Методическая статья

Мышиные Hind Лимб длинных трубчатых костей Вскрытие и костного мозга Изоляция

DOI:

10.3791/53936

⸱

14 апреля 2016 г.

 ,  , 
1Department of Urology, Johns Hopkins University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол рассечения длинных костей задних конечностей (бедренных и большеберцовых костей) лабораторной мыши. Далее мы описываем быструю технику выделения костного мозга из этих костей, в которой используется центрифугирование для удаления костного мозга из пространства костного мозга.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследование костей и костного мозга имеет решающее значение во многих областях исследований, включая фундаментальную биологию костей, иммунологию, гематологию, метастазирование рака, биомеханику и биологию стволовых клеток. Однако, несмотря на важность кости в здоровом и патологическом состоянии, она является в значительной степени недостаточно изученным органом из-за отсутствия специализированных знаний о рассечении кости и выделении костного мозга. Мыши являются распространенным модельным организмом для изучения воздействия на кости и костный мозг, что требует стандартизированного и эффективного метода рассечения длинных костей и выделения костного мозга для обработки больших экспериментальных когорт. Мы описываем простую процедуру диссекции для удаления бедренной и большеберцовой костей, которая подходит для последующих применений, включая, помимо прочего, гистоморфологический анализ и испытание на прочность. Кроме того, мы описываем быструю процедуру выделения костного мозга из длинных костей с помощью центрифугирования с ограниченным временем обработки, идеально подходящую для сортировки клеток, первичной клеточной культуры или экстракции ДНК, РНК и белков. Протокол оптимизирован для быстрой обработки образцов для ограничения экспериментальной ошибки и стандартизирован для минимизации вариабельности от пользователя к пользователю.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изучение длинных костей и клеток костного мозга занимает центральное место во множестве исследовательских дисциплин, включая, но не ограничиваясь, биологию костей, биологию рака, иммунологию, гематологию и биомеханику. Кость является высокодинамичным органом, который вместе с хрящом образует скелет, обеспечивающий механическую поддержку от нагрузки и защиту внутренних органов. Кроме того, минеральные компоненты кости являются хранилищем для критически важных сигнальных молекул кальция и фосфора, а также других факторов1. Наконец, в костях находится костный мозг, который вместе с метаболически активными костеобразующими остеобластами и костными резорбирующими остеокластами обеспечивает нишу стволовых клеток, необходимую для поддержания популяций гемопоэтических и лимфоидных клеток.

Кости и костный мозг поражаются при многих заболеваниях, часто приводящих к дисфункции костного мозга, сильной боли в костях и патологическому перелому. Кость является распространенным местом метастазирования при многих солидных опухолях, в первую очередь при раке молочной железы и раке предстательной железы, где опухолевые клетки напрямую взаимодействуют с нишей костного мозга, запуская порочный круг метастазирования в кости и вытесняя гемопоэтические стволовые клетки2,3. Злокачественные новообразования кроветворения, включая миелому и лейкемию, характеризуются дисфункцией костного мозга, а также нарушением регуляции здорового костного ремоделирования1. Другие незлокачественные заболевания скелета также являются активными областями исследований, такие как остеоартрит, остеопороз, сколиоз и рахит. Даже у здорового человека биомеханический сбой в кости приводит к болезненному перелому. Все эти расстройства представляют собой активные области исследований с целью определения новых профилактических мер и схем лечения для снижения заболеваемости и смертности.

Для исследования множества ролей кости и костного мозга, как в физиологических, так и в патологических условиях, исследователям крайне важно иметь простой и эффективный стандартизированный метод препарирования длинных костей мыши для быстрой обработки больших экспериментов in vivo. Описанный здесь протокол диссекции подходит для всех анализов длинных костей, включая, среди прочего, визуализацию ex vivo, гистологию, гистоморфометрию и испытания на прочность. Аналогичным образом, стандартизированный метод выделения костного мозга с высоким уровнем восстановления клеток костного мозга и низкой вариабельностью между пользователями важен для экспериментального анализа, такого как сортировка клеток, активируемых флуоресценцией (FACS) или количественная ПЦР (qPCR), а также для последующих применений, таких как первичная клеточная культура клеток костного мозга.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все для животных работа была одобрена Institutional уходу и использованию животных комитета в соответствии с рекомендациями, изложенными в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения.

