Методическая статья

In Vitro разборке вируса гриппа капсиды по градиентное центрифугирование

DOI:

10.3791/53909

⸱

27 марта 2016 г.

 ,  , 
1Institute of Biochemistry, ETH Zurich, 2Department of Biochemistry, University of Zurich, 3Institute for Molecular Health Sciences, ETH Zurich

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Разборка ядер вируса гриппа А во время проникновения вируса в клетки-хозяева является многоступенчатым процессом. Мы описываем метод in vitro для анализа ранних стадий раскрытия вируса. В этом подходе центрифугирование с градиентом скорости используется для биохимического анализа этапов, которые инициируют снятие покрытия при определенных условиях.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Молекулярные процессы, вызванные кислотой, точно контролируют проникновение в клетки многих вирусов, которые проникают через эндоцитарную систему. В случае вируса гриппа А (IAV) слияние вируса с эндосомальной мембраной, а также последующая разборка вирусного капсида, называемая раскрашиванием, регулируются ионными условиями внутри эндоцитарных везикул. Ранние этапы жизненного цикла вируса трудно изучить, потому что эндосомы не могут быть напрямую доступны экспериментально, что создает необходимость в подходе in vitro. В данной работе мы описываем метод, основанный на центрифугировании очищенных вирионов с помощью двухслойного глицеринового градиента, который позволяет анализировать ядро IAV и его стабильность. Градиент содержит неионогенное детергент (NP-40) в своем нижнем слое для удаления вирусной мембраны путем солюбилизации по мере того, как вирус оседает на дне. При нейтральном pH вирусные ядра гранулируются в виде стабильных структур. Основные компоненты ядра, матричный белок (M1) и вирусные рибонуклеопротеины (vRНП), могут быть четко идентифицированы во фракции гранул с помощью SDS-PAGE. Снижение pH до 6,0 или ниже в нижнем слое избирательно удаляет M1 из гранул с последующим высвобождением vRNP в более кислых условиях. Полосы вирусных белков на гелях, окрашенных Кумасси, могут быть подвергнуты денситометрическому количественному определению для мониторинга промежуточных состояний разборки IAV. Помимо pH, можно оценить и другие факторы, влияющие на стабильность вирусного ядра, такие как концентрация соли и предполагаемые факторы раскрытия вируса, просто изменив слой глицерина, содержащего детергент. В совокупности представленная методика позволяет проводить высоковоспроизводимый и количественный анализ вирусного покрытия in vitro. Его можно применять к другим оболочечным вирусам, которые подвергаются сложным процессам снятия покрытия.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вирус гриппа А (ИФО) является оболочечный вирус и принадлежит к семейству Orthomyxoviridae. Его гены кодируют на сегментированных отрицательного смысла и одноцепочечной РНК-генома. У людей, IAV вызывает респираторные инфекции, которые происходят в сезонных вспышек эпидемии и несет потенциал для глобальных пандемий 1. После связывания с остатками сиаловой кислоты на поверхности клетки - хозяина 2, ИФО интернализируется в клатрин-зависимой эндоцитоза и клатриновых-независимых путей 3-8. Кислая среда (рН <5,5) в эндоцитических вакуолей вызывает значительное конформационные изменения в IAV спайка гликопротеина гемагглютинина (HA), что приводит к слиянию вирусной и поздней эндосомальной мембраны 9. После того, как капсида IAV (здесь также упоминается как вирусный "ядро") сбежал из поздних эндосом (LES), она не покрытом в цитозоле с последующим транспортом вирусных рибонуклеопротеинов (vRNPs) в ядро ​​- сайт Oрепликация вируса F и транскрипции 10-13. До активации кислотой HA вируса испытывает постепенное снижение рН в системе эндоцитоза, что простые числа ядро для последующей его разборки 14-16. В этой "затравки" шаг ионных каналов М2 в вирусной мембране опосредуют приток протонов и K +10,14,16. Изменение концентрации ионов в интерьере вируса нарушает взаимодействие создать с помощью вирусного белка матрицы M1 и vRNP пучка восемь, и способствует Iav декапсидацию в цитоплазме следующего слияния мембран 10,14-17.

