Маргинативно-печеночные лейкоциты демонстрируют уникальные характеристики и различные иммунологические функции по сравнению с другими популяциями лейкоцитов. Здесь мы опишем метод селективного сбора этой специфической популяции клеток печени путем принудительной перфузии печени крыс или мышей. Маргинально-печеночные лейкоциты, по-видимому, имеют решающее значение в определении восприимчивости к заболеваниям и метастазам, связанным с печенью.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Селективный Заготовка Marginating-печеночной Лейкоциты
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Было показано, что
Маргинативно-печеночные (MH) лейкоциты (лейкоциты, прилипающие к синусоидам печени) демонстрируют уникальный состав и характеристики по сравнению с лейкоцитами других иммунных компартментов. В частности, данные свидетельствуют об отчетливом про- и противовоспалительном профиле популяции MH-лейкоцитов и более высокой цитотоксичности специфических для печени NK-клеток (а именно, ямочных клеток) по сравнению с циркулирующими или селезеночными иммуноцитами как у мышей, так и у крыс. Представленный здесь способ позволяет селективно собирать лейкоциты MH путем принудительной перфузии печени у мышей и крыс. В отличие от других методов, используемых для извлечения лейкоцитов печени, включая измельчение тканей и биологическую деградацию, этот метод позволяет получать лейкоциты исключительно из синусоид печени, не загрязненные клетками из других печеночных компартментов. Кроме того, метод перфузии лучше сохраняет целостность и физиологическую среду лейкоцитов MH, щадя известные физиологические реакции на обработку тканей. Поскольку многие циркулирующие злокачественные и инфицированные клетки задерживаются при прохождении через синусоиды печени, физически взаимодействуя с эндотелиальными клетками и резидентными лейкоцитами, уникальная популяция лейкоцитов MH стратегически расположена для взаимодействия, идентификации и реагирования на аберрантные циркулирующие клетки. Таким образом, селективный сбор MH-лейкоцитов и их изучение в различных условиях может улучшить наше понимание биологического и клинического значения MH-лейкоцитов, особенно в отношении циркулирующих аберрантных клеток и заболеваний, связанных с печенью, и метастазов рака.
Введение
Синусоидов печени содержат многочисленные подтипы лейкоцитов различных иммунных деятельности исключительно важное значение для организма. Например, marginating печени (MH) естественные киллеры (NK) клетки, также известные как пит клеток, которые характеризуются морфологически, как крупные зернистые лимфоциты (LGLs) и функционально как лейкоциты со спонтанной цитотоксической способности, что позволяет печеночно-устойчивость к созданию крово- принесенные метастазы опухолей. Цель метода , изложенного в настоящем документе, для того, чтобы выборочное заготовкой MH лейкоцитах, в целях изучения этой важной и уникальной популяции клеток (и иммунную отделение), а также для выяснения влияния различных манипуляций (например , активация иммунной системы ) на этих специфических клеток.
Несмотря на провал иммунитета, чтобы устранить развитие первичной опухоли, доказательства у онкологических больных и моделях на животных показывают, что иммунная система может контролировать циркулирующих опухолевых клеток, микрометастазов и остаточной болезни throuГ.Х. клеточный иммунитет (CMI). Тем не менее, существует явная несогласованность между ними в возможностях естественных условиях и в пробирке исследования у человека и у животных, которые показывают , что большинство аутогенные опухолевые клетки устойчивы к цитотоксичности циркулирующими или селезеночных лейкоциты 1,2. Это несоответствие может быть приписано, по крайней мере частично, к существованию в естественных условиях отчетливой лейкоцитарной субпопуляции, а именно marginating-печеночный (синусоидов) лейкоцитами и их субпопуляций активированных NK - клеток, а именно 3 -х пит клеток. В самом деле, неопубликованные данные из нашей лаборатории показали , что у крыс F344 сингенных опухолевых клеток (MADB106), которые были найдены устойчивые к циркулирующим и селезеночной лейкоцитах, лизируют клетки МН-NK 4. Таким образом, опухолевые клетки, которые, как утверждается, "НК-устойчивые" к циркулирующим лейкоцитах можно регулировать с помощью клеток МН-NK. Обращает на себя внимание, у мышей повышенная активность MH-НК видно только после в естественных условиях иммуннойстимулирование (например , за счет использования поли I: C или CpG-С) 5.
