Методическая статья

Идентификация MyoD интерактомные Использование Тандем Аффинная очистка В сочетании с масс-спектрометрии

DOI:

10.3791/53924

⸱

17 мая 2016 г.

 ,  ,  ,  , 
1Epigenetics and Cell Fate, UMR 7216 CNRS, Centre National de la Recherche Scientifique CNRS - Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MyoD является миогенным транскрипционным фактором, обладающим сильной способностью индуцировать миогенную трансдифференцировку многих полностью дифференцированных немышечных клеточных линий. Эпигенетические механизмы, участвующие в этой трансдифференцировке, в значительной степени неизвестны. Здесь мы опишем метод двухаффинной очистки с последующей масс-спектрометрией для исчерпывающей характеристики партнеров MyoD.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Скелетная мышца терминальная дифференцировка начинается с обязательством плюрипотентных клеток-предшественников мезодермальными к миобластов. Эти клетки имеют еще способность пролиферировать или они могут дифференцироваться и запал в многоядерные мышечные трубки, которые нагноиться далее с образованием мышечные волокна. Скелетных мышц терминала дифференциация оркестрованы скоординированные действия различных факторов транскрипции, в частности, члены мышце регуляторных факторов или MRFs (MyoD, Myogenin, Myf5 и Mrf4), которая также называется миогенная bHLH факторов транскрипции семейства. Эти факторы сотрудничают с хроматином ремоделирования комплексов в сложной транскрипционной регуляторной сети для достижения скелетной миогенез. В этом, MyoD считается мастером миогенная фактор транскрипции в инициировании мышцы терминальной дифференцировки. Это понятие усиливается благодаря способности MyoD конвертировать не-мышечные клетки в клетках скелетных мышц. Здесь мы опишем подход, используемый для идентификации MyoDпартнеров белка исчерпывающим образом для того, чтобы выяснить различные факторы, участвующие в скелетных мышц терминальной дифференцировки. Долгосрочная цель состоит в том, чтобы понять эпигенетические механизмы , участвующие в регуляции генов скелетных мышц, то есть., MyoD целей. партнеры MyoD идентифицированы с помощью Тандем аффинной очистки (TAP-Tag) с гетерологичным системы, связанной с масс-спектрометрии (МС) характеристики, а затем путем подтверждения роли соответствующих партнеров во время скелетных мышц терминальной дифференцировки. Аберрантных форм миогенных факторов, или их аномальным регулирования, связаны с целым рядом мышечных нарушений: врожденная миастения, миотонической дистрофии, рабдомиосаркома и дефектов в мышечной регенерации. Таким образом, миогенные факторы обеспечивают пул потенциальных терапевтических мишеней в мышечных расстройств, как с точки зрения механизмов, которые вызывают самой болезни и регенеративные механизмы, которые могут повысить эффективность лечения заболевания. Таким образом, детальное understanдинь межмолекулярных взаимодействий и генетических программ, контролируемых миогенных факторов имеет важное значение для рациональной разработки эффективных методов лечения.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эукариотические многоклеточные организмы состоят из различных органов и тканей. Каждая функциональная ткань имеет специфический экспрессии генов, которая определяется на каждом этапе дифференцировки. Клеточная дифференцировка включает в себя активацию специфических генов, поддержание их экспрессии и, как правило, глушителей из набора генов, таких лиц, участвующих в пролиферации клеток. Скелетная дифференцировки мышц, или миогенез, таким образом, является многоступенчатый процесс, который начинается с определения мезодермальных стволовых клеток в миобласты, а затем приводит к терминальной дифференцировки этих миобластов в первую моно-зарождаются, а затем мульти-зарождаются, мышечных трубочек , Таким образом, миобласты являются "определены" клетки, которые все еще способны размножаться, но они полны решимости скелетных мышц линии, и, следовательно, могут дифференцироваться только в клетках скелетных мышц либо во время эмбрионального развития или в регенерации взрослых мышц. Процесс скелетных мышц терминала отличаютсяentiation является оркестровка определенной генетической программой , которая начинается с постоянного выхода из клеточного цикла клеток - предшественников миобластов , что приводит к окончательному глушителей пролиферации генов , ассоциированных, таких как E2F генов - мишеней 1. Действительно, в процессе терминальной дифференцировки, арест пролиферации миобластов является важным шагом , который предшествует экспрессии скелетных мышц специфических генов и слияние миобластов в мышечные трубки 2. Такая программа позволяет взрослых мышечные стволовые клетки, также называемые сателлитные клетки, дифференцироваться во время процесса регенерации после поврежденными скелетными мышцами.

Млекопитающим миогенез критически зависит от семьи миогенного основной спираль-петля-спираль (bHLH) транскрипционные факторы MyoD, Myf5, Mrf4 и Myogenin, часто называют семейством скелетных мышц факторов определения или MRFs (мышцы регуляторные факторы) 3. Каждый из них играет существенную роль в спецификации и дифференциации скелетных мышечных клеток и имеет специфический характер экспрессии 4 5-7. Активация Myf5 и MyoD представляет собой определяющий шаг, обязывающее клетки к миогенной линии, и последующее выражение Myogenin вызывает миогенез с активацией скелетных мышц специфических генов, таких как ГХК (Muscle креатинкиназы). Миогенные bHLH факторы транскрипции сотрудничать с членами семьи Mef2 в активации генов мышечных от ранее немого локусов 8. Они также стимулируют скелетную транскрипцию гена мышечной как гетеродимеры с повсеместным bHLH белками, Е12 и Е47, известные как Е белки, которые связываются с так называемыми электронные ящики в различных генных регуляторных областей 8. Twist, Id (ингибитор дифференцировки) и других факторов , отрицательно регулируют этот процесс, конкурируя с MyoD для Е - связывающих белков 8.

