Методическая статья

Glycan Узел Анализ: снизу вверх подход к Glycomics

DOI:

10.3791/53961

⸱

22 мая 2016 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, The Biodesign Institute – Center for Personalized Diagnostics, Arizona State University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье представлена усовершенствованная форма нового метода гликомики снизу вверх, предназначенного для анализа объединенного композиционного профиля гликанов в нефракционированных биожидкостях путем химического распада гликанов на составляющие их моносахариды, специфичные для связывания, для обнаружения с помощью ГХ-МС. Потенциальное применение включает раннее выявление рака и других гликан-аффективных расстройств.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Синтезируемые ферментами, называемыми гликозилтрансферазами, гликаны являются ключевыми игроками в различных значимых внутри- и внеклеточных событиях. Многие патологические состояния, особенно рак, влияют на экспрессию генов, что, в свою очередь, может нарушить относительную численность и уровни активности гликозидгидролазы и ферментов гликозилтрансферазы. Уникальные аберрантные цельные гликаны, образующиеся в результате дерегуляции гликозилтрансферазы, часто присутствуют в следовых количествах в сложных биожидкостях, что затрудняет их обнаружение, а иногда и стохастичено. Тем не менее, при правильной пробоподготовке одна из старейших форм масс-спектрометрии (газовая хроматография-масс-спектрометрия, ГХ-МС) может регулярно обнаруживать скопление моносахаридов, специфичных для точки ветвления и сцепления («гликановых узлов»), присутствующих в сложных биожидкостях. В дополнение к традиционным методам нисходящей гликомики, обсуждаемый здесь подход включает в себя сбор и конденсацию каждого составляющего гликанового узла в образце в единый независимый аналитический сигнал, который предоставляет подробную структурную и количественную информацию об изменениях гликома в целом и выявляет потенциально нерегулируемые гликозилтрансферазы. Усовершенствования перметилирования и последующих стадий экстракции жидкость/жидкость, представленные в настоящем документе, улучшают воспроизводимость и общий выход продукции за счет обеспечения минимального воздействия перметилированных гликанов на щелочные водные условия. Модификации стадии ацетилирования еще больше увеличивают степень реакции и общий выход. Несмотря на воспроизводимость, показано, что общий выход N-ацетилгексозамина (HexNAc) частично перметилированных альдитолацетатов (PMAA) по своей природе ниже их ожидаемого теоретического значения по сравнению с гексозой PMAA. Вычисление отношения площади под экстрагированной ионной хроматограммой (XIC) для каждой отдельной гексозы PMAA (или HexNAc PMAA) к сумме таких областей XIC для всех гексоз (или HexNAcs) обеспечивает новый метод нормализации, который облегчает относительное количественное определение отдельных гликановых узлов в образце. Несмотря на то, что в настоящее время этот метод ограничен с точки зрения абсолютных пределов обнаружения, он ускоряет анализ клинических биожидкостей и показывает значительные перспективы в качестве дополнительного подхода к традиционной гликомике сверху вниз.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гликолипиды, гликопротеины, протеогликаны и гликозаминогликаны представляют собой четыре основных класса сложных гетерогенных углеводов под общим названием гликанов. Как вездесущие и неотъемлемыми компонентами плазматической мембраны, гликокаликсом и внеклеточного матрикса и жидкостей, гликаны принять участие в таких разнообразных биохимических процессов как эндоцитоза, внутриклеточного транспорта, подвижности клеток, трансдукции сигнала, молекулярного распознавания, активации рецептора, клеточной адгезии, хозяин-патоген взаимодействия , связь, иммунологического и иммунной инициация межклеточное ответ. 1 Present почти в каждой области жизни, ферменты , известные как гликозилтрансферазами , которые строят гликанов полимеры действуют в тандеме с гликозидных гидролаз (также известный как гликозидазы, расщепляющих гликаны) построить, реконструируют, и в конечном счете производят окончательно гликанов полимеров 2. Хотя каждая гликозилтрансферазу может работать на разных гликоконъюгатами, гликозилтрансферазукак правило , кует linkage- и аномера специфические гликозидной связь путем передачи моносахаридную фрагмент определенного активированного нуклеотидного сахарного донора (например, ВВП-фукозы) к определенной категории нуклеофильных акцепторов (например, липидами, полипептида, нуклеиновой кислоты, или растет олигосахарид). Было подсчитано , что более 50% белков (особенно мембранных и секреторных белков) являются посттрансляционно модифицированный гликозилирования 3 Элементарные комбинаторные расчеты дают высокую оценку значительной изменчивости, универсальности и специфичности, оказанное гликопротеинов гликозилирования. например, если полипептид субстрат имеет только 10 сайтов гликозилирования , и каждый узел может образовывать гликозидной связи с 1 из только 3 -х различных моносахаридов восстанавливающих концах, то, теоретически, окончательный гликопротеин можно предположить , 3 10 = 59049 отличные тождества. В гликопротеинов, гликозидных связей обычно образуют с боковой цепи азота OF аспарагина в последовательности Asn-X-Ser / Thr , (Х может быть любой аминокислотой , за исключением пролина) с получением N -glycans 2 и боковой цепи гидроксильные группы серина и треонина с получением O -glycans 4. Состав glycome содержимым ячейки (то есть, его дополнение гликозилирования продуктов) является уникальным и ограниченным , потому что, за немногими исключениями, гликозилтрансфераз проявляют строгую донор, акцептор, и рычажный специфичность. 5 Важные и обильные плазмы крови гликопротеинов страдают аномальным гликозилирование как нижестоящий следствие аномальной экспрессии гликозилтрансферазной и активности из - за многих патологических состо ний , особенно рака и воспалительных заболеваний. 6-24