Печень-специфический NK-клетки (MH-NK) расположены внутри синусоидальных просвет, придерживаясь эндотелиальных клеток и клеток Купфера. Клетки MH-NK характеризуется исключительно сферическими плотных гранул и стержневых Порошковая везикул 6, которые содержат кислой фосфатазы в качестве лизосомальных ферментов и перфорина и гранзимами в качестве биологически активных веществ 7,8. По сравнению с циркулирующими клетками NK, МН-NK - клетки обладают более высокой количество и размер гранул и везикул 9-11. При воспалительных процессах , клетки МН-НК было показано , что демонстрируют более высокую экспрессию LFA-1 12, по сравнению с циркулирующих НК - клеток. Это расширенное выражение может представлять собой механизм , с помощью которого устройство MH-NK - клетки более токсичным в отношении некоторых опухолевых клеток , чем циркулирующих NK клеток 13,14. nterestingly после инкубации в пробирке с интерлейкина (IL) -2, MH-NK - клетки увеличиваются, иих количество и размер гранул увеличивается, все из которых согласуются с профилем из лимфокинактивированных киллеров (ЛАКК) 15.
Активные лейкоциты MH не могут быть получены исключительно за счет стандартных методов уборки лейкоцитарных печени, которые основаны на измельчении и биологической деградации ткани. Наш подход перфузия описанный здесь имеет два основных преимущества по сравнению со стандартными подходами. Во-первых, перфузия подход селективно заготавливает MH лейкоциты, предотвращая загрязнение другими лейкоцитами из других отсеков печени. Во-вторых, метод перфузии лучше сохраняет целостность, активность и физиологической среде MH лейкоцитах, в отличие от обработки ткани приближается к повреждению клеток или изменению их морфологии, а также из-за повреждения тканей, вызывают высвобождение различных факторов, которые заметно модулировать иммунный Мероприятия.
Печень является основным органом-мишенью для метастазирования рака ай для различных инфекций 16. Как MH клетки обладают уникальными характеристиками, важно изучить эту конкретную группу населения в различных условиях в отношении этих патологий. Например, особо отметить , что системная активация иммунной системы с помощью различных BRMs (например , поли I: С или CpG-С) , как было показано , чтобы активировать MH-лейкоциты более циркулирующих лейкоцитов 5.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Этика Заявление: Процедуры с участием субъектов животных были утверждены Institutional Animal Care и использование комитета (IACUC) по Тель-Авивского университета.
Протокол 1. Крысы
- Препараты
- Готовят раствор гепаринизированной PBS (30 ед / мл), которые будут использоваться при комнатной температуре (RT) путем добавления 30 единиц консервантов гепарина на мл фосфатно-солевого буфера (PBS) 1x раствор. Рассчитать 35 мл на одно животное.
- Pass гепарином PBS через шланговые линии насоса и иглы бабочки, чтобы устранить пузырьки воздуха.
- Стерилизовать хирургических инструментов - 2 пары ножниц, притупляются обрезные пинцет, 2 кровоостанавливающих и пинцет зубной ткани (автоклаве при температуре 121 ° С в течение по крайней мере 30 мин на тяжести (сухой) настройки).
- Кровоснабжение печени и коллекции MH-лейкоциты
- Усыпить животное передозировкой 8% изофлуран. В качестве меры предосторожности, поместите 50 мл пробирку, содержащую изофлуран-soaked накладка вокруг головы крысы до открытия его грудной полости.