1. Hind Лимб длинных трубчатых костей Рассечение

  1. Эвтаназии мыши в соответствии с ведомственным руководящим принципам.
  2. Поместите мышь в положении лежа на спине и наклейте закрепив все четыре ноги через мышь подушечки лап ниже голеностопного сустава.
  3. Спрей мышь с 70% этанола, тщательно обливание ног.
  4. Сделайте небольшой надрез справа от средней линии в нижней части живота, чуть выше бедра.
  5. Расширьте надрез вниз по ноге и мимо голеностопного сустава.
  6. Оттяните кожу и разрезать четырехглавой мышцы, прикрепленной к проксимального конца бедренной кости, чтобы выставить переднюю сторону бедра и пин-код из ноги, поместив палец под углом 45 градусов от борта.
  7. С Bladе ножниц против задней стороны бедра, отрежьте бицепсы от коленного сустава.
  8. Оттяните кожу и мышцы подколенного сухожилия, прикрепленной к проксимального конца бедренной кости, чтобы выставить заднюю сторону бедра и пин-код из ноги, поместив палец под углом 45 градусов от борта.
  9. С помощью щипцов, удерживая дистальный конец бедренной кости, чуть выше коленного сустава. Руководство лезвия ножниц по обе стороны от бедренной кости к тазобедренного сустава, стараясь не врезаться в самой бедренной кости.
  10. После достижения головки бедренной кости, с указанием ножниц открытия слегка скрутите ножницы с верхним лезвием ножниц, движущихся непосредственно над головки бедренной кости вывихнуть бедренной кости, стараясь не замкнуть кости ниже головки бедренной кости.
  11. Возьмитесь за верхнюю часть бедренной кости с пинцетом, разрезал мягкие ткани от головки бедренной кости, чтобы освободить его от вертлужной.
  12. Вытащите всю кость ноги, в том числебедренной кости, колена и голени, вверх и в сторону от тела, тщательно срезая соединительной ткани и мышц, соединяющий ногу к коже.
  13. Перенапрягать голеностопный сустав и снова использовать ножницы в вращательным движением вывихнуть берцовой кости.
  14. Схватив дистального конца большеберцовой кости, следя за тем, чтобы не перерезать сухожилия, потяните голень вверх и в сторону от тела и пин-плате.
  15. Вырезать все оставшиеся соединительной ткани имеется длинный кость мыши в колене.
  16. Удалите любые дополнительные мышцы или соединительной ткани, прикрепленный к бедренной и большеберцовой кости.
  17. Для любых приложений, требующих кости , чтобы оставаться неповрежденными (гистология, Гистоморфометрия, биомеханические тестирование и т.д.) . , Действуйте со стандартными протоколами в доме (как в 4-7). Чтобы изолировать костный мозг, переходите к разделу 2.

2. Длинные косточки Подготовка к изоляции костного мозга

  1. Используя пинцет, возьмитесь бедренной кости с надколенника лицом прочьй проксимальный конец (головка бедренной кости) вниз.
  2. Перенапрягать коленного сустава и использовать ножницы в вращательным движением вывихнуть берцовой и бедренной костями.
  3. Вырезать любой соединительной ткани, проведение бедренной и большеберцовой костей вместе.
  4. Используя пинцет, возьмитесь бедренной кости с передней стороны, обращенной в сторону и проксимального конца бедренной кости (конец головки) вниз.
  5. Руководство ножницы вверх бедренной кости к мыщелков.
  6. Осторожно повернуть ножницы назад и вперед, чтобы удалить мыщелков, коленной чашечки, и эпифиз выставить метафиза.
  7. Удалите любые дополнительные мышцы или соединительной ткани, прикрепленный к бедренной кости с помощью щипцов, ножниц и Kimwipes.
  8. Используя пинцет, возьмитесь за голень с передней стороны, обращенной в сторону и дальний конец (конец голеностопа) вниз.
  9. Если большеберцовой эпифиза цела, руководство ножницами вверх большой берцовой кости вала до мыщелков.
  10. Осторожно повернуть ножницы назад и вперед, чтобы удалить мыщелков и эпифиз, чтобы выставить metaphлиз.
  11. Удалите любые дополнительные мышцы или соединительной ткани, прикрепленный к большеберцовой кости с помощью щипцов, ножниц и Kimwipes.