MyoD рассматривается как главный игрок в инициировании терминальной дифференцировки мышц 9 , так как он обладает способностью индуцировать программу (транс-дифференциации) миогенная определения / дифференциации во многих полностью дифференцированных систем немышечных 10-13. Действительно, принудительная экспрессия MyoD индуцирует транс-дифференциацию различных клеточных типов , даже те , которые получены из другого эмбриологического происхождения 12. Например, MyoD может конвертировать гепатоциты, фибробласты, меланоциты, нейробласты и адипоциты в мышечные клетки типа. Транс-differentiative действие MyoD включает аномальную активацию миогенный генетической программы (в частности, его генов-мишеней) в не-мышечной среде, сопутствующую к молчанию оригинальной генетической программы (в частности, гены пролиферации).

В пролиферирующих миобластов, MyoD выражается , но не может активировать свои гены - мишени , даже если он связывается с их промоторов 14-16. Таким образом, требование MyoD быть постоянно выражается в недифференцированных миобластов остается довольно EluSIVE. MyoD может подавлять свои гены - мишени из - за набора репрессивных хроматин-модифицирующими ферментов в пролиферирующих миобластов перед загрузкой активации хроматина ферментов 14,17. Например, в пролиферирующих миобластов, MyoD связан с транскрипционной корепрессор KAP-1, гистондезацетилаз (HDACs) и репрессивных метилтрансферазам лизина (КМЦ), в том числе гистона Н3 лизина 9 или H3K9 и H3K27 КМЦ, а также активно подавлять его экспрессию генов-мишеней путем создания локально репрессивной структуры хроматина 14,17. Важно отметить, что в недавнем докладе указывается , что MyoD сама непосредственно метилируется самая H3K9 КМТ G9a приводит к торможению его трансактивирующей деятельности 16.

В эпигенетические механизмы, участвующие в этом транс-дифференциации без мышечных клеток путем MyoD в значительной степени неизвестны. Следует отметить, что некоторые клеточные линии, устойчивые к MyoD-индуцированный транс-дифференцировки. Таким образом, в клетках HeLa, MyoD либо неактивны илидаже может функционировать как репрессор вместо активатора транскрипции из - за отсутствия экспрессии BAF60C субъединицы хроматина комплекс SWI / SNF 18. Таким образом, эта модель может быть выбор, чтобы лучше охарактеризовать механизмы MyoD-индуцированной репрессии генов. Он также подходит для анализа способности MyoD вызывать репрессивную среду хроматина на своей целевой локусов со своими ассоциированными партнерами и , следовательно , раскрыть репрессивные механизмы MyoD-зависимых в пролиферирующих миобластов для тонкой настройки терминальной дифференцировки.

Здесь мы опишем протокол для идентификации партнеров MyoD с помощью Тандем аффинной очистки (TAP-Tag) в сочетании с масс-спектрометрии (МС) характеристики. Использование клеток HeLa-S3, стабильно экспрессирующих Flag-HA-MyoD допускается, чтобы получить достаточное количество материала для очистки MyoD комплексов из фракционированного ядерных экстрактов. Идентификация партнеров MyoD в гетерологичной системе последовали validatiна в соответствующей системе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Получение HeLa-S3 Ядерный Соль-извлекаемых и хроматина связанных фракций