Прямой и количественный анализ на стадии грунтовочного было затруднено тем, что эндосомы трудно экспериментально получить доступ. Процесс входа, кроме того, весьма несинхронное. Кроме того, конечной точки анализы, такие как QRT-PCR высвобождаемых измерения вирусной РНК или инфекционности, не дают детальное представление о биохимическом состоянии вирусного capsiг при любом данном этапе записи. В то время как возмущение эндосомы, миРНК или медикаментозного лечения в значительной степени способствовало пониманию IAV записи 18-20, тонкая настройка трудно и склонны к неспецифических побочных эффектов в строго контролируемой программе эндосомы созревания.

Чтобы избежать этих проблем, мы адаптировали ранее разработанный протокол в пробирке , основанный на использовании градиента скорости центрифугирования 17. В отличие от других попыток 21,22, 23,24, которые были в основном на основе комбинации протеолитического расщепления и обработки детергентом с последующим анализом EM, этот подход позволил в легко измеримый результат. Центрифугирование через различные слои градиента позволяет осаждающихся частиц, которые будут подвергаться воздействию и реагировать с изменением условий контролируемым образом. В представленном протоколе, ИФО полученный из осветленного аллантоисной жидкости или очищенных вирусных частиц осаждают в двухслойную глицерина вградиент , в котором нижний слой содержит неионогенный детергент NP-40 (рисунок 1). По мере того как вирус входит во вторую, детергентов слой, содержащий, вирусные липидной оболочки и гликопротеины оболочки мягко солюбилизировали и оставили позади. Ядро, состоящий из восьми vRNP пучка и окружены матричным слоем, отложения в качестве стабильной структуры в гранулированной фракции. Вирусные основные белки, такие как M1 и vRNP-ассоциированной нуклеопротеида (NP), могут быть идентифицированы в осадке с помощью SDS-PAGE и окрашиванием Кумасси. В частности, пользуясь имеющимися в продаже градиентном геле и окрашиванием с высокочувствительным коллоидного кумасси 25, обеспечивает высокую точность и обнаружение даже небольших количеств вирусных ядро-ассоциированных белков.

Это закладывает основу для тестирования является ли различных условий, таких как рН, концентрации соли и предполагаемых раздевания факторов оказывают влияние на поведение оседания основных компонентов и ядра Stabil ность. Для этой цели, только нижний, моющее средство слой, содержащий в градиенте глицерина модифицирован путем введения фактора или состояния интереса. Техника была особенно ценным при исследовании влияния различных значений рН и концентрации солей на целостность ядра IAV 16. Промежуточные этапы IAV раздевания можно было бы контролировать в том числе диссоциации матричного слоя при слегка кислом рН (<6,5) с последующим vRNP диссоциации при рН 5,5 и ниже 16,17 (рисунок 1). Последний шаг был еще более усиливается наличием высокой концентрации К + в глицериновый слой, отражающий поздний эндоцитических среду 16. Таким образом, как вирус и ядро ​​осаждали через градиент они испытали изменяющуюся среду, которая имитирует условия в эндосомы. Результатом стала поэтапная разборка вирусного ядра в пробирке, дополняя результаты , полученные из клеточной биологии анализов.

т "> Метод , представленный здесь , позволило быстро и легко воспроизводимым анализ IAV (X31 и A / WSN / 33) и IBV (B / Lee / 40) раздевания вызвано кислом рН и увеличение K +16,17, а также разборки из парамиксовирусной сердечников при воздействии 17 щелочном рН. можно предположить , что этот подход может быть адаптирован к другим оболочечных вирусов , чтобы получить представление о биохимических свойств вирусного капсида и структуры капсида разборки во время ввода данных в ячейку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка буферами и маточные растворы

  1. Подготовка MNT буфера (20 мМ MES, 30 мМ Трис и 100 мМ NaCl) при растворении 470 мг трис - гидрохлорида, 390 мг MES гидрата и 580 мг NaCl в 80 мл DDH 2 O. Настройка буфера до рН 7,4 , и довести его до конечного объема 100 мл с DDH 2 O.
  2. Подготовьте три идентичных решения 500 мМ MES - ​​буфера путем растворения 9,76 г MES гидрат в 80 мл дН 2 O каждый. Отрегулировать буферы до рН 5,8, 5,4 и 5,0, соответственно, титрованием с помощью концентрированной NaOH. Доведите каждый буфер до конечного объема 100 мл с дН 2 O.
  3. Приготовьте два идентичных растворов 500 мМ трис - буфера путем растворения 7,88 г трис - гидрохлорида в 80 мл дН 2 O каждый и регулировать рН до 7,4 и 6,4, соответственно, титрованием с помощью концентрированной HCl. Доведите буфера до конечного объема 100 мл с дН 2 O.
  4. Приготовьте 50% -ный раствор глицерина в дН 2 O и размешать хорошо до GlycЭрол гомогенно смешивают. Фильтр раствора через Steritop блок фильтра (размер пор 0,22 мкм) в стеклянной бутылке.
  5. Приготовьте 10% раствор NP-40 и 1 М NaCl в дН 2 O.
  6. Приготовьте 25x ингибитор протеазы концентрированную путем растворения двух таблеток в 4 мл DDH 2 O.

