Методическая статья

Быстрый метод обработки крови для увеличения выхода плазмы пептидных уровней в крови человека

DOI:

10.3791/53959

⸱

28 апреля 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Charité Center for Internal Medicine and Dermatology, Division General Internal and Psychosomatic Medicine, Charité Universitätsmedizin Berlin, Campus Benjamin Franklin, 2Department of Internal Medicine, Institute of Neurogastroenterology and Motility, Martin-Luther Hospital, Academic Teaching Institution of Charité Universitätsmedizin Berlin, 3Department of Hepatology and Gastroenterology, Molecular Cancer Research Center (MKFZ), Campus Virchow-Klinikum, Charité-Universitätsmedizin Berlin

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Способ обработки крови БЫСТРОГО может быть использован в организме человека и дает более высокие уровни пептидов, а также позволяет для оценки правильной молекулярной форме. Таким образом, этот метод будет ценным инструментом в пептидной исследования.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследования в области регулирования потребления пищи приобретает все большее значение. Это часто включает в себя измерение пептидов, регулирующих потребление пищи. Для правильного определения концентрации с пептидом, то он должен быть стабильным во время обработки крови. Тем не менее, это не так для нескольких пептидов, которые быстро разлагаются эндогенными пептидаз. В последнее время мы разработали метод обработки крови с использованием R температуры, развита cidification, P rotease торможение, я sotopic экзогенные управления и D ilution (Рапид) для использования у крыс. Здесь мы установили эту технику для использования в организме человека и исследовали восстановление, молекулярную форму и циркулирующую концентрацию приема пищи регуляторных гормонов. Экспресс метод значительно улучшает восстановление для 125 I-меченый соматостатин-28 (+ 39%), глюкагон-подобный пептид-1 (+ 35%), ацил грелин и глюкагон (+ 32%), инсулин и kisspeptin (+ 29% ), nesfatin-1 (+ 28%), лептин(+ 21%) и пептид YY 3-36 (+ 19%) по сравнению со стандартной обработкой (ЭДТА крови на льду, р <0,001). Высокоэффективная жидкостная хроматография показала элюирование эндогенного ацил грелина в ожидаемом положении после быстрой обработки, в то время как после стандартной обработки 62% ацильных грелина деградировали в результате более раннего пика, вероятно, что составляет desacyl грелина. После быстрой обработки отношение грелин ацил / desacyl в крови с нормальной массой тела составляло 1: 3 по сравнению с 1:23 следуя стандартной обработке (р = 0,03). Также эндогенные kisspeptin уровни были выше , после того, как быстро по сравнению со стандартной обработкой (+ 99%, р = 0,02). Способ обработки крови БЫСТРОГО может быть использован в организме человека, дает более высокие уровни пептида и позволяет для оценки правильной молекулярной форме.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В свете растущей во всем мире распространенность ожирения 1,2, исследования в области регулирования потребления пищи приобретает все большее значение. Хотя до сих пор только один пептид известно , что периферически производится и централизованно действуя , чтобы стимулировать потребление пищи, а именно грелин 3, в течение последних десятилетий, широкий спектр пептидов было установлено , что уменьшить потребление пищи, например. лептин, пептид YY (PYY) , а также глюкагон-подобный пептид-1 (GLP-1) и инсулина 4. Таким образом, в исследованиях , посвященных регуляторные механизмы голода и сытости пептидных уровней часто оцениваются и в то же время предполагается, что пептид изученным является стабильным и восстанавливается при высоких урожаев в процессе образования плазмы. Тем не менее, очень часто это не так из - за быстрого эндогенного пробоя , как показано выше для например. грелин , который деградирует из ацила до desacyl грелин 5. Таким образом, мы недавно описал быстрый метод предпосе кровипоют у крыс , использующих R температуры, развита cidification, P rotease торможение, я sotopic экзогенные управления и D ilution 6. Этот метод улучшил восстановление для 11 из 12 6 пептидов испытанных и разрешенных для определения правильной циркулирующей молекулярной форме по сравнению со стандартной обработкой крови (ЭДТА крови на льду). Этот метод был использован в нескольких последующих работах 7-12 для выявления циркулирующих грелин, а также кортикотропин-рилизинг-фактора 13. Таким образом, метод оказался полезным для пептидного исследований у грызунов. Однако, поскольку исследования на грызунах не всегда переводимых к другому виду, этот метод должен быть создан для использования в человеческой крови, а также.