  1. Сбор клеток
    1. Расти HeLa-S3 Flag-HA-MyoD и HeLa-S3 Flag-HA (клеточная линия управления) в Дульбекко модифицированной Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка, 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина (рост среда) при температуре 37 ° с и 5% СО 2 во влажном инкубаторе.
      Примечание: HeLa-S3 клетки , стабильно экспрессирующие Flag-HA-MyoD и HeLa-S3 клетки трансдуцированных с пустым вектором (HeLa-S3 Flag-HA) может быть либо с использованием протокола , описанного в: 19,20, или предоставленных авторами.
    2. Amplify клетки до 10 полностью сливающихся 150 мм блюд каждой клеточной линии (HeLa-S3 Flag-HA-MyoD и HeLa-S3 Flag-HA клетки).
    3. Соберите супернатант (содержат не прилегающего субпопуляции) в 5 л блесны.
    4. Вымойте прилипшие субпопуляции с 10 мл PBS на 150 мм блюдо, Trypsinize клетки в течение 1 мин при комнатной ТЭМратура (0,05% раствор трипсина-ЭДТА, 2 мл в течение 15 см чашку).
    5. Добавляют 4 мл среды на 150 мм чашку и сбора клеток в 50 мл пробирки.
    6. Смешайте супернатант от стадии 1.1.3 (в 5 л) и обтекатель втулки клеток из стадии 1.1.5, добавляют 500 мл свежего подогретого ростовой среды для каждой клеточной линии.
    7. Передача клеточной суспензии в 5 л обтекателя втулки и роста клеток в течение по крайней мере 60 часов при температуре 37 ° С и 5% CO 2 во влажном инкубаторе.
    8. Добавить 500 мл свежей среды для роста и роста клеток в течение 24 часов.
    9. Добавить 1 л свежей среды для роста и роста клеток в течение 24 часов.
    10. Возьмите 1 мл клеточной суспензии для подсчета клеток и проверить жизнеспособность клеток. Цвет 30 мкл клеточной суспензии с 30 мкл 0,4% трипанового синего и сосчитать живых (не синий) клеток под микроскопом с использованием гемоцитометра.
    11. Держите плотность клеток в 2 - 6 × 10 5 клеток / мл добавлением свежей среды роста ежедневно; не превышает 1 × 10 6 клеток / мл. Максимумобъем для одного 5 л блесны 2,5 Л.
      Примечание: Для следующих шагов, необходимо выполнить партиями по 2 - 2,5 л культуры при плотности 1 × 10 6 клеток / мл. Повторите шаги 1.1.12 - 1.1.14 собрать около 20 л (≈ 20 г сухой гранулы) из каждой клеточной линии, прежде чем перейти к следующему шагу.
    12. Гранул клетки центрифугированием при 500 мкг в течение 5 мин при 4 ° С и отбросить супернатант.
    13. Ресуспендируют клеток в 100 мл охлажденного льдом PBS пипетированием и центрифуге при 500 мкг в течение 5 мин при 4 ° C, чтобы промыть осадок.
    14. Повторите Мытье ресуспендирования клеток с 25 мл охлажденного на льду PBS, перенос суспензии в 50 мл пробирку и центрифугировали при 500g в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
      Примечание: Клеточные гранулы могут быть либо использованы немедленно, или замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° С в течение нескольких дней.
  2. Выделение ядер
    Примечание: Выполните шаги 1.2.1 - 1.4.3 в холодном помещении.
    1. Pre-чилл BuffeRS и гомогенизаторы.
    2. При использовании замороженного материала, быстро оттаивают гранул клеток в водяной бане при 37 ° С.
    3. Ресуспендируют 20 г (≈ 20 мл) клеток в 20 мл (объем , равный размеру клеточного осадка) гипотонического буфера А (таблица 3) , с использованием 10 мл буфера сначала, а затем добавляя по 5 мл, а затем добавить еще 5 мл. Вымойте хорошо пипеток со свежим буфером, чтобы получить максимум клеток.
    4. Передача клеточной суспензии 40 мл в предварительно охлажденный гомогенизатор с плотно закрывающейся пестик.
    5. Однородный клетки с 20 ударами в гомогенизаторе (20 в и движений) и переносят клеточную суспензию в 50 мл пробирку.
    6. Промыть гомогенизатора 7 мл буфера сахарозы (1/3 первоначального объема клеток, таблица 3) , чтобы восстановить максимум клеток. Перенесите эту суспензию быстро в 50 мл трубки с шага 1.2.5 для сохранения ядра и ограничить утечку.
    7. Пятно 30 мкл аликвоты с 30 мкл 0,4% трypan синий, анализируют под микроскопом, чтобы контролировать эффективность лизиса (если лизис прошло успешно, все ядра должны быть синим). При необходимости повторите шаг гомогенизации.
    8. Центрифуга в течение 7 мин при 10000 х г и 4 ° С для осаждения ядра. Сохраните супернатант в качестве цитоплазматической фракции.
  3. Получение ядерной Соль-извлекаемого (SE) Фракция
    1. Ресуспендируют Ядра гранул в 8 мл буферного раствора сахарозы (объем, равный объему с размером ядра гранулы). Добавить по каплям при перемешивании тщательно на вихре 8 мл солевого буфера с высоким (1 ядер объема гранул, таблица 3) , чтобы получить конечную концентрацию 300 мМ NaCl. Инкубировать в течение 30 мин на льду и перемешивают каждые 5 мин.
    2. Снижение концентрации NaCl до 150 мМ добавлением 8 мл (1/3 от общего объема) буфера сахарозы. Центрифуга в течение 10 мин при 13000 х г и 4 ° С. Соберите супернатант (ядерная соль фракциюэкстрагированую, SE).
      Примечание: Либо перейдите к шагу 1.3.3 или оставить SEдоля на льду во время подготовки хроматина связанной фракции, а затем ультра-центрифугу обе фракции одновременно.
    3. Ультра-центрифуга SE в течение 30 мин при 85000 х г при 4 ° С. Возьмем супернатант (≈ 26 мл).
    4. Замораживание 100 мкл аликвоты в жидком азоте. Перейдите к шагу 2 "белковый комплекс очистки", используя остальную часть экстракта.
      Примечание: аликвоты должна использоваться в качестве элемента управления вводом во время этапа 5.1.1.
  4. Получение хроматина-связанной фракции
    1. Ресуспендируют осадок (со стадии 1.3.5.) Тщательно в 7 мл (объем, равный размеру гранул) буфера сахарозы.
    2. Добавить CaCl 2 до конечной концентрации 1 мМ (28 мкл 0,5 М CaCl 2 на 14 мл суспензии) , чтобы активировать MNase (этап 1.4.4) и перемешать.
    3. Предварительно подогревают суспензию в течение 1 мин при температуре 37 ° С.
    4. Добавить 70 мкл микрококковую нуклеазы (MNase), чтобы получить конечную концентрацию 0,0025 ед / мкл (1/200 разбавления от 0,5U / мкл акций) и перемешать.
    5. Инкубировать ровно 12 минут при 37 ° C. Смешайте каждые 4 мин.
    6. Сразу же место реакция на льду.
    7. Чтобы остановить активность MNase, добавьте 112 мкл 0,5 М ЭДТА, рН 8,0 (1/125 разведение) до конечной концентрации 4 мМ. Инкубировать в течение 5 минут на льду.
    8. Разрушать ультразвуком 5 раз в течение 1 мин при высокой амплитуде, между двумя sonications позволяют сделать перерыв в 1 мин (10 мин в общей сложности).
    9. Ультрацентрифуга в течение 30 мин при 85000 х г и 4 ° С.
    10. Соберите супернатант (нуклеосома обогащенную фракцию, NE, ≈ 12 мл).
    11. Замораживание 50 мкл аликвоты в жидком азоте. Перейдите к шагу 2 "белковый комплекс очистки", используя остальную часть экстракта.
      Примечание: аликвоты должна использоваться в качестве элемента управления вводом во время этапа 5.1.1.

2. Белковые комплексы очистки

Примечание: Установка производится в параллельных выписок из каждой клеточной линии (HeLa-S3 Flag-HA-MyoD и контроля, HELA-S3 Флаг-HA).