2. Приготовление глицерине Градиенты

  1. Подготовка 5 мл детергента мастер-буферной смеси (300 мМ NaCl, 2% NP-40, 2x концентрированный ингибитор протеазы) раствор для каждого условия рН для теста (рН 7,4, 6,4, 5,8, 5,4 и 5,0). Для этого смешайте 9 мл 1 М NaCl, 6 мл 10% NP-40, 2,4 мл на 25x ингибитор протеазы запаса и 9 DDH мл 2 0.
  2. Для каждого значения рН состояния пипеткой 4,4 мл мастер-смеси в 50 мл коническую пробирку.
  3. Для получения значений рН выше 5,8 добавляют 0,6 мл соответствующего отрегулированным значением рН 500 мМ Трис-маточного раствора в пробирку. Для рН 5,8 и ниже, добавляют 0,6 мл соответствующего отрегулированным рН раствора 500 мМ MES.
  4. Сделайте 5мл буферного раствора , содержащего 300 мМ NaCl, ингибитор протеазы , 2x, 60 мМ Трис рН доводили до 7,4 и DDH 2 O. Это будет служить в качестве моющего средства, свободной от буфера управления градиентом.
  5. При необходимости точной регулировки рН растворов до рН 7,4, 6,4, 5,8, 5,4 и 5,0 добавлением концентрированной HCI или NaOH растворы, соответственно.
  6. Добавьте 5 мл 50% -ного раствора в глицерине до 5 мл моющего средства, содержащего и моющих свободных смесей буферных результате в шести различных 25% -ного раствора глицерина. Проверьте значения рН с помощью индикатора рН полоски.
    Примечание: В случае измеренный рН существенно отличается от требуемого значения, соответствующие решения должны быть готовы снова.
  7. Готовят 15% раствора глицерина путем смешивания 50% глицерине с дН 2 O в соотношении 3: 7.

3. ультрацентрифугирования IAV

  1. Добавьте 3 мл 15% раствора глицерина в ультра-прозрачных центрифужные пробирки (13,2 мл, 14 мм х 89 мм), с помощью 5 мл шприц и урожденнаяСКД (21 г, длину 9 см). Не оставлять капель на внутренней стенке трубы, как это могло бы нарушить целостность градиента. Повторите это в общей сложности шесть центрифужные пробирки, по одному для каждой из пяти условий рН, чтобы проверить и один для контрольного образца.
  2. Тщательно помещают 3,4 мл 25% раствора глицерина под слоем глицерина 15% с помощью 5 мл шприца и длинной иглой. Будьте осторожны, чтобы не смешивать эти два слоя. Повторите эту процедуру для всех шести условий для проверки с соответствующими отрегулированным рН растворов глицерина.
    Примечание: Работа в кабинете биологической безопасности класс II для следующих шагов.
  3. Аккуратно наложения глицерина градиенты с 30 мкл осветленных аллантоисной жидкости, содержащей Iav (X31, H3N2), разведенного в 1 мл буфера (МНТ соответствует около 20-30 мкг общего вирусного белка) для каждого градиента.
  4. Баланс противоположных трубок и поместить их в ультрацентрифугирования ротор SW41. Центрифуга в течение 150 мин, при 55000 х г, и 12 ° C.
  5. После центрифугирования, тщательноудалить супернатант, то есть оба слоя глицерина с помощью чистой пипетки Пастера и аспиратора. Ресуспендируют осадок в 40 мкл (1x) невосстанавливающих буфера для образцов LDS. Важно пипеткой вверх и вниз несколько раз, чтобы полностью растворить осадок. Передача образца в 1,5 мл трубки микроцентрифужных.