В основном за счет эпигенетических факторов glycome значительно более разнообразным, динамичным и сложным , чем протеома и транскриптом. 25,26 В то время как примерно 1% генома млекопитающих кодирует образование, модификацию исборка гликанах, 27 гликозилирования протекает в нешаблонном-ориентировкой-заметному отличие от полипептида и биосинтез нуклеиновых кислот. Взаимодействие между относительного количества и активности ферментов гликозилирования и таких экологических факторов , как питательных веществ и прекурсоров доступности в конечном счете , определяет характер, скорость и степень гликозилирования. 5,28 эмбриогенез (например, определение и дифференциация), клеточная активация, и прогрессия через экспрессия гена влияния клеточного цикла (т.е., транскрипции и трансляции) и изменить характер и количество доступных гликозилтрансферазами, чья активность является непосредственным фактором , определяющим перед гликановой профилем клетки. Потому что (некоторые) пролиферативные, клей и инвазивные свойства раковых клеток напоминают обычные эмбриогенные клетки, специфические изменения в гликанов биосинтетических путей (например, накопление предшественника, дерегулирование экспрессии, aberranт модификация, структурная усечение, или роман формирования) служат универсальные биомаркеры рака , которые указывают на различные этапы формирования опухоли, прогрессии, миграции и инвазии 29 Хотя гликозилирования является очень сложным, очевидно , лишь немногие изменения в гликозилирования могут позволить канцерогенеза и метастазирования. по- видимому, некоторые "аномальным" гликозилирования продукты действительно выгоду раковые клетки, позволяя им уклоняться от иммунной признания и выжить требования миграции в негостеприимных внутрисосудистых и метастатических средах. 28,30,31 Не удивительно, что эксперименты показали , что нарушения или предотвращения моделей изменены экспрессии генов и аберрантное гликан образование может остановить туморогенез. 29 Тем не менее, отклоняющиеся гликаны , обнаруженные в биожидкости образце (например, моча, слюна, и плазмы крови или сыворотки) не могут быть прямыми индикаторами рака (или другое заболевание), а скорее вниз по течению результаты тонкий, но значительнаяизменения в иммунной системе или количественному разветвлений пагубного состояния в непредсказуемом органе. 32

Несмотря на то, что они обеспечивают универсальную информацию о glycome, много молекулярных методов взаимодействия на основе glycomics (например, лектин / массивы антител и метаболические / ковалентную маркировка) зависит от обнаружения целых структур гликанов и не обеспечивают подробную структурную информацию об отдельных гликанов. В противоположность, масс-спектрометрия (МС) может помочь идентифицировать и количественно отдельных гликанов структур и выявить такую ​​структурную информацию в качестве крепежных участков к полипептидных сердечников. Дерегулируемых экспрессию или активность только одного гликозилтрансферазы может инициировать каскад вредных молекулярных событий в нескольких путей гликозилирования. Поскольку каждый гликозилтрансферазу может работать на более чем одной гликоконъюгации подложки и в различных растущих гликанов полимеров, дерегулирование биосинтетические каскады выход disproporционно повышенное количество только одного гликановой продукта , но несколько разнородных классов аберрантных гликанов в интра- или внеклеточных жидкостей. 33 Тем не менее, такие уникальные аберрантных гликаны иногда считается непрактичным в качестве биомаркеров для рака или других гликанов-аффективных патологий , так как , по сравнению с большим бассейном хорошо регулируется гликаны, эти отклоняющиеся гликаны представляют собой очень малую часть, которая часто может оставаться незаметного даже такими высокочувствительными методами, как масс-спектрометрии. Например, в внутри- и внеклеточной жидкости организма, спектр широкого белка концентрация (которая охватывает восемь порядков) может предотвратить обнаружение дефицитных гликопротеинов, которые замаскированы более распространенных видов. 32 Кроме того, определение гликозилтрансферазной активности остается значительным практическим и теоретическая проблема , потому что многие гликозилтрансферазы отсутствуют в клинических biofluids или становятся неактивными ех естественных условиях. Несмотря на всю сложность состоялоTLY обнаружения и количественной оценки ультра-малых количеств уникальных целых гликанах, практиков масс-спектрометрии добились огромных успехов в направлении применения нетронутыми гликаны как клинических маркеров. Недавно мы разработали дополнительный подход к анализу интактных гликанов, что, используя GC-MS, облегчает обнаружение всех учредительного точку ветвления и рычажный специфических моносахаридов ( "гликановые узлов"), которые в совокупности придают пищевым уникальность каждого Гликан и во многих случаи непосредственно служат в качестве молекулярных суррогаты, которые количественно относительную активность виновном гликозилтрансферазы (ов).