  1. на основе Flag- Очистка
    1. Предварительная стирка Флаг смолы. Используйте 600 мкл флага смолы (от коммерческой 50% акций) для каждой экспериментальной точки (SE и NE фракций для каждой клеточной линии).
    2. Инжекцией смолы в 15 мл пробирку, ресуспендируют в 13 мл холодной TEGN (таблица 3), центрифуге в течение 2 мин при 1000 х г и удалить супернатант. Повторить 5 раз. После последней промывки ресуспендируют флага смолы в равном объеме TEGN (300 мкл для каждой экспериментальной точки).
    3. Для каждой экспериментальной точки, смешать 600 мкл промытой флага смолы и соответствующие белковые экстракты (в 15 мл пробирку для 12 мл NE и в 50 мл пробирку за доли по 26 мл SE, соответственно). Инкубируют на вращающемся колесе в течение ночи при температуре 4 ° С.
    4. Центрифуга в течение 2 мин при 1000 мкг при 4 ° С, отложить в сторону супернатант и хранить при температуре 4 ° С до результата проверки эффективности очистки (2.2).
    5. Для образцов SE, ресуспендируют Flag смолыв 4 мл TEGN и переноса в 15 мл пробирку. Повторите этот шаг 3 раза, каждый раз, когда перенос на той же 15 мл трубки, чтобы избежать потери бусинки. Центрифуга 2 мин при 1000 XG и 4 ° C и удалить супернатант.
    6. Мытье Флаг смолы 7 раз в 15 мл пробирку с использованием 13 мл TEGN и центрифугирование 2 мин при 1000 х г и 4 ° С.
    7. После последней промывки Ресуспендируют в 1 мл TEGN и передачи в 1,5 мл низкой связывании трубки. Центрифуга 2 мин при 1000 XG и 4 ° C и удалить супернатант.
    8. Ресуспендируют в 200 мкл раствора пептида Flag в дозе 4 мг / мл при рН 7,8 для каждой экспериментальной точки. Смешайте шарики и пептид. Добавьте 200 мкл буфера TEGN и инкубируют при 4 ° С в течение не менее 4 часов или в течение ночи для элюирования связанных белков.
    9. Центрифуга в течение 2 мин при 1000 х г при 4 ° С и переносят смолу и надосадочную жидкость (флаг элюат) в пустой ротационную колонку, помещенной в 2 мл пробирку.
    10. Центрифуга колонна, собрать левый над супернатанта в 2 мл пробирку.
    11. Собирают Flag смолы путем добавления TEGN буфера в колонну и перейти ко второму Флага элюции 200 мкл раствора пептида Flag (4 мг / мл) в течение ночи при температуре 4 ° С для каждой экспериментальной точки.
    12. Повторите шаги 2.1.9 - 2.1.10, чтобы собрать второй вымывание. Объединить первый и второй элюатов.
  2. Тест очистки Эффективность
    Примечание: Во время этапа 2.1.11 - 2.1.12, выполнить SDS-PAGE и окрашиванием серебром (2.2.1 - 2.2.2).
    1. Возьмите 15 мкл элюата, добавьте 5 мкл 4х буфера для загрузки и 2 мкл 10х восстановителем, кипятят в течение 5 мин при 96 ° С и запустить SDS-полиакриламидном 4 - 12% геля в соответствии с инструкциями изготовителя.
    2. Пятно гель с использованием серебра набора для окрашивания (следуйте инструкциям производителя). Если есть четкие различия в структуре белка между Flag-HA-MyoD и Flag-HA имитировали элюатов, в частности полоса флага-HA MyoD (около 50 кДа, Рисунок 1А), переходите к следующему STEп.
  3. Гемагглютинина () Очистка основанное
    1. Мытье ХА смолы путем переноса в 15 мл пробирку, ресуспендирования в 13 мл TEGN и центрифугирование 2 мин при 1000 х г при температуре 4 ° С. Повторите этап промывки 5 раз. После последней промывки Ресуспендируют бисером в равном объеме буфера TEGN.
      Примечание: Объем должен быть отрегулирован в соответствии с эффективностью очистки флага на основе. Начните с 300 мкл с коммерческой 50% акций для каждой экспериментальной точки.
    2. Передача HA смолы для каждой экспериментальной точки в 1,5 мл низкой связывающей трубки. Центрифуга 2 мин при 1000 х г при 4 ° С, устранить максимум промывочного буфера (таблица 3) и добавьте элюатов от очистки флага , основанного на смоле HA.
    3. Инкубируйте пробирки на вращающемся колесе в течение ночи при температуре 4 ° С.
    4. Центрифуга в течение 2 мин при 1000 х г при 4 ° С, отложить в сторону супернатант и хранить при температуре 4 ° С до тех пор, в результате испытаний на эффективность очистки (2.3.12.).
    5. реприостановить смолы HA в 0,5 мл TEGN, переход к новой низким связыванием 1,5 мл трубки. Повторите взмучивания один раз при добавлении к тому же 1,5 мл трубки, чтобы избежать потери бусинки и центрифугировать 2 мин при 1000 х г и 4 ° С. Удалить супернатант.
    6. Промыть бусин в 8 раз с помощью 1 мл TEGN каждый раз, центрифугирование 2 мин при 1000 х г и 4 ° C и удалением надосадочной жидкости (во избежание потери бусинки). После последней промывки передать бусинки в 0,5 мл пробирки.
    7. Удалить столько супернатант, насколько это возможно. Добавьте 100 мкл HA свободного пептида раствора (4 мг / мл) при рН 7,8 на шариках для элюирования связанных белков. Инкубируют на вращающемся колесе в течение ночи при температуре 4 ° С.
      Примечание: Количество HA-пептида должна быть скорректирована в зависимости от обилия комплексов.
    8. Центрифуга в течение 2 мин при 1000 х г при 4 ° С и переносят смолу и надосадочную жидкость (HA) элюата в пустой ротационную колонку, помещенной в 2 мл пробирку.
    9. Центрифуга колонку, чтобы собрать использованную в течение супернатанта в 2 мл пробирку.
    10. Провести вторую элюции 100 мкл HA пептида (4 мг / мл) для каждой экспериментальной точки. Инкубируют на вращающемся колесе в течение ночи при температуре 4 ° С. Повторите шаг 2.3.8 - 2.3.9, чтобы собрать второй вымывание.
    11. Объединить первый и второй элюатов.
    12. Испытание эффективности очистки с помощью SDS-PAGE и окрашиванием серебром (см шаги 2.2.) (Фигура 1А).
    13. Концентрат элюата HA 30 мкл с использованием центробежных фильтров с 10 кДа светотеневой (номинальный предел молекулярной массы NMWL) в соответствии с инструкциями изготовителя.
    14. Разделить концентрированные образцы на две части: 22,5 (3/4) и 7,5 (1/4) мкл. Привязка замерзнуть 1/4 образцов в жидком азоте и хранят при -80 ° С. Используйте 3/4 часть для шага 3.
      Примечание: 1/4 замороженный часть должна быть использована для подтверждения результатов массовых спектрометрических Вестерн-блот (этап 5.1).