4. SDS-PAGE пеллетных дробей и окрашиванием Кумасси

  1. Нагреть все образцы при температуре 95 ° С в течение 10 мин. На этом этапе образцы могут храниться при температуре от -20 ° С до тех пор, пока они анализируют с помощью SDS-PAGE.
  2. Нагрузка 20 мкл растворенных гранул на предварительно отлитого градиентом (4-12%), мини-гель Bis-Tris и работать в течение 1 ч при 200 В в 1х MOPS SDS проточном буфере.
  3. Сделать фиксации раствора с 40% метанола и 10% ледяной уксусной кислоты в DDH 2 O.
  4. Инкубировать гель в фиксирующей растворе в течение 1 часа и окрашивают в течение ночи в 15 см для культивирования клеток в чашке с достаточным объемом коллоидного раствора Кумасси, осторожновстряхивании при комнатной температуре.
    Примечание: Важно, чтобы закрыть тарелку, чтобы избежать испарения окрашивающего раствора.
  5. Destain геля в DDH 2 O. Заменить DDH 2 O каждые 15-20 мин , пока фоновый гель не станет ясно. Хранить гель в DDH 2 O при температуре 4 ° С до тех пор, пока не будет проверяться на наличие полосы квантификации.
  6. Сканирование геля при высоком разрешении и использовать имеющиеся в продаже или на заказ программное обеспечение для количественного определения интенсивности полосы белка. Вычтите фоновый сигнал из области, близкой к соответствующим диапазонам и нормализовать эти значения для моющих средств, свободных от контрольных образцов (при рН 7,4).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Как уже говорилось, грунт в эндосомами требуется, чтобы сделать ядро ​​Iav раздевания компетентным. Известно, что протонирование ядра ослабляет взаимодействие М1 и vRNPs (в составе вирусной РНК, NP, и полимераза PB1 / PB2 / ПА). Этот процесс начинается, когда входящий вирус подвергается рН 6,5 (или ниже) в ранних эндосом (ЭЭС) и продолжается до вируса перегорает при рН около 5,0 в Лез.

Для того, чтобы имитировать снижение рН, ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вирусные капсиды являются метастабильными макромолекулярных комплексов. В то время как сборка вирионов требует капсидирования и конденсацию генома вируса, начало следующего раунда инфекции зависит от разборки этой компактной конструкции капсида. Вирусы развились , чтобы использовать различные клеточные механизмы для контроля покрытия-раздевание цикла, в том числе клеточных рецепторов, наставниками, протеолитические ферменты, физические силы , предоставляемые моторными белками или геликаз, а также рН и ионной переключате...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Yohei Ямаути и Роберта Манчини за предоставление нам реагентов. Лаборатория AH была поддержана Первоначальными Networks обучения Мари Кюри (ITN), Европейский совет по научным исследованиям (ERC) и Швейцарского Национального научного фонда (Sinergia).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
cOmplete™, таблетки ингибитора протеазы без ЭДТАСигма-Олдрич11873580001Стоковый раствор может храниться при температуре от 2 до 8 °Д; C в течение 1-2 недель
Ледяная уксусная кислотаMerck Millipore100063
Глицерин безводный BioChemicaAppliChemA1123
Соляная кислотаMerck Millipore100317
Длинная инъекционная игла (21  G, 9 см, скошенный или тупой)
MES гидратSigma-AldrichM8250
МетанолMerck Millipore106009
NP-40Sigma-AldrichI8896Теперь коммерчески доступен как IGEPAL® CA-630
NuPAGE 4-12% Bis-Tris мини-гели, 10  скважины, 1,0 ммLife TechnologiesNP0321
NuPAGE LDS буфер для проб (4x)Life TechnologiesNP0008
NuPAGE MOPS SDS беговой буфер (20x)Life TechnologiesNP0001
индикаторные полоски pH, pH 4,0-7,0Merck Millipore109542
QC коллоидное краситель для кумассиBIO RAD1610803
Sodium хлоридMerck Millipore106406
гидроксид натрияMerck Millipore106498
фильтрующий блок SteritopMerck MilliporeSCGPT05RE
SW41 Ti, комплект роторов ультрацентрифугиBeckman Coulter331336
Thinwall, ультрапрозрачные центрифужные пробирки, 13,2  мл, 14 мм x 89 ммBeckman Coulter344059
Tris hydrochloride AppliChemA1087
X31 Influenza A virus (H3N2), выращенный из яиц, осветленная аллантоисная жидкостьVirapurСвежеразмороженная на 4 ° С