Так как его впервые сообщили непосредственное применение к гликановой анализу в 1958 году, газовой хроматографии (ГХ) доказала мощный метод для анализа каждого-метилированных моно- и дисахаридов, 34 определяют их anomericity и абсолютную конфигурацию, и отделить их для последующего масс - спектрометрического анализа. 35 В период с 1984 по 2007, Ciucanu и коллегвведена и уточнена твердофазного технику Гликан permethylation, применяемому гидроксид натрия и йодистый метил, а затем путем экстракции жидкость / жидкость перметилированных гликанов с использованием воды и хлороформа. 35,36 В период с 2005 по 2008 год, Кан и его коллеги интегрировали экономии времени спин -column подход в стадию permethylation. 37,38 в 2008 году исследовательская группа Гетц разработал количественную твердофазного permethylation методом гликан-профилирование с помощью матричной лазерной десорбцией-ионизацией (MALDI) масс - спектрометрии для сравнения и потенциально различать инвазивной и не -invasive клетки рака молочной железы; 39 затем, в 2009 году команда Гетц в сочетании ферментативная и методы химического высвобождения расщеплять O -glycans из неповрежденных гликопротеинов в сильно щелочном схеме permethylation твердофазного 40 Хотя процедура Гетц способствовала одновременно permethylation и высвобождения химических реагентов. из -glycans O, он был применен только к предварительно изолированных Glycoбелки. Мы модифицировали эту методику в 2013 году и адаптировать его для целых нефракционированного biofluids и образцов гомогенизированных тканей путем включения трифторуксусной кислоты (ТФК) гидролиз, восстановление и ацетилирование шаги. 33 Эти дополнительные шаги также выпуск гликаны из гликолипидов и N -связанной гликаны из гликопротеинов и конвертировать их в частично метилированных полиолов ацетатов (PMAAs, рисунок 1), чьи отличительные узоры метилирования и-ацетилирование облегчают анализ с помощью ГХ-МС и однозначно характеризуют составляющие гликанов узлы в оригинальной неповрежденной гликановой полимера 41 (рисунок 2). 33 в конечном счете, это процедура производит композиционный портрет всех гликанов в сложном биожидкости основанный на прямом, относительной количественной оценки уникальных гликанов функций, таких как «ядро фукозилирования», «6-сиалилирования", "рассекает GlcNAc" и "бета-1-6 ветвление" - каждый полученный из одного ГХ-МС chromatograpик пика. В данной статье представлены дальнейшую оптимизацию permethylation, ацетилирование, изоляцию и очистке этапы наряду с улучшениями в режиме относительной количественной оценки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внимание: Избегать контакта с кожей / зрительный контакт с любым из реагентов , используемых в этом эксперименте. После экспозиции, тщательно промойте пораженный участок водой и немедленно обратитесь к врачу.