Анализ 3. Масс-спектрометрия

Примечание: Следующие шаги должны быть обсуждены с установкой масс - спектрометрии , который будет выполнять анализ.

  1. Дополнение 3/4 (22,5 мкл) образцов с 7,5 мкл 4х буфера для загрузки и 3,3 мкл 10-кратного восстановителем и кипятят в течение 5 мин при температуре 96 ° С.
  2. Образцы нагрузка на SDS-полиакриламидном 4 с - 12% геля. Гель-при 150 В постоянной в течение 5 мин, чтобы позволить всем белкам проникать в гель без разделения.
  3. Вымойте гель с водой; зафиксировать в течение 20 - 30 мин с Фиксирующий раствор (10% -ной уксусной кислоты, 50% метанола, 40% ультра-чистая вода), а затем промыть Фиксированный гель 5 раз в ультра-чистой воды.
  4. Нарезать кольцами, содержащими белки, хранить в 1 мл воды в 1,5 мл пробирку и отправить в масс-спектрометрического объекта.

Анализ 4. Данные

Примечание: Это общее руководство для анализа. Точные шаги будут зависеть от конкретного режима данных , данных MS объектаиспользуется для выполнения анализа (например, 21,22).

  1. Сравните список идентифицированных белков в "Myod" элюата со списком, полученным из соответствующего отрицательного контрольный препарат. Исключить из анализа белков, найденные в обоих списках.
  2. Удалить белки, которые имеют ≤2 общее количество идентифицированных пептидов из оставшегося списка.
  3. Доступ к функциональным аннотаций и функциональной классификации полученного списка белков с использованием DAVID биоинформатики ресурсов (http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) и классифицировать список белков 23,24.
  4. (Необязательно) Удалить из списка "автостопщиков", заряженные неядерные белки с сильным придаточные связывания с отрицательно заряженными ДНК 25. Они содержат цитоскелета, цитоплазмы, митохондрий, мембран и рецепторных белков (сворачивания белка, цитоскелета и белки группы Разное в таблицах 1 и 2).
  5. Сравните полученные списки MyoD interactors от SE и NE фракций , чтобы определить общие белки и белки , специфичные для каждой фракции (рисунок 2).

