Методическая статья

Визуализация сосудистой и паренхиматозных регенерации после того, как 70% частичной гепатэктомии у нормальных мышей

DOI:

10.3791/53935

⸱

13 сентября 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of General, Visceral and Vascular Surgery, Jena University Hospital, 2Experimental Molecular Imaging, RWTH Aachen University, 3Fraunhofer Institute for Medical Image Computing MEVIS, 4Institute of Pathology, Klinikum Chemnitz gGmbH

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Инструменты, используемые для визуализации регенерации сосудов, требуют методов контрастирования сосудистых деревьев. В этом фильме продемонстрирована тонкая техника инъекции, используемая для достижения оптимального контрастирования сосудистых деревьев, и проиллюстрированы потенциальные преимущества, полученные в результате детального анализа полученного образца с использованием КТ и гистологических серийных срезов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Модифицированная процедура инъекции силиконовое использовалась для визуализации печени сосудистого дерева. Эта процедура состояла из в естественных условиях введения силиконового соединения, через 26 G катетер, в портал или печеночной вены. После инъекции силикона, органы были эксплантировали и подготовлены для экс-естественных условиях микро-КТ (μCT) сканирования. Процедура инъекции силикона является технически сложной задачей. Достижение успешных результатов требует обширных микрохирургического опыта от хирурга. Одна из задач этой процедуры заключается в определении адекватной скорости перфузии для силиконового соединения. Скорость перфузии для силиконового соединения должна быть определена на основе гемодинамических сосудистой системы, представляющей интерес. Неуместный скорость перфузии может привести к неполному перфузией, искусственное расширение и разрыв сосудистых деревьев.

3D реконструкция сосудистой системы была основана на КТ и была достигнута с помощьюдоклинические программного обеспечения, таких как HepaVision. Качество восстановленного сосудистого дерева была непосредственно связана с качеством силиконового перфузией. Впоследствии, вычисляемые сосудистые параметры, указывающие роста сосудов, такие как общего сосудистого объема, были рассчитаны на основе сосудистых реконструкций. Контрастные сосудистого дерева с силиконом, предоставляемое для последующего гистологического работы вверх образца после сканирования μCT. Образец может быть подвергнут серийному секционирования, гистологического анализа и целого сканирования слайдов, а затем в 3D-реконструкция сосудистых деревьев, основанных на гистологических изображениях. Это является предпосылкой для обнаружения молекулярных событий и их распределение по сосудистого дерева. Эта модифицированная процедура инъекции силикон также может быть использован для визуализации и реконструкции сосудистой системы других органов. Этот метод имеет потенциал, чтобы быть широко применяется для исследований в отношении сосудистой анатомии и роста в различных животных аМодели болезни НД.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Регенерации печени часто определяется путем измерения увеличения веса печени и объема , и путем оценки скорости пролиферации гепатоцитов 16. Тем не менее, регенерация печени не только вызывая регенерацию паренхимы , но и регенерации сосудистой 6. Таким образом, рост сосудов следует провести дальнейшее расследование в отношении его роли в прогрессии регенерации печени. Визуализация печеночной сосудистой системы имеет решающее значение для углубления нашего понимания сосудистой регенерации. Многочисленные косвенные методы были разработаны для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе печеночной сосудистой регенерации. Традиционно, обнаружение цитокинов (фактор роста эндотелия сосудов, VEGF) , 14, хемокинов и их рецепторов (CXCR4 / CXCR7 / CXCL12) 4 был основой для изучения регенерации сосудов. Тем не менее, 3D-модель вместе с количественным анализом сосудистую добавило бы критическую анатомическиеИнформация, чтобы получить лучшее представление о важной взаимосвязи между печеночной паренхимы и регенерации сосудов.