1. Permethylation и Glycan Добыча

  1. Подготовка колонки
    1. Получить как можно больше единиц микрофужную спина столбцов в качестве образцов для анализа. Перерыв и снять пластиковые колпачки трубки коллектора. Поместите микроцентрифуге мини-фильтр в каждой трубке коллектора. Поместите собранные микроцентрифуге спиновые столбцы (содержащие мини-фильтры) в стойку пробирке.
    2. Получают запас гидроксида натрия (NaOH) шарики (20-40 меш). Передача некоторое NaOH в небольшой лодке весом или, если влажность вызывает образование комков, горячий фарфоровой ступке в качестве рабочего запаса NaOH. Избегайте использования комки NaOH или измельченных / порошковое бусин NaOH.
      Внимание: NaOH является сильным токсином и коррозионное основание. Промывать открытые участки кожи / глаза водой в течение 15 мин. ThorougHLY очистить рабочее место после завершения эксперимента.
    3. С помощью небольшой совок или шпатель, передавать NaOH бусин из рабочего запаса для заполнения микроцентрифуге мини фильтров с помощью NaOH до первой наружной фаской (~ 5 мм ниже краёв). Нажмите заполненные микроцентрифуге фильтры на стендовом для упаковки / конденсироваться бусинки NaOH.
      Примечание: На протяжении всего этого эксперимента, чтобы свести к минимуму чрезмерного адсорбции воды с помощью гигроскопических NaOH бусин, поддерживать уровень каких - либо добавленных жидкостей (например, ацетонитрил, диметилсульфоксид, анализируемое вещество раствор) над поверхностью упаковки колонки NaOH и ограничить непосредственный контакт с воздухом.
    4. Получить запас ацетонитриле (ACN). Передача ~ 350 мкл ACN каждому NaOH упакованы микроцентрифуге мини-фильтр. Держите NaOH, погруженную под ACN и удалить большие пузырьки воздуха путем перемешивания с наконечником-гофрированные гель-погрузочной наконечником пипетки.
      Внимание: Ацетонитрил является горючим раздражителем.
    5. Колонка Центрифугирование
      1. Устройте микроцентрифуге столбцы симметрично внутри центрифуге; взвешиваем весами трубку при необходимости. Избегайте попадания каких-либо гранул NaOH в центрифуге. Закройте крышку центрифуги.
      2. Центрифуга столбцы (содержащие NaOH и ACN) в течение ~ 15 сек при 2400 × г.
      3. После завершения центрифугирования, удалить микроцентрифуге столбцы из центрифуги и отбросить ACN в контейнер опасных отходов. Держите колонку NaOH упаковки нетронутыми.
    6. Добавить ~ 350 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) в каждом NaOH, упакованные микроцентрифуге мини фильтр. Держите NaOH погружалось в ДМСО и удалить любые крупные пузырьки воздуха с наконечником пипетки. Как было описано ранее, центрифужные колонки в течение ~ 15 сек при 2400 & bull; g, и отбрасывать ДМСО при сохранении NaOH упаковки нетронутыми.
      Внимание: ДМСО является мутагенным и раздражителем и легко впитывается через кожу.
    7. Подключите все микроцентрифуге мини-фильтры с пробками, включенных в спиновый фильтрКомплект. Перенести ~ 350 мкл ДМСО каждому NaOH упакованной микроцентрифуге мини-фильтр и использовать 200 мкл пипетки, чтобы удалить пузырьки воздуха в упаковке NaOH, так что ДМСО достигает все регионы в пределах затем NaOH упаковки. Избегайте дробления или чрезмерно выскабливание бусинки NaOH; NaOH, порошок является нежелательным. Закончить этот шаг как можно быстрее.
  2. Получение контроля качества плазмы (QC) образца (ов)
    Примечание:     Для обеспечения стабильных результатов через опытных партий, рассмотреть возможность использования по меньшей мере одну аликвоту образца , взятого из большого, однородной объемной коллекции биологического материала , представляющего интерес для анализа в каждой партии. Например, если анализ плазмы крови, используют аликвоту (ы) насыпного сбора плазмы крови в качестве образца QC (ов) в каждой партии. Образцы процесса и контроля качества, таким же образом, как неизвестные образцы.
    1. Центрифуга запас образец плазмы QC в течение 4 мин при ~ 10000 × г. Во время центрифугирования, некоторые осадок высокой плотности может осесть йе дно и некоторое количество осадка с низкой плотностью может плавать на поверхности плазмы. Избегать как при удалении аликвот (ы) плазмы.
    2. Перейдите к разделу "1.3) Подготовка проб" ниже. Затем вернитесь к этому шагу после плазменного центрифугирования завершена.
    3. Вывод 9 мкл плазмы центрифугировали QC и передать его на помеченную пробирку 1,5 мл полипропилена, снабженную откидную крышкой (далее именуемые как "1,5-мл пластиковой пробирке"). Добавить 1 мкл деионизированной воды к каждой аликвоте; при желании, использовать это в качестве носителя для внутреннего стандарта (ов).
    4. Добавить 270 мкл ДМСО для этого контроля плазмы. Вихревой чтобы обеспечить полное растворение.
  3. Базовые приготовления
    1. Получить как можно больше 1,5 мл пластиковые пробирки, как число биологических (аналита) образцов.
    2. Передача 9 мкл каждого биологического (аналита) образца в соответствующий 1,5 мл пластиковую пробирку. Передача 1 мкл деионизированной воды и 270 мкл ДМСО для каждой пробирки.
    3. Энергично перемешать (например, вихревые и / или многократно пипетка вверх и вниз) выборки , чтобы обеспечить полное растворение в ДМСО.