5. Подтверждение опознанных Interactors Вестерн-блот

  1. Подтверждение в HeLa-S3 Flag-HA-MyoD и HeLa-S3 Flag-HA
    1. Оттепель элюата образцов, полученных на стадии 2.3.14 (7,5 мкл) на льду. Добавьте 12 мкл буфера TEGN 10 мкл 4х буфера для загрузки и 3 мкл 10х восстановителем. Образцы кипятят в течение 5 мин при 96 ° С.
    2. Подготовка входных выборок для вестерн-блоттинга.
      1. Оттепель аликвот от шагов 1.3.9 и 1.4.11 и измеряют концентрацию белка, например, с использованием BCA набора (следуйте инструкциям производителя).
      2. С помощью 15 мкг белка на дорожку. Мера соответствующее количество экстракта и регулировать объем образца до 15 мкл с помощью буфера TEGN.
      3. Добавьте 5 мкл буфера 4x и загрузки1,5 мкл 10х восстановителя. Образцы кипятят в течение 5 мин при 96 ° С.
    3. Выполните Вестерн-блоттинга с антителами интереса (специфических для кандидата партнера, выявленных в ходе анализа MS) с использованием 15 мкл элюата образцов. Использование входных экстрактов в качестве контроля эндогенных уровней белка (фиг.3А).
  2. Подтверждение в соответствующей сотовой системы
    1. Получение полного ядерного экстракта С2С12 миобластов мыши.
      1. Grow С2С12 миобластов мыши в DMEM среде , содержащей 15% фетальной сыворотки теленка, 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина при 37 ° С и 5% CO 2 во влажном инкубаторе. Никогда не превышать 80% слияния клеток для поддержания клеток в пролиферативной состоянии.
      2. Grow по крайней мере, два 150 мм блюда С2С12 для одной точки (одно антитело) иммунопреципитации (IP). Аспирируйте среды, промыть клетки дважды с 10 мл PBS.
      3. Скрип клетки и собирают в 15 мл пробирку. Centrifuge при 250 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Удалите супернатант.
      4. Расчетный объем клеточного осадка (= V клетки). Аккуратно ресуспендируют осадок в 3 объемах V ячейки гипотонического буфера B для разрушения цитоплазматической мембраны (таблица 3).
      5. Добавить объем V клеток 0,44 х 10% NP-40 , чтобы достичь конечной концентрации 1% (об / об). Аккуратно переверните трубку несколько раз перемешать.
      6. Добавить объем V клеток 0,89 х SR (таблица 3) , чтобы сохранить целостность ядер. Осторожно Переверните пробирку несколько раз, чтобы гомогенизировать суспензии и центрифуги в течение 5 мин при 2000 х г в гранулах ядра.
      7. Удалить супернатант (цитозольной фракции). Расчетный объем ядер гранул (= V КНУ). Ресуспендируют ядер гранул в одном объеме V пис буфера сахарозы.
      8. Добавить по каплям при перемешивании тщательно вихревым одну единицу объема V NUC высокой буферной соли , чтобы получить конечную концентрацию 300 мМNaCl, и инкубировали в течение 30 мин на льду. Смешайте каждые 5 мин.
      9. Добавьте один объем V NUC буфера сахарозы (для уменьшения концентрации NaCl до 150 мм) и CaCl 2 (конечная концентрация 1 мМ). Смешивание.
      10. Предварительно подогревают суспензию в течение 1 мин при температуре 37 ° С, добавить микрококковую нуклеазы, чтобы получить окончательное от концентрации 0,0025 ед / мкл (1/200 запаса 0,5 ед / мкл) из. Смешивание.
      11. Инкубировать ровно 12 минут при 37 ° C. Смешайте каждые 3 мин.
      12. Сразу же место реакция на льду и добавляют ЭДТА (конечная концентрация 4 мМ), чтобы остановить активность MNase. Инкубировать в течение 5 минут на льду.
      13. Разрушать ультразвуком в 5 раз в течение 0,5 мин каждый при высокой амплитуде. Между двумя sonications, позволяют сделать перерыв 0,5 мин (5 мин в общей сложности).
      14. Ультра-центрифуга в течение 30 мин при 85000 х г и 4 ° С. Соберите супернатант (всего ядерного экстракта).
      15. Измерение концентрации белка от общего ядерного экстракта, например, с использованием набора BCA (следуйте инструкциям изготовителя) и продолжить immediatEly к этапу 5.2.2.
    2. Иммунопреципитации (IP) эндогенного MyoD.
      1. Чтобы предварительно ясно, экстракты, моют 10 мкл белка G агарозных шариков для каждой точки IP.
        1. Перенесите необходимый объем белка G агарозном бусин в 1,5 мл пробирку, Ресуспендируют в 1,4 в мл холодной TEGN, центрифуге в течение 2 мин при 1800 х г и удалить супернатант. Повторите 3 раза.
      2. Смешать предварительно промытой белок G агарозном шарики с соответствующим объемом полного ядерного экстракта. С помощью 500 мкг общего белка от ядерного экстракта в точке IP.
      3. Инкубируют на вращающемся колесе при 4 ° С в течение 2 ч, чтобы получить предварительно очистить экстракты.
      4. Центрифуга в течение 5 мин при 1800 х г при 4 ° С. Держите супернатант.
      5. Смешайте 5 мкг MyoD Ab или 5 мкг кролика IgG с 500 мкг предварительно очистили общего количества ядерных экстрактов в 1,5 мл низких связывающих труб. Добавить TEGN буфера до 1 мл. Инкубируют на вращающемся колесе при 4 ° С в течение ночи.
        Примечание: Выполните пollowing шаги на этапе 5.2.2.3.
      6. Предварительная стирка 7,5 мкл белка A / G раствор в наличии бусинки на одну точку IP.
        1. Перенесите необходимый объем гранул, в 1,5 мл пробирку, ресуспендирования бусин в 1 мл TEGN и центрифуге при 1800 мкг при 4 ° С в течение 2 мин. Удалить супернатант. Повторите 3 раза.
      7. Ресуспендируют белка A / G бусин в 1,5 мл блокирующего раствора (таблица 3) и инкубировать на вращающемся колесе в течение ночи при 4 ° С.
      8. Центрифуга всего экстракты ядер, инкубированные с Abs (этап 5.2.2.5) при 16000 мкг в течение 10 мин при 4 ° С. Держите супернатант.
      9. Центрифуга блокировали белок A / G смолы (шаг 5.2.2.7) при 1800 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С. Удалите супернатант и ресуспендируют в 1 мл буфера TEGN. Повторная центрифуге при 1800 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С, чтобы промывать блокирующего буфера.