Цель настоящего исследования состояла в том, чтобы проверить быстрый метод обработки крови в организме человека по сравнению со стандартной обработкой крови, ЭДТА крови на льду, который широко рекомендуется 14 и часто уСЭД в клинической практике, а также условий исследования. Мы тестировали восстановление выбора 125 I-меченных пептидов , участвующих в регуляции потребления пищи , включая установленные пептиды, а также новых кандидатов недавно предложил , чтобы играть роль в питании регулирования (воздействие на потребление пищи приведены в таблице 1) следующую обработку с обоими методами. Гормоны были также выбраны для представления пептиды различной длины и заряда (таблица 2). Кроме того, для грелина мы исследовали молекулярную форму (ы) в соответствии со стандартными и экспресс-метод. И, наконец, мы провели оценку эндогенного грелин (ацил и desacyl грелина), а также уровни kisspeptin, пептид также недавно предложил играть определенную роль в регуляции потребления пищи 15,16 после быстрого или стандартной обработки. Кроме того, мы также исследовали эти уровни пептида в популяции субъектов с широким диапазоном индекса массы тела ( в диапазоне от 10.2-67.6 кг / м 2) для изучения possibле различия, связанные с хроническими измененном веса тела.

figure-introduction-1

figure-introduction-2

Диагностика, оценка и план:
участники исследования
Все участники исследования были недавно госпитализированных пациентов (включение было в течение двух дней с момента поступления в стационар) Отдела психосоматической медицины Шарите-Universitätsmedizin Берлине и дали письменное информированное согласие. Для того, чтобы избежать какого-либо влияния пола только пациентов женского пола были включены. В общей сложности 42 субъектов участвовали в этом исследовании и были разделены на три группы: с нормальным весом (ИМТ 18.5-25 кг / м 2, п = 12), анорексии (ИМТ <17,5 кг / м 2, п = 15) и ожирение (ИМТ> 30 кг / м 2, п = 15). Anorexic и ожирением пациентов былидиагноз в соответствии с Международной классификацией болезней-10 и госпитализированы для увеличения веса (анорексии) или снижения веса (ожирение), соответственно. Все пациенты с нормальным весом были госпитализированы из-за исключительно симптомами соматоформных без соответствующих соматических расстройств. У больных с желудочно-кишечными симптомами соматоформных или в анамнезе желудочно-кишечной хирургии были исключены. Критерии исключения также охватывает возраст <18 лет, текущая беременность и без лечения психотических заболеваний. Сбор крови проводили на день 2 или 3, после того, как госпитализации до получения диетического лечения с целью увеличения или снижения массы тела, соответственно. Антропометрические параметры оценивались в тот же день.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол был одобрен местным комитетом по этике для человеческого исследования (номер протокола EA1 / 114/10).

Обработка 1. Кровь

  1. Сбор венозной крови с 07:00 до 08:00 утра после ночного голодания из вены предплечья и процесса в соответствии со стандартной процедурой или экспресс-метод. Поручить предметы, чтобы не физические нагрузки или дыма перед тем забора крови.
  2. Для стандартной обработки, собирают кровь в охлажденном ЭДТА содержащих пробирки и центрифуге в течение 10 мин при 3000 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Соберите супернатант и хранить при температуре -80 ° С до дальнейшей обработки с помощью радиоиммуноанализа.
  3. Для быстрой обработки, немедленно разбавить кровь (в течение 1 мин после забора крови) 1:10 в охлажденном льдом буфере (рН 3,6), содержащего 0,1 М ацетата аммония, 0,5 М NaCl и ингибиторы ферментов (diprotin А, Е-64-д, Антиболь , лейпептина, химостатина, 1 мкг / мл). Затем центрифугу в течение 10 мин при 3000 х г в течение 10 мин при 4 ° С и собирают надосадочную жидкость с намиING пипетки в полипропиленовые пробирки , как подробно описано ранее у крыс 6.
    1. Заряд хроматографические картриджи (360 мг, 55-105 мкм) с 100% ацетонитрила (скорость 10 мл / мин), уравновешиваться с 0,1% трифторуксусной кислоты (TFA, скорость 10 мл / мин) и нагрузки с надосадочной жидкостью с постоянной скоростью 1 мл / мин с помощью шприцевого насоса.
    2. После этого промойте картриджи с 3 мл 0,1% TFA (скорость 10 мл / мин) и медленно вымывается с 2 мл 70% ацетонитрила, содержащего 0,1% TFA (2 мл / мин).
    3. Сухие Элюированные образцы не с помощью вакуумного центрифугирования и хранят при -80 ° С до дальнейшей обработки радиоиммуноанализом.
      Примечание: Провести все шаги полипропилена (Рапид обработка) и боросиликатного (радиоиммуноанализа) трубок , которые обладают значительно более низкую поверхность связывания свойства и тем самым свести к минимуму потери пептида для большинства пептидов изученных до 26.