      Внимание: Выполните следующие действия внутри вытяжного шкафа. Используется в следующих шагах, йодистый метил (СН 3 I), дихлорметан (CH 2 Cl 2, также известный как хлористый метилен) и хлороформ (CHCl 3, трихлорметан), представляют собой летучие жидкости , способные растворять некоторые виды пластмасс (например, перчатки из нитрила) , Обязательно используйте растворитель перчатками. Из-за их низкой вязкостью и высокой упругости паров, эти реагенты могут капать из пипетки во время передачи данных. Свести к минимуму потери реагентов и потенциального воздействия путем проведения исходного раствора, прилегающей к приемной емкости.
    4. Перенести достаточный общий объем йодистого в маленькую чистую пробирку. Каждый образец анализируемого вещества потребуется 105 мкл йодистый метил. Передача ~ 500 мкл дихлорметана в Анофэр чистую трубку. Для предотвращения засорения шприца, промойте шприц с дихлорметаном сразу же после передачи йодметана.
      Внимание: Иодметан фоточувствителен, изменчивы, и мощный токсин , способный повредить центральную нервную систему или причинение смерти при вдыхании или заглатывании. Дихлорметан является потенциальным канцерогеном, репродуктивный мутагенным и мощным раздражителем способны повредить несколько органов или причинение смерти.
    5. Используйте аналитический шприц, чтобы добавить 105 мкл йодметан для каждого образца анализируемого вещества. Cap анализируемые трубки немедленно свести к минимуму иодметана испарения. Тщательно вихрем и, при необходимости, на короткое время центрифужные все образцы, чтобы гарантировать, что жидкость не остается в крышке. Любое изменение цвета (например, до коричневого цвета, фиолетовый или желтый) сигнализирует о деградации иодметана, что может поставить под угрозу следующую реакцию permethylation.
    6. Ополосните аналитический шприц, используемый для передачи йодметан дихлорметаном по меньшей мере, 3 раза. Это позволит предотвратить его сюдам засорение. Утилизировать этого полоскание, наряду с дополнительным йодметана и дихлорметаном в органических отходов судна опасных. Поместите используемые пробирки в контейнер для опасных отходов.
    7. Получить новый набор 2-мл пластиковых труб коллектора. Удалить оснастку крышки, если это необходимо.
    8. Отключите микроцентрифуге мини-фильтры. Центрифуга Unplugged колонки в течение 15 сек при 2400 × г, а затем выбросить в резервуар трубки вместе с ДМСО стоков.
    9. Повторно подключить Центрифугированный спиновые столбцы, и поместить их в новых пластовых труб. Число каждый спин колонки и соответствующий резервуар трубки с тем же самым номером образца. Убедитесь в том, что мини-пробки фильтра затянуты; потенциально возможные утечки может воздействовать на следующий шаг. Сведение к минимуму время между удалением ДМСО от спиновых колонн и переноса образцов анализируемого вещества на спиновых колонках.
    10. Permethylation
      1. Количественно передачи каждого образца раствора в соответствующий NaOH-бусинка заполненном микрофужную спина соlumn. Используйте 1000 мкл кончиком пипетки для этого шага. После переноса обжимной ~ 2 мм от конца наконечника 200 мкл и оставить его в содержимом столбца, чтобы использовать в качестве мешалки. Повторите эти действия для всех образцов.
        Примечание: Низкая вязкость йодометаном может привести к потере образца , так как раствор анализируемого вещества может капать из кончика пипетки во время передачи данных . Удерживая трубку образца и столбец спиновый соседствуют друг с другом с одной стороны, и быстро передавать раствор образца с другой стороны.
      2. Оставляют реакционную смесь permethylation протекать в течение 11 мин. Перемешать каждый образец по меньшей мере, 4-5 раз в течение этого периода. Для повышения эффективности permethylation, которое происходит на поверхности NaOH бусин, используют наконечник извитых гелевые загрузкой пипеток, как мешалка, чтобы аккуратно перемешать содержимое колонки. Агрессивное смешивание может проколоть спиновый фильтр, распылить и приостановить NaOH шарики (которые могут снизить эффективность последующей жидкости / жидкостной экстракции), и / или привести к потере образца (как саmple пропитанный NaOH гранулы могут переливаться из колонки).
      3. В процессе подготовки к последующей стадии экстракции в системе жидкость / жидкость, приготовить достаточное количество 0,5 М раствора хлорида натрия (NaCl) в фосфатном буфере 0,2 М натрия (рН 7,0), чтобы хранить при комнатной температуре. Каждый образец потребует в общей сложности ~ 12 мл раствора NaCl для всех трех циклов экстракции в системе жидкость / жидкость.
      4. По завершении 11-минутного периода permethylation, сразу же осторожно отсоединив колонны и отцентрифугированы в течение 15 сек при 2400 х г. Выбросите пробки.
    11. Немедленно удалите спиновые столбцы из центрифуги и поместите их в новый набор пустых трубок спинового резервуара, в результате чего проточный раствор, содержащий свеже перметилированные гликаны позади. Ничего не выбрасывайте.
    12. Как можно скорее, добавить 300 мкл ацетонитрила (ACN) к сухим, NaOH заполненных спиновых фильтров. Центрифуга спиновых фильтров в течение 30 секунд при 9,600 × г.
