потребоваться несколько прототипов формы перед глазного яблока кусок может быть создан, который идеально ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы отметить наш источник финансирования NSERC 20/20 сеть для развития передовых офтальмологических материалов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Arduino Uno R3 (Atmega328 - в сборе)Adafruit50Board
Шаговый двигательAdafruit324Мотор и моторный щит
Муфта на равных ногах 1,6 мм 1/16"VWRCA11009-28050 шт. Соединитель трубки
PT/SIL 1/16"x1/8"VWR16211-316Корпус 50 футов
PDMSDow CorningSylgard 184 Солнечная батарея Инкапсуляция
Агароза, тип 1-A, низкий EEOSigma-AldrichA0169-25G
PHD UltraTMГарвардский аппарат703006микрофлюидный насос
Роговица крупного рогатого скотаCargill, Guelph/ON
SoldidworksDassault SystèmesSoftware
3-D печатьУниверситет Ватерлоо - Центр 3D-печати
Инструменты для препарированияFine Science ИнструментыОбщие инструменты для препарирования
Среда 199Sigma-AldrichКультуральная среда для хранения роговицы
Фетальная бычья сывороткаThermo FisherДобавить в культуральную среду, 3% от общего объема

Ссылки

  1. Phan, C. M., Subbaraman, L. N., Jones, L. In vitro drug release of natamycin from beta-cyclodextrin and 2-hydroxypropyl-beta-cyclodextrin-functionalized contact lens materials. J Biomater Sci Polym Ed. 25, 1907-1919 (2014).
  2. Peng, C. C., Kim, J., Chauhan, A. Extended delivery of hydrophilic drugs from silicone-hydrogel contact lenses containing vitamin E diffusion barriers. Biomaterials. 31, 4032-4047 (2010).
  3. Hui, A., Willcox, M., Jones, L. In vitro and in vivo evaluation of novel ciprofloxacin-releasing silicone hydrogel contact lenses. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 4896-4904 (2014).
  4. Boone, A., Hui, A., Jones, L. Uptake and release of dexamethasone phosphate from silicone hydrogel and group I, II, and IV hydrogel contact lenses. Eye Contact Lens. 35, 260-267 (2009).
  5. Lorentz, H., Heynen, M., Trieu, D., Hagedorn, S. J., Jones, L. The impact of tear film components on in vitro lipid uptake. Optom Vis Sci. 89, 856-867 (2012).
  6. Hall, B., Phan, C. M., Subbaraman, L., Jones, L. W., Forrest, J. Extraction versus in situ techniques for measuring surface-adsorbed lysozyme. Optom Vis Sci. 91, 1062-1070 (2014).
  7. Mishima, S., Gasset, A., Klyce, S. D., Baum, J. L. Determination of tear volume and tear flow. Invest Ophthalmol Vis Sci. 5, 264-276 (1966).
  8. Nichols, J. J., et al. The TFOS international workshop on contact lens discomfort: executive summary. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54, 7-13 (2013).
  9. Peng, C. C., Burke, M. T., Carbia, B. E., Plummer, C., Chauhan, A. Extended drug delivery by contact lenses for glaucoma therapy. J Control Release. 162, 152-158 (2012).
  10. Faschinger, C., Mossbock, G. Continuous 24 h monitoring of changes in intraocular pressure with the wireless contact lens sensor Triggerfish. First results in patients. Der Ophthalmologe : Zeitschrift der Deutschen Ophthalmologischen Gesellschaft. 107, 918-922 (2010).
  11. Shaw, A. J., Davis, B. A., Collins, M. J., Carney, L. G. A technique to measure eyelid pressure using piezoresistive sensors. IEEE transactions on bio-medical engineering. 56, 2512-2517 (2009).
  12. Liao, Y. T., Yao, H. F., Lingley, A., Parviz, B., Otis, B. P. A 3-mu W CMOS glucose sensor for wireless contact-lens tear glucose monitoring. Ieee J Solid-St Circ. 47, 335-344 (2012).
  13. Coster, D. J. Cornea. , John Wiley & Sons. Wiley-Blackwell (Imprint) John Wiley & Sons (2002).
  14. Parekh, M., et al. A simplified technique for in situ excision of cornea and evisceration of retinal tissue from human ocular globe. Journal of visualized experiments : JoVE. , e3765(2012).
  15. Gear and pinion. US patent. , US2279216A (1942).
  16. Lorentz, H., et al. Contact lens physical properties and lipid deposition in a novel characterized artificial tear solution. Molecular vision. 17, 3392-3405 (2011).
  17. Furukawa, R. E., Polse, K. A. Changes in tear flow accompanying aging. American journal of optometry and physiological optics. 55, 69-74 (1978).
  18. Bajgrowicz, M., Phan, C. M., Subbaraman, L., Jones, L. Release of ciprofloxacin and moxifloxacin from daily disposable contact lenses from an in vitro eye model. Invest Ophthalmol Vis Sci. , (2015).
  19. Luensmann, D., Zhang, F., Subbaraman, L., Sheardown, H., Jones, L. Localization of lysozyme sorption to conventional and silicone hydrogel contact lenses using confocal microscopy. Current eye research. 34, 683-697 (2009).
  20. Tieppo, A., Pate, K. M., Byrne, M. E. In vitro controlled release of an anti-inflammatory from daily disposable therapeutic contact lenses under physiological ocular tear flow. Eur J Pharm Biopharm. 81, 170-177 (2012).
  21. Ali, M., et al. Zero-order therapeutic release from imprinted hydrogel contact lenses within in vitro physiological ocular tear flow. J Control Release. 124, 154-162 (2007).
  22. White, C. J., McBride, M. K., Pate, K. M., Tieppo, A., Byrne, M. E. Extended release of high molecular weight hydroxypropyl methylcellulose from molecularly imprinted, extended wear silicone hydrogel contact lenses. Biomaterials. 32, 5698-5705 (2011).
  23. Kaczmarek, J. C., Tieppo, A., White, C. J., Byrne, M. E. Adjusting biomaterial composition to achieve controlled multiple-day release of dexamethasone from an extended-wear silicone hydrogel contact lens. J Biomater Sci Polym Ed. 25, 88-100 (2014).
  24. Mohammadi, S., Postnikoff, C., Wright, A. M., Gorbet, M. Design and development of an in vitro tear replenishment system. Ann Biomed Eng. 42, 1923-1931 (2014).
  25. Lorentz, H., Heynen, M., Khan, W., Trieu, D., Jones, L. The impact of intermittent air exposure on lipid deposition. Optom Vis Sci. 89, 1574-1581 (2012).
  26. Peng, C. C., Fajardo, N. P., Razunguzwa, T., Radke, C. J. In vitro spoilation of silicone-hydrogel soft contact lenses in a model-blink cell. Optom Vis Sci. 92, 768-780 (2015).
  27. Liu, P., et al. Dissolution studies of poorly soluble drug nanosuspensions in non-sink conditions. AAPS PharmSciTech. 14, 748-756 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Модель глаза in vitroтестирование контактных линзсимуляция слезной жидкостиинтеграция микрофлюидного насосамодель глаза из ПДМСприготовление глазного яблока из агарозыинтеграция бычьей роговицысимуляция механического морганияоценка доставки лекарственных средстванализ методом конфокальной микроскопии
Развитие
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.