- Откройте брюшины и грудной полости, чтобы обнажить печень и сердечно-легочной комплекс сразу после остановки дыхания. Избегайте кровотечения через этот процесс.
- В частности, начать разрез в нижней части живота точки средней линии без повреждения внутренних органов, а также прогресс в обе стороны по диагонали к ребрам, прорезая их на верхние уровни грудной полости.
- В течение примерно в мин, собрать как можно больше крови, как это возможно (~ 6 мл из 250 г животного) из правого желудочка в шприц.
- Зажим хвостового полая вена с кровоостанавливающего как можно ближе к сердцу, чтобы включить сбор перфузату.
- Вытащите кишечник и место за пределами животного на право экспериментатора, чтобы выставить воротной вены.
- Вставьте катетер 25 G IV, соединенный с перистальтическим насосом, в воротную вену, а каудально, насколько это возможно,но ростральной к селезеночной вены.
- Вставьте 25 G бабочки иглу, соединенную с 5 мл шприц, в нижней полой вене, каудально по отношению к кровоостанавливающего.
- Включите шланговый насос со скоростью около 3 мл / мин и осторожно собирают первые мл перфузата, загрязненных кровью в шприц. Продолжайте, пока перфузат цвет не бледнеет красный (примерно 3-5 мл). Обратите внимание на то, что цвет печени изменяется в сторону светло-коричневого.
- Без остановки перистальтический насос, замените 5 мл уборочное шприц с 20 мл шприц и уборки урожая собирают по меньшей мере 20 мл перфузата печени с использованием более высокую скорость перфузии (до 4 мл / мин). Постоянно контролировать поток перфузату в сборном шприца, и избежать вакуума, который является слишком сильным (который может засорить иглу через схлопывания кава стены).
- Terminate перфузию, когда цвет печени превращается в светло-коричневый.
- Лейкоциты Добыча
- Центрифуга перфузата в течение 10 мин при 400 х г, 24 ° С.
- Аспирируйте супернатант
- Добавляют 10 мл PBS, центрифугируют при 400 х г в течение 10 мин, и аспирата супернатант. Исходя из целей исследования, использовать препарат , как есть, или провести дополнительные очисток (например, плотность градиента разделения).
- В частности, слой 4 мл перфузату более 4 мл градиента плотности массы разделения в 50 см полипропиленовую центрифужную пробирку. Спин трубы на 754 XG, RT, в течение 30 мин с обламываются.
- Получение мононуклеарных слоев на градиенте плотности разделения-надосадочную интерфейс с помощью ручного пипеткой, умойся в PBS, и вставьте в 5 мл пробирку.
2. Протокол Mouse
- Препараты
- Готовят раствор гепаринизированной PBS (30 ед / мл), который будет использоваться при комнатной температуре (RT) путем добавления 30 единиц консервантов гепарина на мл фосфатно-солевого буфера (PBS) 1x SOLUTIOп. Рассчитать 20 мл на одно животное.
- Pass гепарином PBS через шланговые линии насоса и иглы бабочки, чтобы устранить пузырьки воздуха.
- Стерилизовать хирургических инструментов - 2 пары ножниц, притупляются обрезные пинцет, 2 кровоостанавливающих и пинцет зубной ткани (автоклаве при температуре 121 ° С в течение по крайней мере 30 мин на тяжести (сухой) настройки).
- Кровоснабжение печени и коллекции MH-Лейкоциты
- Усыпить животное передозировкой 8% изофлуран. В качестве меры предосторожности, поместите 15 мл пробирку, содержащую изофлуран пропитанной площадку вокруг головы мыши до открытия его грудной полости.
- Закрепить конечности мыши к кровати.
- Откройте брюшины и грудной полости, чтобы обнажить печень и сердечно-легочной комплекс сразу же после прекращения дыхания, сохраняя нижнюю сторону диафрагмы нетронутыми (для создания сливная грудной полости бассейн). Избегайте кровотечения через этот процесс.