    13. Immediatelу после этого перенести основное решение permethylation (то есть решение , которое инкубировали с гранулами NaOH в течение 11 мин , затем прядильный через спиновый фильтр в центрифужную пробирку перед добавлением 300 мкл ACN в предыдущем шаге) к силанизированы 13 х 100 мм стеклянные пробирки , содержащие 42 3,5 мл 0,2 М фосфатного буфера натрия , содержащего 0,5 М NaCl, рН 7,0 и перемешать (вихревой) немедленно. Избегайте передачи каких-либо твердых белого остатка на этом этапе. Сделайте это для каждого образца прежде чем перейти к следующему шагу.
    14. Без задержек, передача (скомбинировать) ACN спин-через в каждой трубке коллектора к (с) остальной части жидкого образца в соответствующей силанизированном стеклянной трубки и сразу перемешать (вихрь). Опять же, избежать переноса каких-либо твердых белого остатка на этом этапе. Cap, трясти, и вихревая стеклянная трубка. Повторите эти действия для каждого образца. Откажитесь колонны NaOH и пипетки Пастера в соответствующих контейнеров для отходов.
  4. Жидкость / Жидкость Extraфикция и Glycan Очистка
    1. Внутри вытяжкой, добавьте 1,2 мл хлороформа к каждому образцу. Сразу же после этого, крышка Силанизированные стеклянные трубки и энергично перемешать содержимое.
    2. Предварительно разогрейте металлические блоки до приблизительно 75 ° С в испарительную коллекторе. Использование нагревательных блоков с колодцами, которые могут вместить 13 × 100 мм стеклянных трубок.
    3. Получить новый набор силанизированы пипетки Пастера, без силанизированы пипетки Пастера и силанизированы стеклянные пробирки с крышками.
      Внимание: Хлороформ (CHCl 3) является раздражителем, мутаген, и потенциальным канцерогеном способные проникать через некоторые типы перчаток.
    4. Кратко центрифуга (~ 3000 × г) образца, содержащего стеклянные трубки для разделения водного и органического слоев.
    5. Использовать не силанизированы пипетку Пастера, чтобы извлечь достаточно верхнего водного слоя таким образом, что ~ 3 мм водного слоя остается выше нижнего органического слоя.
    6. Добавить 3,5 мл 0,5 М NaCl раствор в фосфатном буфере 0,2 М натрия (рН 7) в каждой стеклянной трубки, энергично перемешать, и кратко центрифуге (~ 3000 × г). Как и в предыдущем шаге (1.4.3), использовать не-силанизированы пипетки Пастера для извлечения водного слоя.
    7. Повторите предыдущий шаг (1.4.4), но оставить ~ 1 мл водного слоя.
    8. Используйте чистую силанизированы пипетки Пастера перенести органический слой на чистую и надлежащим образом маркированных силанизированы 13 × 100 мм стеклянную пробирку. Во избежание загрязнения водной экстракцией следующим образом:
      1. Возьмитесь обеими руками за текущие и новые тестовые силанизированы стеклянные трубки рядом друг с другом в одной руке. С другой стороны, нажмите пипетку лампу для создания пузырьков при вставке пипеткой вниз через водный слой.
      2. Оказавшись внутри органического слоя, прекратить создавать пузыри, и держать пипетку лампу устойчивый, чтобы органические и водные слои, чтобы стабилизировать и отделить снова. Затем медленно отпустите лампу, чтобы снять, как большая часть органиC слой, насколько это возможно без какого-либо водного загрязнения.
      3. Быстро поднимите наконечник пипетки через водный слой, и сопротивление естественному рефлекс слегка отпуская лампу (что приводит к снятии некоторых водного загрязнения), поднимая пипетку из трубки.
      4. Быстро передавайте органический слой маловязкую к смежной новой трубки. Любой водный загрязнение будет выражаться в виде мелких капель жидкости в верхней части извлеченного органического слоя в новых стеклянных трубок. Если водный / загрязнение NaCl видна, удалите его с помощью пипетки; центрифугировать при необходимости объединить водяных капель в одну каплю.
    9. Утилизировать старые стеклянные пробирки, пипетки, а также водные и растворов органических отходов. Мытье и утилизация стеклянной трубки крышки.
    10. Сушат все образцы под слабым и постоянном токе азота в разогретую до испарения коллектора при 75 ° С в течение ~ 5 мин внутри вытяжном шкафу. Для обеспечения испарительного охлаждения в течение всего сухого вниз STEпс, нежный и постоянный поток азота должен нарушить поверхность жидкости без разбрызгивания или разбрызгивание жидкости. Удалить образцы из коллектора испарения при полной сушки конечного образца. Белые пятнышки на дне высохшего стеклянных трубок указывают на загрязнение буфера / NaCl.
    11. Пауза процедуру здесь, если не оставаясь в день достаточно времени, чтобы закончить стадию гидролиза TFA. Временно (то есть, в течение ночи) хранения сухих образцов при -20 ° С. Для того, чтобы продолжить процедуру после хранения, извлеките образцы из -20 ° C морозильника и дать им возможность полностью прогреть перед тем распечатывания.
    12. В то время как образцы тепло, в рамках подготовки к трифторуксусной кислоты (ТФУ) гидролиза (следующий этап), установите колбонагревателя таким образом, чтобы температура жидкого содержимого пробирки достигнет 121 ° С. Приготовьте раствор TFA от TFA запаса (см Шаг 2.1 ниже).

2. трифторуксусная кислота (ТФК) Гидролиз

Внимание: трифторуксусная кислота (ТФК) представляет собой едкое вещество органической кислоты и токсичные раздражителем.

  1. Подготовьте достаточное количество 2,0 М раствора TFA в деионизированной воде. Каждый образец анализируемого вещества потребуется 325 мкл 2,0 М раствора ТФК. Концентрированный ТФК 13,0 M.
  2. Добавить 325 мкл 2,0 М TFA для каждого образца анализируемого вещества. Для предотвращения TFA испарения и потери пробы в ходе последующей стадии сушки (2.3 ниже), плотно колпачок каждую пробирку сразу после добавления ТФК. Отметить уровень раствора во всех стеклянных трубок. Vortex каждый образец тщательно перед следующей стадией.
  3. Инкубируйте плотно блокированы пробирки с образцами в течение 2 ч в подходящем нагревательном блоке предварительно нагретую печь или таким образом, что содержимое доводится до температуры 121 ° С. При использовании нагревательного блока вместо духовки, накройте образец трубки с алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить конденсацию TFA в верхней части трубы и частичной сушки осадка образца в нижней части трубы. Проверьте уровень раствора образца после 20-30 мин.чтобы обеспечить минимальное испарение ТФК. При необходимости затянуть колпачки дополнительно или заменить колпачки для более плотного прилегания.
  4. В течение 2-часового ожидания, установки другого испарения коллектора до 75 ° С в течение следующего шага (см 2.4 ниже).
  5. Когда 2-часовой период нагрева завершена, сухих образцов при 75 ° С при слабом токе газообразного азота в течение ~ 15 мин. Не оставляйте без присмотра образцы в течение более 15 мин. Часто проверяйте образцы, и прекратить нагревание и сушку, когда все образцы являются сухими.
  6. Пауза процедуру здесь, если не оставаясь в день достаточно времени, чтобы закончить стадию восстановления. Временно (т.е. в течение ночи) образцы хранят при -80 ° С. Для того, чтобы продолжить процедуру после хранения, извлеките образцы из -80 ° C морозильнике, и дать им возможность полностью прогреть перед тем распечатывания.