3. Выделение костного мозга

  1. Принудительную 18 G иглу через нижнюю часть 0,5 мл трубки микроцентрифужных.
  2. Поместите длинные кости (максимум 2 бедрами и голенями 2) в трубку, по колено конец вниз концом вниз и закройте крышку.
  3. Гнездо 0,5 трубки микроцентрифужных мл в 1,5 мл трубки микроцентрифужных.
  4. Центрифуга вложенными пробирки при ≥10,000 XG в микроцентрифуге в течение 15 сек.
  5. Убедитесь в том, что костный мозг был растягивал из костей с помощью визуального осмотра. Кости должны выглядеть белым и не должно быть большой визуальный осадок в большую трубу.
  6. Откажитесь от 0,5 мл микроцентрифужных трубку с костями.
  7. Приостановка костный мозг в соответствующем растворе (например, PBS, культуральные среды, FACS буфер) и продолжить экспериментальный протокол (ДНК, РНК или выделения белка,Анализ FACS, или первичной культуры клеток).

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол, описанный здесь, оптимизирован для быстрой рассечения бедренной кости мыши и большеберцовой кости с минимальным повреждением костной ткани. Этот метод подходит для целого ряда последующих анализов, включая исследования биомеханики, гистоморфометрии (рис 1А - В) и гистологии (рис 1C) 4,7. Представитель histomophometric micoCT 3D реконструкция (Рисунок 1А - B) показывает , что как губчатой ​​кости и кортикального оболочки сохраняются , что позволяет точно оценить стандартизированных структурных параметров для гистоморфометрии кости, в том числе губчатой ​​количества, толщины и расстояния; объем костной ткани; и кортикальную толщину, среди прочих мер 8. Представитель гистологические секции показывает H & E окрашивали фиксированные формалином и декальцинированной берцовой (рис 1C). Изображение демонстрирует целостность обоих кальцифицированного Ьодин и клеточный костный мозг для гистологического анализа.

Процедура костного мозга изоляция сохраняет стерильность пространства костного мозга, имеет низкую обработку для снижения загрязнения, и не требует нарезку длинной кости, тем самым уменьшая потери урожая костного мозга. Этот костный мозг подходит для многих последующих применений, в том числе проточной цитометрии 5 и ПЦР - анализ. Кроме того, эта процедура может быть использована для выделения костного мозга для первичной культуры клеток клеток костного мозга, в том числе остеокластов и остеобластов (фиг.2А - B) -4,6.

figure-results-1
Рисунок 1. Гистоморфологические и гистологические анализы мышей длинных трубчатых костей. Трехмерная microCT реконструкция большеберцовой кости мыши , показывая (A) наружный кортикальный оболочку и (B Чонг>) губчатая кость (масштаб бар = 0,5 мм). (C) Гистологическое H & E пятно в декальцинированной и секционного большеберцовой кости (4x). Изображения любезно предоставлены Кэтрин Weilbaecher, Вашингтон школы медицины университета, США. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2. Первичная костного мозга Культура клеток для дифференциации остеокластов и остеобластов. (A) TRAP окрашивание на многоядерные остеокластов через 7 дней в osteoclastogenic средах (4x). (В) щелочной фосфатазы (фиолетовый цвет) для остеобластов и ализарин красный (красный цвет) пятно для минерализации после 21 дней в остеогенной СМИ. Изображения любезно предоставлены Кэтрин Weilbaecher, Вашингтон школы медицины университета, США.Iles / ftp_upload / 53936 / 53936fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем простой и эффективный метод удаления длинных задних костей мышей и последующей изоляции костного мозга. Этот метод поддерживает высокую структурную и клеточную целостность костей и костного мозга и имеет низкое время обработки, сводя к минимуму вероятность перелома или оценки кости, вызванной пользователем, которые могут повлиять на последующие анализы. Кроме того, метод центрифугирования для выделения костного мозга не требует разрезания кости для обнажения пространства костного мозга или жидкости для промывания костного мозга, уменьшая потенциальные точки загрязнения. Кроме того, метод центрифугирования имеет относительно высокую пропускную способность и меньшее время ручной работы по сравнению с другими методами, что сокращает время обработки.