- В частности, начать разрез на нижнембрюшная точка средней линии, без повреждения внутренних органов, а также прогресс в обе стороны по диагонали по направлению к ребрам, прорезая их на верхние уровни грудной полости.
- Выдвижная кишечник и место за пределами животного на право экспериментатора, чтобы выставить воротной вены.
- Вставка 30 г иглу, соединенную с перистальтического насоса в воротную вену ростральнее селезеночной вены.
- Обрежьте нижнюю полую вену выше диафрагмы, чтобы обеспечить дренаж и сбор перфузату из полости грудной клетки.
- Включите шланговый насос со скоростью около 3 мл / мин и осторожно собирают первые 3 мл перфузата, загрязненных кровью из бассейна грудной полости.
- Сбросьте эту перфузат. Повторите такую промывку снова, если это необходимо, с помощью солевого раствора, и только после этого начать собирать перфузат печени.
- Повторно начать перфузию со скоростью до 4 мл / мин, и собирают 10 мл перфузату из грудной полости с использованиембабочка подключается к шприцу.
- Terminate перфузию, когда цвет печени превращается в светло-коричневый.
- Лейкоциты Добыча
- Центрифуга Перфузат в течение 10 мин при 400 х г.
- Аспирируйте супернатант.
- Добавьте 10 мл PBS, центрифуге при 400 мкг в течение 10 мин, и аспирата супернатант на основе целей исследования, использовать препарат , как есть, или провести дополнительные очисток (например, плотность градиента разделения).
- В частности, слой каждые 4 мл перфузату более 4 мл градиента плотности массы разделения в 50 см полипропиленовую центрифужную пробирку. Спин трубы на 754 XG, RT, в течение 30 мин с обламываются.
- Получение мононуклеарных слоев на градиенте плотности разделения-надосадочную интерфейс с помощью ручного пипеткой, умойся в PBS, и вставьте в 5 мл пробирку.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
У крыс F344 мы сравнили цитотоксичность клеток NK-MH (полученная от синусоиды печени путем принудительного перфузии печени) к цитотоксичности всей популяции клеток печени при механическом измельчении ткани печени, а также к цитотоксичности циркулирующих лейкоцитов. Все препараты клеток промывают по меньшей мере, в 3 раза, а рутина в иммунологических анализах, а также в качестве целевых клеточных линий мы использовали аллогенной YAC-1 или сингенных линии целевых клеток MADB106. Как показа...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Метод перфузии печени, представленные здесь позволяет выборочный сбор урожая и изучение уникальной популяции marginating печени лейкоциты. Печени NK - клетки, также называемые ямы клетки 3, составляют отличительную популяцию NK клеток , которые находятся в печеночных синусоидов. Они встречаются у крыс, мышей 17 и у людей 18,19. По сравнению с изолированными клетками периферической NK, Колодец клетки продемонстрировали более высокую цитотоксичность против YAC-1 и CC531s мишень клеточных л...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Авторы и эта работа были поддержаны грантом NIH/NCI # R01CA172138 (SBE).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Autoclud Перистальтический насос | |||
| Игла бабочка | OMG | 26 G | |
| Игла бабочка | OMG | 21 G*3/4" | |
| Шприц | Pic раствор | 1 мл | |
| Шприц | Pic раствор | 2,5 мл | |
| Шприц | Pic раствор | 5 мл | |
| Шприц | Pic solution | 10 мл | |
| Шприц | Pic solution | 25 мл | |
| тупыми краями | |||
| Ножницы | |||
| гемостат | |||
| Тканевые щипцы | |||
| 22 Вт Люминесцентная лампа |
Ссылки
- Melamed, R., et al. The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells. J Immunother. 33, 16-29 (2010).
- Benish, M., Melamed, R., Rosenne, E., Neeman, E., Sorski, L., Levi, B., Shaashua, L., Matzner, M., Ben-Eliyahu, S. The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics. Immunologic Research. 58, 28-39 (2014).