2. Измерения

Примечание: Шаги в этом разделе должны быть выполнены в лабораториисертифицировано для работы с радиоактивными материалами. Стандартные меры предосторожности при работе с 125 I должны быть приняты.

  1. Восстановление радиоактивной пептидами
    1. Получение 125 I-меченных радиоактивным изотопом пептидов человека (например, ацил-грелина, ГПП-1, глюкагон, инсулин, kisspeptin, лептин, nesfatin-1, PYY 3-36 и соматостатин-28).
    2. Хранить пептиды в виде порошка до эксперимента, а затем свеже разбавить в 0,1% -ной уксусной кислоте (~ 100 000 импульсов в минуту на мл).
    3. Для стандартной обработки крови, непосредственно после того, как для забора крови в охлажденный ЭДТА пробирки, содержащие, трансфер 1 мл крови в пробирку с 50 мкл радиометки, содержащего 3000-6000 СРМ (подсчитывали непосредственно перед началом эксперимента).
    4. Для быстрой обработки, передачи 1 мл крови ЭДТА, содержащей кровь в пробирку, содержащую 9 мл RAPID буфера (для композиции см 1.3) и 500 мкл радиоактивной содержащий 30.000-60.000 имп. Из-за использования в разведении 1:10 в 10 раз больший объем radiolabeл для быстрой обработки.
    5. Затем образцы процесса, как описано в пунктах 1.2 1.3.2.
    6. Для экспериментов по восстановлению, не сухие образцы с помощью вакуумного центрифугирования и не хранить при температуре -80 ° C. Вместо того, чтобы, оценить восстановление радиоактивно меченных пептидов непосредственно после этого с помощью гамма-счетчика.
    7. Мера весь супернатант в стандартных образцах, в то время как в RAPID образцы анализируют 1/10 от общего объема, чтобы получить сопоставимость количества радиоактивной метки, используемой. Для измерения, передачи супернатант в трубах, установленных в гамма-счетчика и оценить число импульсов в минуту
    8. В стандартной комплектации на 100%, используют два образца с 50 мкл 125 I-радиоактивно пептида , которые не подвергаются обработке. Измерить одновременно с другими образцами, как описано в 2.1.7.
    9. Выполнение эксперимента пять-шесть раз для каждого пептида.
  2. Высокоэффективная жидкостная хроматография меченого грелина
    1. Вывод крови в Cокучивать ЭДТА пробирки, содержащие и передачу по 1 мл в пробирки, содержащие 200 мкл меченного радиоактивным изотопом-ацил грелин, содержащего 15000-20000 СРМ (подсчитываются непосредственно перед началом эксперимента).
    2. Для быстрой обработки, передачи 1 мл крови в пробирку, содержащую 9 мл RAPID буфера (для композиции см 1.3) и 200 мкл радиоактивно ацил грелин, содержащий 15000-20000 имп.
    3. Затем образцы процесса, как описано в пунктах 1.2 1.3.2.
    4. Для дальнейшего анализа с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой, непосредственно загружать образцы на устойчивую связь колонке С18 (2,1 мм х 50 мм, 1,8 мкм), уравновешенную 17% ацетонитрила в воде (как с добавлением 0,1% TFA).
    5. После 5 мин уравновешивания, используется градиент от 17-40% ацетонитрила, чтобы элюировать образец через 40 мин (скорость 1 мл / мин поток).
    6. Собирают фракции по 1 мл в каждую минуту и ​​анализируют радиоактивность с помощью гамма-счетчика.
    7. В отдельном эксперименте, нагрузка 200 мкл меченного радиоактивным изотопом ацил грелин, содержащего 15000-20000имп на колонку непосредственно и выполняют ВЭЖХ, как описано в пунктах 2.2.4 2.2.6.
  3. радиоиммуноанализ
    1. Для радиоиммунологического, размораживайте супернатантов (стандартная обработка) и высушенный в вакууме порошок (экспресс-метод) при комнатной температуре.
    2. Непосредственно перед радиоиммуноанализ, вновь приостановить сухие RAPID образцы в бидистиллированной H 2 O в соответствии с первоначальным объемом плазмы (500 мкл).
    3. Оценка kisspeptin и общая (включая как desacyl и ацил грелина), а также ацильную грелин , как описано выше 12,27 с использованием коммерческих радиоиммунологической в соответствии с протоколами производителей. Использование боросиликатных трубок, которые позволяют стабильное образование гранул.
      1. В первый день, инкубировать образцов с буфером для анализа и первичным антителом (например, анти-грелина) в разведении , предоставленного производителем в течение 24 часов.
      2. На второй день, добавьте 125 I изотоп (например , 125 I-грелина), В.О.RTEX и инкубировать в течение 24 часов.
      3. На третий день, добавьте осаждая реагента, вихря и инкубировать в соответствии с рекомендациями производителя. Затем, центрифужные пробирки при 3000 х г в течение 20 мин при температуре 4 ° С. Удалить супернатанты и подсчета радиоактивности в гранулах с помощью гамма-счетчика
    4. Вычислить desacyl грелина как разность общего минус ацил грелина. Оценка соотношения грелина ацил / desacyl путем деления ацил на desacyl грелина для каждого отдельного образца.
    5. Процесс все образцы - если это возможно - в одной партии, чтобы избежать между анализами изменчивости. Изменчивость внутри пробы в данном эксперименте был <8% для kisspeptin, <7% для общего и <9% для ацил грелина.

3. Статистический анализ

  1. Определить распределение данных с помощью теста Колмогорова-Смирнова. Экспресс данные как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (SEM).
  2. Оценка различий между двумягрупп по Т-тест. Оценка различий между несколькими группами от всех попарных нескольких процедур сравнения (Тьюки постфактум тест) или двухсторонним ANOVA с последующим методом Holm-Сидак.
  3. Рассмотрим р <0,05 значимыми и выполнения анализа с использованием статистической программы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Быстрая обработка крови увеличивает выход 125 I-меченных пептидов в крови человека по сравнению со стандартной обработкой крови.
После стандартной обработки крови (ЭДТА крови на льду), восстановление меченных пептидов составляла ~ 60% в 9/9 пептидов ( в пределах от 48-68%, рис 1A - K). Быстрая обработка способствовала увеличению урожайности во всех 125 I-меченных пептидов, а именно в соматостатина-28 (+ 39%, рис 1А),

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы сообщали ранее , что экспресс - метод для обработки крови улучшается восстановление для 11/12 пептидов по сравнению со стандартной обработкой крови у крыс 6. В настоящем исследовании мы показали, что этот метод также подходит для использования в организме человека. После быстрой обработки, была усовершенствована для восстановления 9 из 9 125 I-меченных пептидов испытания по сравнению со стандартной обработкой крови (ЭДТА крови на льду). Наблюдаемое улучшение колебалась от 19-39%, что, вероятно, ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана STE Research Foundation German 1765 / 3-1 (AS) и германским министерством по образованию и научным исследованиям 03IPT614A (CG). Мы благодарим Reinhard Ломмель и Петра Буссе за отличную техническую поддержку, а также Карин Йоханссон и Кристины Hentzschel за помощь в организации и проведения антропометрических измерений

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Diprotin APeptides International, Луисвилль, Кентукки, СШАIDP-4132
E-64-dPeptides International, Луисвилль, Кентукки, СШАIED-4321-V
AntipainPeptides International, Луисвилль, Кентукки, СШАIAP-4062
ЛейпептинПептиды Интернэшнл, Луисвилль, Кентукки, СШАILP-4041
ХимостатинPeptides International, Луисвилль, Кентукки, СШАICY-4063
Sep-Pak C18 картриджиWaters Corporation, Милфорд, Массачусетс, СШАWAT051910360 мг, 55-105 и микро; m
Ацил-грелинМиллипор, Биллерика, Массачусетс, США9088-HKРадиоактивный
GLP-1Миллипор, Биллерика, Массачусетс, США9035-HKРадиоактивный
глюкагонМиллипор, Биллерика, Массачусетс, США9030Радиоактивный
инсулинМиллипор, Биллерика, Массачусетс, США9011SРадиоактивный
лептинМиллипор, Биллерика, Массачусетс, США9081-HKРадиоактивный
кисспептин-10Phoenix Pharmaceuticals, Берлингейм, Калифорния, СШАT-048-56Радиоактивный
несфатин-1Phoenix Pharmaceuticals, Берлингейм, Калифорния, СШАT-003-26Радиоактивный
PYY3-36Phoenix Pharmaceuticals, Берлингейм, Калифорния, СШАT-059-02 радиоактивный
Соматостатин-28Phoenix Pharmaceuticals, Берлингейм, Калифорния, СШАT-060-16 радиоактивный
ZORBAX Rapid Resolution HT SB-C18 колонкаAgilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США822700-9022,1 мм x 50 мм, 1,8 &; m
Agilent 1200 LC Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, СШАВЭЖХ, несколько компонентов, поэтому нет единого каталожного номера
Kisspeptin  RIAPhoenix Pharmaceuticals, Берлингейм, Калифорния, СШАRK-048-56Радиоактивный
общий грелин RIAMillipore, Биллерика, Массачусетс, США# GHRT-89HK радиоактивный
Активный грелин RIAMillipore, Billerica, MA, США# GHRA-88HKRadioactive
SigmaStat 3.1Systat Software, Сан-Хосе, Калифорния, СШАонлайн скачать
#