Высокая вариативность присуща исследованиям на мышах in vivo из-за высокой фенотипической изменчивости от мыши к мыши. Для того, чтобы максимизировать исследовательское воздействие дорогостоящих и трудоемких исследований на мышах, крайне важно свести к минимуму техническую экспериментальную ошибку9,10. Время от жертвоприношения животных до последующего анализа или фиксации тканей вносит экспериментальные изменения, которые могут преодолеть тонкие изменения и уменьшить большие различия между группами. Поэтому быстрая обработка образцов имеет важное значение для точного анализа данных. Описанные здесь методы рассечения длинных костей и выделения костного мозга оптимизированы для быстрой обработки животных и образцов с целью уменьшения технических вариаций.

Этот протокол может быть широко применен во многих областях исследований, включая исследование самой костной ткани или исследование клеток костного мозга. Кроме того, этот простой подход к рассечению длинных костей позволит исследователям в смежных областях напрямую исследовать вклад костей, чтобы расширить наши знания о дисфункции костного мозга при недостаточно изученных патологиях.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами NCI NoNo U54CA143803, CA163124, CA093900 и CA143055 K.J.P. Авторы благодарят нынешних и бывших сотрудников лаборатории Вейльбекера, особенно Кэтрин Вайльбехер, Мишель Хурхла и Хунджу Дэна, а также сотрудников Урологического института Брейди, особенно сотрудников лаборатории Пиента, за критическое прочтение рукописи.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Pinboard
Pinboard
70% этанола
 
Щипцы
KimwipesKimberly-Clark34120
16 G игла
1,5 мл Микроцентрифуга пробирка
0,5 мл Микроцентрифуга
Ножницы для рассечения для рассечения

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McHayleh, W. M., Ellerman, J., Roodman, G. D. Ch. 80. Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. , American Socieyt for Bone and Mineral Research. 379-381 (2008).
  2. Weilbaecher, K. N., Guise, T. A., McCauley, L. K. Cancer to bone: a fatal attraction. Nat Rev Cancer. 11 (6), 411-425 (2011).
  3. Pedersen, E. A., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. The prostate cancer bone marrow niche: more than just 'fertile soil. Asian J Androl. 14 (3), 423-427 (2012).
  4. Amend, S. R., et al. Thrombospondin-1 regulates bone homeostasis through effects on bone matrix integrity and nitric oxide signaling in osteoclasts. J Bone Miner Res. 30 (1), 106-115 (2015).
  5. Hurchla, M. A., et al. The epoxyketone-based proteasome inhibitors carfilzomib and orally bioavailable oprozomib have anti-resorptive and bone-anabolic activity in addition to anti-myeloma effects. Leukemia. 27 (2), 430-440 (2013).
  6. Rauch, D. A., et al. The ARF tumor suppressor regulates bone remodeling and osteosarcoma development in mice. PLoS One. 5 (12), e15755(2010).
  7. Su, X., et al. The ADP receptor P2RY12 regulates osteoclast function and pathologic bone remodeling. J Clin Invest. 122 (10), 3579-3592 (2012).
  8. Dempster, D. W., et al. Standardized nomenclature, symbols, and units for bone histomorphometry: a 2012 update of the report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. J Bone Miner Res. 28 (1), 2-17 (2013).
  9. Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483 (7391), 531-533 (2012).
  10. Festing, M. F., Altman, D. G. Guidelines for the design and statistical analysis of experiments using laboratory animals. ILAR J. 43 (4), 244-258 (2002).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи