Идентификация MyoD интерактомные Использование Тандем Аффинная очистка В сочетании с масс-спектрометрии

Ekaterina Boyarchuk; Philippe Robin; Lauriane Fritsch; Véronique Joliot; Slimane Ait-Si-Ali

doi:10.3791/53924

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Идентификация MyoD интерактомные Использование Тандем Аффинная очистка В сочетании с масс-спектрометрии

9.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53924

⸱

17 мая 2016 г.

Ekaterina Boyarchuk¹ , Philippe Robin¹ , Lauriane Fritsch¹ , Véronique Joliot¹ , Slimane Ait-Si-Ali¹

¹Epigenetics and Cell Fate, UMR 7216 CNRS, Centre National de la Recherche Scientifique CNRS - Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité

В этой статье

Краткое содержание

MyoD является миогенным транскрипционным фактором, обладающим сильной способностью индуцировать миогенную трансдифференцировку многих полностью дифференцированных немышечных клеточных линий. Эпигенетические механизмы, участвующие в этой трансдифференцировке, в значительной степени неизвестны. Здесь мы опишем метод двухаффинной очистки с последующей масс-спектрометрией для исчерпывающей характеристики партнеров MyoD.

Аннотация

Скелетная мышца терминальная дифференцировка начинается с обязательством плюрипотентных клеток-предшественников мезодермальными к миобластов. Эти клетки имеют еще способность пролиферировать или они могут дифференцироваться и запал в многоядерные мышечные трубки, которые нагноиться далее с образованием мышечные волокна. Скелетных мышц терминала дифференциация оркестрованы скоординированные действия различных факторов транскрипции, в частности, члены мышце регуляторных факторов или MRFs (MyoD, Myogenin, Myf5 и Mrf4), которая также называется миогенная bHLH факторов транскрипции семейства. Эти факторы сотрудничают с хроматином ремоделирования комплексов в сложной транскрипционной регуляторной сети для достижения скелетной миогенез. В этом, MyoD считается мастером миогенная фактор транскрипции в инициировании мышцы терминальной дифференцировки. Это понятие усиливается благодаря способности MyoD конвертировать не-мышечные клетки в клетках скелетных мышц. Здесь мы опишем подход, используемый для идентификации MyoDпартнеров белка исчерпывающим образом для того, чтобы выяснить различные факторы, участвующие в скелетных мышц терминальной дифференцировки. Долгосрочная цель состоит в том, чтобы понять эпигенетические механизмы , участвующие в регуляции генов скелетных мышц, то есть., MyoD целей. партнеры MyoD идентифицированы с помощью Тандем аффинной очистки (TAP-Tag) с гетерологичным системы, связанной с масс-спектрометрии (МС) характеристики, а затем путем подтверждения роли соответствующих партнеров во время скелетных мышц терминальной дифференцировки. Аберрантных форм миогенных факторов, или их аномальным регулирования, связаны с целым рядом мышечных нарушений: врожденная миастения, миотонической дистрофии, рабдомиосаркома и дефектов в мышечной регенерации. Таким образом, миогенные факторы обеспечивают пул потенциальных терапевтических мишеней в мышечных расстройств, как с точки зрения механизмов, которые вызывают самой болезни и регенеративные механизмы, которые могут повысить эффективность лечения заболевания. Таким образом, детальное understanдинь межмолекулярных взаимодействий и генетических программ, контролируемых миогенных факторов имеет важное значение для рациональной разработки эффективных методов лечения.

Введение

Эукариотические многоклеточные организмы состоят из различных органов и тканей. Каждая функциональная ткань имеет специфический экспрессии генов, которая определяется на каждом этапе дифференцировки. Клеточная дифференцировка включает в себя активацию специфических генов, поддержание их экспрессии и, как правило, глушителей из набора генов, таких лиц, участвующих в пролиферации клеток. Скелетная дифференцировки мышц, или миогенез, таким образом, является многоступенчатый процесс, который начинается с определения мезодермальных стволовых клеток в миобласты, а затем приводит к терминальной дифференцировки этих миобластов в первую моно-зарождаются, а затем мульти-зарожд....