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Finucane, M. M., et al. National, regional, and global trends in body-mass index since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 960 country-years and 9.1 million participants. Lancet. 377 (9765), 557-567 (2011).
  2. James, W. P. The epidemiology of obesity: the size of the problem. J Intern Med. 263 (4), 336-352 (2008).
  3. Stengel, A., Taché, Y. Gastric peptides and their regulation of hunger and satiety. Curr Gastroenterol Rep. 14 (6), 480-488 (2012).
  4. Hussain, S. S., Bloom, S. R. The regulation of food intake by the gut-brain axis: implications for obesity. Int J Obes (Lond). 37 (5), 625-633 (2013).
  5. Hosoda, H., et al. Optimum collection and storage conditions for ghrelin measurements: octanoyl modification of ghrelin is rapidly hydrolyzed to desacyl ghrelin in blood samples). Clin Chem. 50 (6), 1077-1080 (2004).
  6. Stengel, A., et al. The RAPID method for blood processing yields new insight in plasma concentrations and molecular forms of circulating gut peptides. Endocrinology. 150 (11), 5113-5118 (2009).
  7. Stengel, A., et al. Lipopolysaccharide differentially decreases plasma acyl and desacyl ghrelin levels in rats: Potential role of the circulating ghrelin-acylating enzyme GOAT. Peptides. 31 (9), 1689-1696 (2010).
  8. Stengel, A., et al. Cold ambient temperature reverses abdominal surgery-induced delayed gastric emptying and decreased plasma ghrelin levels in rats. Peptides. 31, 2229-2235 (2010).
  9. Stengel, A., et al. Central administration of pan-somatostatin agonist ODT8-SST prevents abdominal surgery-induced inhibition of circulating ghrelin, food intake and gastric emptying in rats. Neurogastroenterol Motil. 23 (7), e294-e308 (2011).
  10. Stengel, A., et al. Abdominal surgery inhibits circulating acyl ghrelin and ghrelin-O-acyltransferase levels in rats: role of the somatostatin receptor subtype 2. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 301, G239-G248 (2011).
  11. Wang, L., et al. Intravenous injection of urocortin 1 induces a CRF2 mediated increase in circulating ghrelin and glucose levels through distinct mechanisms in rats. Peptides. 39, 164-170 (2013).
  12. Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Wang, L., Taché, Y. Orexigenic response to tail pinch: role of brain NPY(1) and corticotropin releasing factor receptors. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (3), R164-R174 (2014).
  13. Goebel, M., Stengel, A., Wang, L., Reeve, J., Taché, Y. Lipopolysaccharide increases plasma levels of corticotropin-releasing hormone in rats. Neuroendocrinology. 93 (3), 165-173 (2011).
  14. Banfi, G., Salvagno, G. L., Lippi, G. The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes. Clin Chem Lab Med. 45 (5), 565-576 (2007).
  15. Stengel, A., Wang, L., Goebel-Stengel, M., Taché, Y. Centrally injected kisspeptin reduces food intake by increasing meal intervals in mice. Neuroreport. 22 (5), 253-257 (2011).
  16. De Bond, J. A., Smith, J. T. Kisspeptin and energy balance in reproduction. Reproduction. 147 (3), R53-R63 (2014).
  17. Wren, A. M., et al. Ghrelin enhances appetite and increases food intake in humans. J Clin Endocrinol Metab. 86 (12), 5992(2001).
  18. Schulman, J. L., Carleton, J. L., Whitney, G., Whitehorn, J. C. Effect of glucagon on food intake and body weight in man. J Appl Physiol. 11 (3), 419-421 (1957).
  19. Steinert, R. E., Poller, B., Castelli, M. C., Drewe, J., Beglinger, C. Oral administration of glucagon-like peptide 1 or peptide YY 3-36 affects food intake in healthy male subjects. Am J Clin Nutr. 92 (4), 810-817 (2010).