Для визуализации печени сосудистой системы, которая требует контрастный сосудистых деревьев, мышам вводили рентгеноконтрастного силиконового каучука контрастного вещества непосредственно в портал или печеночной венозного сосудистого дерева. После полимеризации силикона и УВК органа, образцы печени были подвергнуты сканированию μCT использованием томограф. Сканирование привело к воксельных представлений изображений из кремнийорганической инъекции образцов 9.

Для контроля качества, сосудистая система была впервые визуализируется в 3D с использованием доклинических программного обеспечения. Сегментация была выполнена путем установки порога между интенсивностью мягких тканей и интенсивности сосуда. Полученная маска судно визуализировали с использованием визуализации поверхности. Программное обеспечение также разрешено для ручного определения двух параметров vasculаг роста: максимальная длина судна и радиус.

Затем Доклинические программное обеспечение было использовано для 3D реконструкции сосудистых деревьев и последующего расчета питающих или дренирующих сосудистых территорий 13. Кроме того, это программное обеспечение автоматически определены некоторые параметры роста сосудов, такие как общая длина всех видимых сосудистых структур, известных также как общая длина кромок или общего объема сосуда.

Процедура силиконовый перфузию проводили в простых мышей и у мышей, которые подверглись 70% частичной гепатэктомии (PH). Печени собраны в различные моменты времени наблюдения после резекции для анализа сосудистой и паренхиматозной регенерации печени с использованием вышеупомянутого визуализации и количественного определения техники.

Основными целями этого фильма являются: (1) демонстрируют хрупкое литьевого технику, необходимое для достижения оптимального контрастирование и (2) показывают потенциальные выгоды в результате фром детальный анализ полученных образцов с использованием μCT и гистологические серийных срезов. После просмотра этого фильма, читатель должен иметь лучшее понимание того, как придать силиконовое соединение в специфическую сосудистую систему и полезности и применимости методики.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Процедуры с участием субъектов животных были одобрены тюрингер Landesamt für Verbraucherschutz Abteilung Tiergesundheit унд Tierschutz, Германия. Поскольку портал венозная система визуализировали отдельно от печеночной венозной системы, необходимы отдельные животные для различных сосудистых деревьев.

1. Реагенты Приготовление

  1. Гепарин-солевой раствор
    1. Добавить 0,1 мл гепарина в 10 мл физиологического раствора (5 МЕ / мл).
  2. Силиконовая смесь соединений
    1. Добавить 2 мл MV-120 в одном из 5 мл трубки. Развести MV-120 путем добавления 3 мл MV разбавителя, что приводит к 40% -ного раствора.

2. Система воротной вены Инъекции силикона

  1. лапаротомия
    1. Поместите мышь в анестезии индукции камеры и анестезию его с 2% изофлуран и 0,3 л / мин кислорода.
    2. Закрепите обезболены мышь на операционном столе с помощью липкой ленты с непрерывной ингаляции от 2%oflurane и 0,3 л / мин кислорода. Проверьте схождение пинч снятие рефлекс мыши и начать работу, если рефлекс отсутствует.
    3. Сделайте поперечный разрез на животе с помощью ножниц для слоя кожи и электрический коагулятор для мышечного слоя. Выдвигайтесь кишечники в левую сторону, используя ватные палочки и покрывают кишечник с солевым пропитанной марли.
  2. Катетер вставки
    1. Рассеките воротной вены под микроскопом с помощью микро-пинцета. Поместите один 6-0 шелковый шов под внепеченочных портальной вены, примерно 1 мм расстояние до его раздвоения и связать его свободно для последующего использования.
    2. Вводят приготовленный гепарин-физиологический раствор через вену в половом члене (мужчины) или нижней полой вены (женщина) для системного гепаринизацией в течение 5 мин.
    3. Вставьте 26 калибра (26 г) катетер с иглой в портальную вену и закрепить его с помощью зажима
  3. Гепарин-солевой раствор и силиконовое соединение перфузия
    1. Нагрузка гепарин-физиологический раствор зольв 5 социологическое загрязнение мл шприц и включите перфузионного устройства. Заполните катетер полностью с гепарин-физиологический раствор, чтобы избежать воздушных пузырей.
    2. Подключение удлинительной трубки к катетеру и закрепите их плотно. Запуск гепарин-физиологический раствор перфузия со скоростью перфузии 0,4 мл / мин.
    3. Перевязывать предварительно помещают 6-0 шов шелковой нитью для двойной фиксации катетера и блокирующий кровоток из селезеночной вены и брыжеечной вены. Euthanatize мышь путем обескровливания с помощью перфузии под наркозом.
    4. Промыть печень с использованием солевого раствора в течение всей процедуры перфузионного для того, чтобы держать его влажным.
    5. Добавить 0,1 мл ОТВЕРДИТЕЛЕМ, в МВ-120 трубки. Изменение гепарин-физиологический раствор шприц силиконового шприца.
    6. Запуск силиконовый перфузию со скоростью перфузии 0,2 мл / мин в течение примерно 1 мин до предварительного заполнения катетерной системы и для заполнения системы воротной вены. Прекратить силиконовый перфузию, когда сосуды на поверхности синеть.
  4. отбор проб
    1. Держите печени в месте ЕНТIL силикон полностью полимеризуется после того, как приблизительно от 15 до 30 мин. Рассеките связки, соединяющие печень и соседние органы с осторожностью, чтобы сохранить печень неповрежденной. Эксплантата печень и поместить его в формалин для фиксации.

3. печеночного венозного Система впрыска силикона

  1. Выполните лапаротомии, как выполняется на этапе 2.1 и полностью разоблачить операционное поле.
  2. Катетер вставки
    1. Рассеките воротной вены под микроскопом с помощью микро-пинцета. Поместите один 6-0 шелковый шов под внепеченочных портальной вены, примерно 1 мм расстояние до его раздвоения и связать его свободно для последующего использования.
    2. Вводят приготовленный гепарин-физиологический раствор через вену в половом члене (мужчины) или нижней полой вены (женщина) для системного гепаринизацией в течение 5 мин.
    3. Вставьте один 26 G катетер (катетер 1) с иглой в портальную вену и закрепить его с помощью зажима. Вставьте другой 26 G катетер (катетер 2) с иглой в нижнюю полую вену и закрепить его с помощью зажима,
    4. Перевязывать ветви нижней полой вены (в том числе левой и правой почечной вены) и ее дистального конца, используя 6-0 синтетические, мононити, невсасывающихся полипропилен швом.
  3. Гепарин-солевой раствор и силиконовое соединение перфузия
    1. Загрузить гепарин-физиологический раствор в 5 мл шприц и включите перфузионного устройства. Заполните катетер 1 полностью с гепарин-солевой раствор, чтобы избежать воздушных пузырей. Подключение удлинительной трубки к катетеру 1 и зафиксировать его плотно. Запуск гепарин-физиологический раствор перфузия со скоростью 0,4 мл / мин.
    2. Перевязывать предварительно помещают 6-0 шов шелковой нитью для двойной фиксации катетера и блокирующий кровоток из селезеночной вены и брыжеечной вены. Euthanatize мышь путем обескровливания с помощью перфузии под наркозом.
    3. Промыть печень с использованием солевого раствора в течение всей процедуры перфузионного для того, чтобы держать его влажным. Добавить 0,1 мл ОТВЕРДИТЕЛЕМ, в МВ-120 трубки. Обмен гепарин-физиологический раствор шприц с силиконом шприца.
    4. Поместите зажим на suprahepatIC нижней полой вены, чтобы препятствовать оттоку печени.
    5. Подключение удлинительной трубки к катетеру 2 и начать силиконовую перфузию со скоростью перфузии 0,2 мл / мин в течение приблизительно 2 мин, чтобы достичь объективного печеночный сосудистый объем, как сообщалось. Прекратить силиконовый перфузию, когда сосуды на поверхности синеть.
  4. отбор проб
    1. Проанализируйте печени связок во избежание любого повреждения печени. Эксплантата печень и поместить его в формалин для фиксации.

4. Микро-КТ (μCT) Сканирование

Для сканирования эксплантировали пробы печени с помощью μCT, необходимы следующие шаги.

  1. Возьмем пробы печени из раствора фиксации. Поместите печень на кровать μCT. Поместите слой μCT с образцом печени в μCT.
  2. Приобретать топограмма перед началом сканирования. Используйте один субсканирования для небольшого образца печени и два subscans для больших образцов.
  3. Выберите81; протокол КТ с высоким разрешением (например, HQD-6565-390-90). Этот протокол приобретает 720 проекций с 1032 х 1,012 пикселей в течение одного полного оборота со временем сканирования 90 сек на субсканирования. Запустите сканирование μCT.

5. Гистологические Серийные срезы

  1. Вставить образец печени в парафин в целом после сканирования μCT. Вырезать весь образец парафином на секции 4 мкм, что приводит к серии 2000 до 2500 секций.
  2. Пятно секции с соответствующей техникой окрашивания, чтобы визуализировать молекулярные события, представляющие интерес, такие как Ki-67 в качестве маркера пролиферации и HMGB1 в качестве маркера ишемического повреждения. Определить последовательность окрашивания в отношении научного вопроса.
  3. Используйте весь сканер слайдов оцифровать Окрашенный секции.
  4. Выполнение 3D-реконструкция сосудистой сети (ов) (уже возможно) и визуализировать 3D-распределение молекулярных событий, в отношении сосудистой сети (исследование продолжается).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Критерии качества

Качество инъекции силикона можно судить невооруженным глазом во время процедуры. Небольшие сосуды на поверхности печени постепенно заполняют с голубым соединением. Если нормальная сосудистая структура наблюдалась на поверхности печени, качество впрыска силиконовой резины была хорошей. Если объем перфузии был недостаточен, небольшие сосуды на поверхности печени не были полностью заполнены. В о...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Контрастные сосудистого дерева путем инъекции силикона и сканирования μCT была введена в опухолевых моделях и неврологических моделях болезни часто для изучения кровеносных сосудов прогрессирование 5,7,8,10. Улучшения в методологии инъекции силикона были сделаны в настоящем исследовании для визуализации и количественной оценки роста сосудов после частичной резекции печени у мышей.

Есть целый ряд важных шагов, которым необходимо уделить внимание, чтобы добиться хорошего качества пе...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы признают финансирование Министерством образования и исследований Германии (BMBF) через сеть системной биологии "Виртуальная печень", номера грантов 0315743 (ExMI), 0315765 (UK Jena), 0315769 (MEVIS). Авторы также благодарят Франка Шуберта за техническую поддержку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ПЕРФУЗОР&рег; VIB.BRAUN87 222/0
Pipetus®-akkuHirschmann9907200
PipetsGreiner606180
микроножницы Fine Science Tools (F· S· L)No 14058-09
микросеррефайнFine Science Tools (F· S· L)No.18055-05
Аппликатор микрозажимовFine Science Tools (F· S· L)No 18057-14
Прямые микрощипцыFine Science Tools (F· S· L)No 00632-11
Изогнутые микрощипцыFine Science Tools (F· S· L)No 00649-11
иглодержательFine Science Tools (F· S· L)No 12061-01
шприц 1 млB.Braun9161406V
шприц 5 млB.Braun4606051V
удлинитель и соединительные линииB.Braun425600030 см, внутренний ø 1,2 мм
6-0 шелк (Perma-Hand Seide)Ethicon639H
6-0 проленEthicon8711H
Microfil® Разбавитель MVFLOW TECH, INC
Microfil® MV - 120FLOW TECH, INCMV - 120 (синий)
MV отвердительFLOW TECH, INC
Heparin 2500 I.E./5 млRotexmedicaETI3L318-15
Физиологический растворFresenius Kabi Deutschland GmbHE15117/D DE
Imalytics Доклиническое программное обеспечениеЭкспериментальная молекулярная визуализация, Рейнско-Вестфальский технический университет Ахена, Германия
HepaVisionFraunhofer MEVIS, Бремен, Германия
NanoZoomer 2.0-HT  Цифровой сканер слайдовHamamatsu Electronic Press, Япония C9600
Томоскоп Duo CT CT Imaging GmbH, Эрланген, ГерманияTomoScope®   Синергия

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bearden, S. E., Segal, S. S. Neurovascular alignment in adult mouse skeletal muscles. Microcirculation. 12 (2), 161-167 (2005).
  2. Brown, R. P., Delp, M. D., Lindstedt, S. L., Rhomberg, L. R., Beliles, R. P. Physiological parameter values for physiologically based pharmacokinetic models. Toxicol.Ind.Health. 13 (4), 407-484 (1997).
  3. Dai, D., et al. Elastase-Induced Intracranial Dolichoectasia Model in Mice. Neurosurgery. , (2015).
  4. Ding, B. S., et al. Inductive angiocrine signals from sinusoidal endothelium are required for liver regeneration. Nature. 468 (7321), 310-315 (2010).
  5. Downey, C. M., et al. Quantitative ex-vivo micro-computed tomographic imaging of blood vessels and necrotic regions within tumors. PLoS.One. 7 (7), 41685(2012).
  6. Ehling, J., et al. CCL2-dependent infiltrating macrophages promote angiogenesis in progressive liver fibrosis. Gut. , (2014).
  7. Ehling, J., et al. Micro-CT imaging of tumor angiogenesis: quantitative measures describing micromorphology and vascularization. Am.J.Pathol. 184 (2), 431-441 (2014).
  8. Ghanavati, S., Yu, L. X., Lerch, J. P., Sled, J. G. A perfusion procedure for imaging of the mouse cerebral vasculature by X-ray micro-CT. J.Neurosci.Methods. 221, 70-77 (2014).
  9. Gremse, F., et al. Hybrid microCT-FMT imaging and image analysis. J.Vis.Exp. (100), (2015).
  10. Jing, X. L., et al. Radiomorphometric quantitative analysis of vasculature utilizing micro-computed tomography and vessel perfusion in the murine mandible. Craniomaxillofac.Trauma Reconstr. 5 (4), 223-230 (2012).
  11. Melloul, E., et al. Small animal magnetic resonance imaging: an efficient tool to assess liver volume and intrahepatic vascular anatomy. J.Surg.Res. 187 (2), 458-465 (2014).
  12. Schwier, M., Bohler, T., Hahn, H. K., Dahmen, U., Dirsch, O. Registration of histological whole slide images guided by vessel structures. J.Pathol.Inform. 4 ((Suppl)), 10(2013).
  13. Selle, D., Preim, B., Schenk, A., Peitgen, H. O. Analysis of vasculature for liver surgical planning. IEEE Trans.Med.Imaging. 21 (11), 1344-1357 (2002).
  14. Shergill, U., et al. Inhibition of of VEGF- and NO-dependent angiogenesis does not impair liver regeneration. Am.J.Physiol Regul.Integr.Comp Physiol. 298 (5), 1279-1287 (2010).
  15. Sueyoshi, R., Ralls, M. W., Teitelbaum, D. H. Glucagon-like peptide 2 increases efficacy of distraction enterogenesis. J.Surg.Res. 184 (1), 365-373 (2013).
  16. Wei, W., et al. Rodent models and imaging techniques to study liver regeneration. Eur.Surg.Res. 54 (3-4), 97-113 (2015).
  17. Xie, C., Wei, W., Zhang, T., Dirsch, O., Dahmen, U. Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice. J.Vis.Exp. (92), e51955(2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

3DKi 67HepaVision

Похожие статьи