- Wisse, E., van't Noordende, J. M., van der Meulen, J., Daems, W. T. The pit cell: description of a new type of cell occurring in rat liver sinusoids and peripheral blood. Cell Tissue Res. 173, 423-435 (1976).
- Vermijlen, D., et al. Hepatic natural killer cells exclusively kill splenic/blood natural killer-resistant tumor cells by the perforin/granzyme pathway. J Leukoc Biol. 72, 668-676 (2002).
- Gao, B., Radaeva, S., Park, O. Liver natural killer and natural killer T cells: immunobiology and emerging roles in liver diseases. J Leukoc Biol. 86, 513-528 (2009).
- Kaneda, K. Liver-associated large granular lymphocytes: morphological and functional aspects. Arch Histol Cytol. 52, 447-459 (1989).
- Podack, E. R., Hengartner, H., Lichtenheld, M. G. A central role of perforin in cytolysis? Annu Rev Immunol. 9, 129-157 (1991).
- Kamada, M. M., et al. Identification of carboxypeptidase and tryptic esterase activities that are complexed to proteoglycans in the secretory granules of human cloned natural killer cells. J Immunol. 142, 609-615 (1989).
- Wisse, E., et al. On the function of pit cells, the liver-specific natural killer cells. Semin Liver Dis. 17, 265-286 (1997).
- Bouwens, L., Remels, L., Baekeland, M., Van Bossuyt, H., Wisse, E. Large granular lymphocytes or "pit cells" from rat liver: isolation, ultrastructural characterization and natural killer activity. Eur J Immunol. 17, 37-42 (1987).
- Vanderkerken, K., et al. Origin and differentiation of hepatic natural killer cells (pit cells). Hepatology. 18, 919-925 (1993).
- Luo, D., et al. The role of adhesion molecules in the recruitment of hepatic natural killer cells (pit cells) in rat liver. Hepatology. 24, 1475-1480 (1996).
- Shresta, S., MacIvor, D. M., Heusel, J. W., Russell, J. H., Ley, T. J. Natural killer and lymphokine-activated killer cells require granzyme B for the rapid induction of apoptosis in susceptible target cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 5679-5683 (1995).
- Luo, D., et al. Involvement of LFA-1 in hepatic NK cell (pit cell)-mediated cytolysis and apoptosis of colon carcinoma cells. J Hepatol. 31, 110-116 (1999).
- Wiltrout, R. H., et al. Augmentation of mouse liver-associated natural killer activity by biologic response modifiers occurs largely via rapid recruitment of large granular lymphocytes from the bone marrow. J Immunol. 143, 372-378 (1989).
- Schluter, K., et al. Organ-specific metastatic tumor cell adhesion and extravasation of colon carcinoma cells with different metastatic potential. Am J Pathol. 169, 1064-1073 (2006).
- Wiltrout, R. H., et al. Augmentation of organ-associated natural killer activity by biological response modifiers. Isolation and characterization of large granular lymphocytes from the liver. J Exp Med. 160, 1431-1449 (1984).
- Winnock, M., et al. Functional characterization of liver-associated lymphocytes in patients with liver metastasis. Gastroenterology. 105, 1152-1158 (1993).
- Hata, K., et al. Isolation, phenotyping, and functional analysis of lymphocytes from human liver. Clin Immunol Immunopathol. 56, 401-419 (1990).
- Vanderkerken, K., Bouwens, L., Wisse, E. Characterization of a phenotypically and functionally distinct subset of large granular lymphocytes (pit cells) in rat liver sinusoids. Hepatology. 12, 70-75 (1990).
- Sorski, L., Melamed, R., Lavon, H., Matzner, P., Rosenne, E., Ben-Eliyahu, S. PNIRS Annual Scientific meeting, Seattle, , (2015).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