  20. Dewan, S., et al. Effects of insulin-induced hypoglycaemia on energy intake and food choice at a subsequent test meal. Diabetes Metab Res Rev. 20 (5), 405-410 (2004).
  21. Schlogl, M., et al. Increased 24-hour ad libitum food intake is associated with lower plasma irisin concentrations the following morning in adult humans. Appetite. 90, 154-159 (2015).
  22. Heymsfield, S. B., et al. Recombinant leptin for weight loss in obese and lean adults: a randomized, controlled, dose-escalation trial. JAMA. 282 (16), 1568-1575 (1999).
  23. Shimizu, H., et al. Peripheral administration of nesfatin-1 reduces food intake in mice: the leptin-independent mechanism. Endocrinology. 150, 662-671 (2009).
  24. Batterham, R. L., et al. Inhibition of food intake in obese subjects by peptide YY3-36. N Engl J Med. 349 (10), 941-948 (2003).
  25. Shibasaki, T., et al. Antagonistic effect of somatostatin on corticotropin-releasing factor-induced anorexia in the rat. Life Sci. 42 (3), 329-334 (1988).
  26. Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Taché, Y., Reeve, J. R. Jr The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides. Anal Biochem. 414 (1), 38-46 (2011).
  27. Smets, E. M., et al. Decreased plasma levels of metastin in early pregnancy are associated with small for gestational age neonates. Prenat Diagn. 28 (4), 299-303 (2008).
  28. Kojima, M., et al. Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach. Nature. 402 (6762), 656-660 (1999).
  29. Stengel, A., Yin Taché, Y., Yang, the Gastric X/A-like Cell as Possible Dual Regulator of Food Intake. J Neurogastroenterol Motil. 18 (2), 138-149 (2012).
  30. Inhoff, T., et al. Desacyl ghrelin inhibits the orexigenic effect of peripherally injected ghrelin in rats. Peptides. 29, 2159-2168 (2008).
  31. Hirayama, H., et al. Contrasting effects of ghrelin and des-acyl ghrelin on the lumbo-sacral defecation center and regulation of colorectal motility in rats. Neurogastroenterol Motil. 22 (10), 1124-1131 (2011).
  32. Horikoshi, Y., et al. Dramatic elevation of plasma metastin concentrations in human pregnancy: metastin as a novel placenta-derived hormone in humans. J Clin Endocrinol Metab. 88 (2), 914-919 (2003).
  33. Yang, Y. U., Xiong, X. Y., Yang, L. I., Xie, L., Huang, H. Testing of kisspeptin levels in girls with idiopathic central precocious puberty and its significance. Exp Ther Med. 9 (6), 2369-2373 (2015).
  34. Hosoda, H., Kojima, M., Matsuo, H., Kangawa, K. Ghrelin and des-acyl ghrelin: two major forms of rat ghrelin peptide in gastrointestinal tissue. Biochem Biophys Res Commun. 279 (3), 909-913 (2000).
  35. Raff, H. Total and active ghrelin in developing rats during hypoxia. Endocrine. 21 (2), 159-161 (2003).
  36. Evans, M. J., Livesey, J. H., Ellis, M. J., Yandle, T. G. Effect of anticoagulants and storage temperatures on stability of plasma and serum hormones. Clin Biochem. 34 (2), 107-112 (2001).
  37. Nabuchi, Y., Fujiwara, E., Kuboniwa, H., Asoh, Y., Ushio, H. The stability and degradation pathway of recombinant human parathyroid hormone: deamidation of asparaginyl residue and peptide bond cleavage at aspartyl and asparaginyl residues. Pharm Res. 14 (12), 1685-1690 (1997).
  38. White, A., Handler, P., Smith, E. L. Principles of Biochemistry. , 5th ed, McGraw-Hill Book Co. New York. (1973).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Peptide RecoveryProtease InhibitionAcidificationDilutionRadioimmunoassayHPLC AnalysisPeptide DegradationAcyl Ghrelin

Похожие статьи