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Taubenberger, J. K., Kash, J. C. Influenza Virus Evolution, Host Adaptation, and Pandemic Formation. Cell host & microbe. 7 (6), 440-451 (2010).
  2. Skehel, J. J., Wiley, D. C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annual review of biochemistry. 69, 531-569 (2000).
  3. de Vries, E., et al. Dissection of the influenza a virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway. PLoS pathogens. 7 (3), e1001329(2011).
  4. Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. J Cell Biol. 91 (3 Pt 1), 601-613 (1981).
  5. Patterson, S., Oxford, J. S., Dourmashkin, R. R. Studies on the mechanism of influenza virus entry into cells. J Gen Virol. 43 (1), 223-229 (1979).
  6. Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).
  7. Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. Dissecting virus entry via endocytosis. J Gen Virol. 83 (Pt 7), 1535-1545 (2002).
  8. Yoshimura, A., et al. Infectious Cell Entry Mechanism of Influenza Virus. Journal of Virology. 43 (1), 284-293 (1982).
  9. White, J., Kartenbeck, J., Helenius, A. Membrane-fusion activity of influenza virus. Embo Journal. 1 (2), 217-222 (1982).
  10. Martin, K., Helenius, A. Nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins: The viral matrix protein (M1) promotes export and inhibits import. Cell. 67 (1), 117-130 (1991).
  11. Palese, P., Shaw, M. L. Chapter 47. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Lippincott Williams & Wilkins. 1647-1690 (2006).
  12. Chou, Y. -Y., et al. Colocalization of Different Influenza Viral RNA Segments in the Cytoplasm before Viral Budding as Shown by Single-molecule Sensitivity FISH Analysis. PLoS Pathog. 9 (5), e1003358(2013).
  13. Martin, K., Helenius, A. Transport of incoming influenza virus nucleocapsids into the nucleus. Journal of Virology. 65 (1), 232-244 (1991).
  14. Bui, M., Whittaker, G., Helenius, A. Effect of M1 protein and low pH on nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins. Journal of Virology. 70 (12), 8391-8401 (1996).
  15. Li, S., et al. pH-Controlled Two-Step Uncoating of Influenza Virus. Biophysical Journal. 106 (7), 1447-1456 (2014).
  16. Stauffer, S., et al. Stepwise priming by acidic pH and high K+ is required for efficient uncoating of influenza A virus cores after penetration. Journal of Virology. , (2014).
  17. Zhirnov, O. P. Solubilization of matrix protein M1/M from virions occurs at different pH for orthomyxo- and paramyxoviruses. Virology. 176 (1), 274-279 (1990).
  18. Banerjee, I., et al. Influenza A virus uses the aggresome processing machinery for host cell entry. Science. 346 (6208), 473-477 (2014).
  19. Huotari, J., et al. Cullin-3 regulates late endosome maturation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (3), 823-828 (2012).
  20. Yamauchi, Y., et al. Histone Deacetylase 8 Is Required for Centrosome Cohesion and Influenza A Virus Entry. PLoS Pathog. 7 (10), e1002316(2011).
  21. Bachmayer, H. Selective Solubilization of Hemagglutinin and Neuraminidase from Influenza Viruses. Intervirology. 5 (5), 260-272 (1975).
  22. Reginster, M., Nermut, M. V. Preparation and Characterization of Influenza Virus Cores. Journal of General Virology. 31 (2), 211-220 (1976).
  23. Nermut, M. V. Further Investigation on the Fine Structure of Influenza Virus. Journal of General Virology. 17 (3), 317-331 (1972).
  24. Schulze, I. T. The structure of influenza virus: II. A model based on the morphology and composition of subviral particles. Virology. 47 (1), 181-196 (1972).
  25. Candiano, G., et al. Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).
  26. Greber, U. F., Singh, I., Helenius, A. Mechanisms of virus uncoating. Trends in microbiology. 2 (2), 52-56 (1994).
  27. Yamauchi, Y., Helenius, A. Virus entry at a glance. Journal of Cell Science. 126 (6), 1289-1295 (2013).
  28. Zhirnov, O. P., Grigoriev, V. B. Disassembly of Influenza C Viruses, Distinct from That of Influenza A and B Viruses Requires Neutral-Alkaline pH. Virology. 200 (1), 284-291 (1994).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

NP 40pHSDS PAGEM1

Похожие статьи