      10. Ресуспендируют блокировали белок A / G смолы в 1 мл TEGN буфера и аликвоты в новые пробирки с низким белком связывания с получением 7,5 мкл Блотрахнуться белок A / G смолы на одну точку IP. Центрифуга при 1800 х г при 4 ° С в течение 2 мин и удалить как можно больше супернатанта.
      11. Добавьте общие ядерные экстракты инкубировали с Абс (или контроль IgG) к A / G смолы. Смешать и инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре (RT) на вращающемся колесе.
      12. Центрифуга суспензии 1,800 XG при комнатной температуре в течение 2 мин. Удалите супернатант, ресуспендируют в 1 мл буфера для промывки и переноса суспензии в новые низким связыванием труб. Инкубируют при комнатной температуре на вращающемся колесе в течение 5 мин.
      13. Центрифуга подвески на 1,800 мкг при комнатной температуре в течение 2 мин, вновь суспендируют в 1 мл промывочного буфера и инкубируют при комнатной температуре на вращающемся колесе в течение 5 мин. Повторить 4 раза. Для последней передачи промывной к новой низкой связывающей трубки.
      14. Удалить максимум надосадочной жидкости. Добавить 7 мкл промывочного буфера, 7 мкл 4х буфера для загрузки и 3 мкл 10х восстанавливающего агента к гранулам, перемешать и кипятят в течение 5 мин при температуре 96 ° С.
      15. Выполните Вестерн-блоттинга с антителами Interest (специфичные для кандидата партнера для иммунной осажденного белка). С помощью 1% (5 мкг) входных экстрактов в качестве контроля эндогенных уровней белка (фигура 3В).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для того, чтобы понять регулирование MyoD деятельности, мы провели исчерпывающее характеристику Myod комплексов с использованием биохимического очистки, основанный на иммуноочистки двойной меченой форме MyoD с последующим масс-спектрометрии (МС). Применение клеточной линии HeLa-S3 экспрессии Flag-HA-меченый MyoD и управления клеточную линию, выражающую разрешений Flag-HA, чтобы получить достаточное количество материала, чтобы очистить MyoD комплекс, выполняя очистку двойного сродства Fla...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представленный метод позволяет исчерпывающую идентификацию партнеров фактора транскрипции, MyoD. Оно показало партнеров MyoD в гетерологичной системе, устойчивой к MyoD-индуцированной дифференцировки, а именно HeLa-S3 клетки. Таким образом, по определению, идентифицированные партнеры MyoD экспрессируются повсеместно. Они включают в себя общие и последовательности специфических факторов транскрипции, хроматин-модифицирующие ферменты, белки процессинга РНК, киназ (таблицы 1 и 2). Так как ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Работа в лаборатории Ait-Si-Ali была поддержана Association Française contre les Myopathies Téléthon (AFM-Téléthon); Национальный институт рака (INCa); Agence Nationale de la Recherche (ANR), Fondation Association pour la Recherche sur le Cancer (Fondation ARC); Groupement des Entreprises Françaises pour la Lutte contre le Cancer (GEFLUC); CNRS; Université Paris Diderot и проект «Кто я?» Лаборатория передового опыта #ANR-11-LABX-0071 финансируется правительством Франции в рамках программы «Инвестиции в будущее», реализуемой ANR в рамках гранта #ANR-11-IDEX-0005-01. EB был поддержан грантом INCa.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Cell lines
HeLa-S3ATCCCCL-2.2
C2C12ATCCCRL-1772
Equipment
SpinnerCorning778531
гомогенизатор:  Гомогенизатор Dounce Wheaton432-1273 и 432-1271
Перемешивающее устройство для спиннеровBellco778531
SonicatorDiagenodeUCD 200
ГемоцитометрMarienfeld Superior 640610
Пробирки с низким связываниемSorenson27210
Пустая спиновая колонкаBio-Rad7326204
<сильно>Реагенты
SDS-полиакриламид 4-12%  гельLife technologiesNP0336BOX
4x загрузочный буфер Life technologiesNP0007
10x восстановительLife technologiesNP0004
Набор для окрашивания серебраLife technologiesA8592
Центробежные фильтрующие блоки, 10KMilliporeUFC501024
Protein G Агарозные шарикиSigma-AldrichP4691
Protein A/G  СмолаThermo Scientific53132
Flag смола (гель анти-Флаг M2-агарозного сродства)Смола Sigma-AldrichA2220
HA (моноклональная анти-HA агароза)Sigma-AldrichA2095
MNазаSigma-AldrichN3755
Flag free пептид (DYKDDDDK)Ansynth Service BVCustom синтезРесуспендия до 4 мг/мл в 50 мМ Tris-HCl, pH 7,8
HA свободный пептид (YPYDVPDYA)Ansynth Service BVCustom synthesisРесуспендирование до 4 мг/мл в 50 мМ Tris-HCl, pH 7,8
Набор для анализа белка на основе бицинхониновой кислоты: набор BCAThermo Scientific23225
Ингибиторы протеазыSigma-AldrichS8830
Усиленная хемилюминесценция (ECL) на основе люминола HRP-субстрат Lifetechnologies34075
BSASigma-AldrichA9647
лосося (Дезоксирибонуклеиновая кислота натриевая соль из яичек лосося)Sigma-AldrichD1626
Спермина тетрагидрохлоридSigma-AldrichS1141
СпермидинSigma-AldrichS0266
ГлицеринSigma-AldrichG5516
PBSSigma-AldrichD8537
MOPS беговой буферLife technologiesNP0001
DMEM (высокий уровень глюкозы)Sigma-AldrichD0822Предварительный прогрев   при 37 ° C перед применением
Трипсин-ЭДТА (0,05% фенола красногоLife technologies25300-054
SerumGE healthcare life sciences PAA A15-102Каждая партия сыворотки должна быть сначала проверена на наличие клеток.
Пенициллин и стрептомицин Life technologies15140-122
Раствор трипана синего, 0,4%Life technologies15250-061
Вода (стерильно-фильтрованная)Sigma-AldrichW3500
антитела
HA от крысы (12CA5)Roche11583816001
FlagSigma-AldrichA8592
MyoDSanta Cruzsc-32758Для использования для вестерн-блоттинга
MyoDSanta CruzSC-760Для использования для иммунопреципитации и вестерн-блоттинга
CBFbetaSanta CruzFL-182 
HP1alphaEuromedex2HP2G9
HP1betaEuromedex1MOD1A9AS
HP1gammaEuromedex2MOD1GC
Suv39h1Технология клеточной сигнализации8729
BAF47BD Biosciences612111
Myf5Santa CruzSC-302
ТубулинSigma-AldrichT9026
ActinSigma-AldrichA5441
Мышь IgGSanta CruzSC-2025
Кролик IgGSanta CruzSC-2027
Козья антикрыса -HRPSigma-AldrichA9037
Козья анти-кролик -HRPSigma-AldrichA6154 
Козий антимышь -HRPSigma-AldrichA4416
ДНК спермы

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ait-Si-Ali, S., et al. A Suv39h-dependent mechanism for silencing S-phase genes in differentiating but not in cycling cells. Embo J. 23 (3), 605-615 (2004).
  2. Buckingham, M. Skeletal muscle development and the role of the myogenic regulatory factors. Biochem Soc Trans. 24 (2), 506-509 (1996).
  3. Arnold, H. H., Winter, B. Muscle differentiation: more complexity to the network of myogenic regulators. Curr Opin Genet Dev. 8 (5), 539-544 (1998).
  4. Buckingham, M. Skeletal muscle formation in vertebrates. Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 440-448 (2001).
  5. Yun, K., Wold, B. Skeletal muscle determination and differentiation: story of a core regulatory network and its context. Curr Opin Cell Biol. 8 (6), 877-889 (1996).
  6. Molkentin, J. D., Olson, E. N. Defining the regulatory networks for muscle development. Curr Opin Genet Dev. 6 (4), 445-453 (1996).
  7. Arnold, H. H., Braun, T. Targeted inactivation of myogenic factor genes reveals their role during mouse myogenesis: a review. Int J Dev Biol. 40 (1), 345-353 (1996).
  8. Puri, P. L., Sartorelli, V. Regulation of muscle regulatory factors by DNA-binding, interacting proteins, and post-transcriptional modifications. J Cell Physiol. 185 (2), 155-173 (2000).
  9. Tapscott, S. J. The circuitry of a master switch: Myod and the regulation of skeletal muscle gene transcription. Development. 132 (12), 2685-2695 (2005).
  10. Lassar, A. B., Paterson, B. M., Weintraub, H. Transfection of a DNA locus that mediates the conversion of 10T1/2 fibroblasts to myoblasts. Cell. 47 (5), 649-656 (1986).
  11. Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51, 987-1000 (1987).
  12. Tapscott, S. J., et al. MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts. Science. 242, 405-411 (1988).
  13. Weintraub, H., et al. Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (14), 5434-5438 (1989).
  14. Mal, A., Harter, M. L. MyoD is functionally linked to the silencing of a muscle-specific regulatory gene prior to skeletal myogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1735-1739 (2003).
  15. Ohkawa, Y., Marfella, C. G., Imbalzano, A. N. Skeletal muscle specification by myogenin and Mef2D via the SWI/SNF ATPase Brg1. Embo J. 25 (3), 490-501 (2006).
  16. Ling, B. M., et al. Lysine methyltransferase G9a methylates the transcription factor MyoD and regulates skeletal muscle differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (3), 841-846 (2012).
  17. Zhang, C. L., McKinsey, T. A., Olson, E. N. Association of class II histone deacetylases with heterochromatin protein 1: potential role for histone methylation in control of muscle differentiation. Mol Cell Biol. 22 (20), 7302-7312 (2002).
  18. Forcales, S. V., et al. Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex. The EMBO journal. 31 (2), 301-316 (2011).
  19. Nakatani, Y., Ogryzko, V. Immunoaffinity purification of mammalian protein complexes. Methods Enzymol. 370, 430-444 (2003).
  20. Ouararhni, K., et al. The histone variant mH2A1.1 interferes with transcription by down-regulating PARP-1 enzymatic activity. Genes Dev. 20 (23), 3324-3336 (2006).
  21. Fritsch, L., et al. A subset of the histone H3 lysine 9 methyltransferases Suv39h1, G9a, GLP, and SETDB1 participate in a multimeric complex. Mol Cell. 37 (1), 46-56 (2010).
  22. Robin, P., Fritsch, L., Philipot, O., Svinarchuk, F., Ait-Si-Ali, S. Post-translational modifications of histones H3 and H4 associated with the histone methyltransferases Suv39h1 and G9a. Genome Biol. 8 (12), R270(2007).
  23. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
  24. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).
  25. Ohta, S., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics. Cell. 142 (5), 810-821 (2010).
  26. Yahi, H., et al. Differential cooperation between heterochromatin protein HP1 isoforms and MyoD in myoblasts. J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).
  27. Philipot, O., et al. The core binding factor CBF negatively regulates skeletal muscle terminal differentiation. PloS one. 5 (2), (2010).
  28. Joliot, V., et al. The SWI/SNF subunit/tumor suppressor BAF47/INI1 is essential in cell cycle arrest upon skeletal muscle terminal differentiation. PloS one. 9 (10), e108858(2014).
  29. Tanese, N. Small-scale density gradient sedimentation to separate and analyze multiprotein complexes. Methods. 12 (3), 224-234 (1997).
  30. Singh, K., et al. A KAP1 phosphorylation switch controls MyoD function during skeletal muscle differentiation. Genes Dev. 29 (5), 513-525 (2015).
  31. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  32. Yahi, H., Philipot, O., Guasconi, V., Fritsch, L., Ait-Si-Ali, S. Chromatin modification and muscle differentiation. Expert Opin Ther Targets. 10 (6), 923-934 (2006).
  33. Sun, L., Liu, L., Yang, X. J., Wu, Z. Akt binds prohibitin 2 and relieves its repression of MyoD and muscle differentiation. J Cell Sci. 117. 117 (Pt 14), 3021-3029 (2004).
  34. Caretti, G., et al. The RNA helicases p68/p72 and the noncoding RNA SRA are coregulators of MyoD and skeletal muscle differentiation. Dev Cell. 11 (4), 547-560 (2006).
  35. Knoepfler, P. S., et al. A conserved motif N-terminal to the DNA-binding domains of myogenic bHLH transcription factors mediates cooperative DNA binding with pbx-Meis1/Prep1. Nucleic Acids Res. 27 (18), 3752-3761 (1999).
  36. Albini, S., Puri, P. L. SWI/SNF complexes, chromatin remodeling and skeletal myogenesis: it's time to exchange! Exp Cell Res. 316 (18), 3073-3080 (2010).
  37. Yahi, H., Fritsch, L., Philipot, O., Guasconi, V., Souidi, M., Robin, P., Polesskaya, A., Losson, R., Harel-Bellan, A., Ait-Si-Ali, S. Differential Cooperation between Heterochromatin Protein HP1 Isoforms and MyoD in Myoblasts. J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

MyoD InteractomeTandem Affinity PurificationMass SpectrometrySkeletal Muscle DifferentiationTranscription Factor PartnersCell FractionationFLAG Tag PurificationNuclear Extract AnalysisWestern Blot ValidationProtein Complex Isolation

Похожие статьи