3. Уменьшение

  1. Внутри вытяжном шкафу, подготовить достаточное количество 10 г боргидрида а / л натрия (NaBH 4) раствор в 1 М ammoniгидроксид мкм (NH 4 OH). Каждый образец потребует 475 мкл этого раствора. Сделайте свежее решение для каждой партии образцов. Концентрированный гидроксид аммония (27-30% вес / вес NH 3) составляет приблизительно 14,5 М.
    Внимание: Натрия боргидрид (NaBH 4) представляет собой гигроскопичный, реагирующее с водой токсин и мощным раздражителем , что выбросы-при контакте с водой сильно горючий паров , которые вызывают серьезные ожоги при контакте вдыхания, проглатывания, или глаз / кожи.
    Внимание: гидроксид аммония (NH 4 OH) является коррозионное раздражителем и токсин способен вызвать серьезные ожоги и необратимого повреждения органов при контакте вдыхания, проглатывания, или глаз / кожи. Промойте пораженные участки с водой в течение 30 мин, и предотвратить жертвы от трения или царапать пораженные участки.
  2. Для каждого образца, добавьте 475 мкл 10 г / л NaBH 4 в 1 М NH 4 OH. Образцы тщательно перемешать, чтобы растворить все остатки. Пробирки Cap ипозволяют восстановительную реакцию продолжать в течение 1 часа.
  3. В течение 1-часового ожидания, установите испарительный коллектор до 75 ° С с подогревом. Используйте нагревательный блок с соответствующими скважинами для стеклянных трубок (см 3.4 ниже).
  4. Когда период реакции 1-ч завершена, добавляют 63 мкл метанола (MeOH) в каждом образце. Этот шаг и следующий шаг удаления остаточного бора в виде триметилбората - относительно летучей жидкости, которая закипает при температуре 68 ° С.
  5. Сухие образцы (в предварительно нагретом коллекторе) при 75 ° C в слабом потоке газа азота в течение ~ 15 мин. Часто проверяйте образцы и не оставляйте их без присмотра. Маленькие капельки жидкости в нижней части стеклянных трубок указывают на то, что образец еще не высохнет.
    Примечание: Чтобы отличить пузырьки воздуха из капель жидкости, наклоняя пробирку. Только капли жидкости будут двигаться после наклона, но обратное не всегда верно: если пузырь не двигается, он все еще может быть (очень маленький) капля жидкости.
  6. После того, как SAMPLЕ. С. абсолютно сухие, готовят 9: раствор 1 (об / об) метанола (MeOH) и уксусной кислоты (AcOH). Добавить 125 мкл этого MeOH: AcOH решение каждого образца.
  7. Сухие образцы (в предварительно нагретом коллекторе) при 75 ° С при слабом токе газообразного азота.
  8. Когда образцы полностью высохли, сушат под вакуумом образцы в течение 20 мин при комнатной температуре: Место образцы в пластиковый вакуумный бак (например, продаваемые FoodSaver), закройте вакуумной крышкой, установите вакуумный регулятор для "вакуума," Подключение вакуумный шланг и включите вакуум. Чтобы разобрать вакуум, обратить вспять эти шаги. Подождите, пока система полностью распаковывать, прежде чем пытаться открыть крышку вакуумной.
  9. Пауза процедуру здесь, если не оставаясь в день достаточно времени, чтобы закончить стадию восстановления. Временно (т.е. в течение ночи) образцы хранят при -80 ° С. Для того, чтобы продолжить процедуру после хранения, извлеките образцы из -80 ° C морозильнике, и дать им возможность полностью прогреть перед тем uncappinг.
  10. Во время ожидания образцов вакуумной сухой (или теплым, после хранения), подготовить реагенты к следующему шагу. Получение и число а силанизированы коническим дном пробоотборником (AS), флакон (с крышкой) для каждого образца. Кроме того, предварительного нагрева и нагревательный блок мелководных хорошо AS-флакон и блок стекла трубки глубоко хорошо так, что содержание стеклянная трубка будет нагреваться до температуры 50 ° С.

4. Ацетилирование (Выполняется в вытяжном шкафу)

  1. Добавьте 18 мкл деионизированной воды для каждого образца. Cap и тщательно вихрь все трубы для полного растворения любых выделений.
  2. Добавить 250 мкл уксусного ангидрида в каждой стеклянной трубки. Колпачок, тщательно вихрь, и гомогенат, на водяной бане в течение 2 мин, чтобы обеспечить полное растворение любых остатков и осадков.
  3. Накройте стеклянные трубки с алюминиевой фольгой, и инкубировать при внутренней температуре 50 ° С в течение 10 мин.
  4. Добавить 230 мкл концентрированный трифторуксусной кислоты (TFA) к каждому образцу. Сразу довершениеd смешивать образцы. Затем, инкубировать образцы, покрытые алюминиевой фольгой-в течение 10 мин при внутренней температуре 50 ° С.
  5. После инкубации, добавьте 1,8 мл дихлорметана (CH 2 Cl 2) к каждому образцу. Закрывают и хорошо перемешать.
  6. Добавить 2,0 мл деионизированной воды для каждого образца. Cap и образцы хорошо перемешать. Центрифуга от 0 до 3000 х г для разделения слоев. Использовать не силанизированы пипетки Пастера для выполнения экстракции жидкость / жидкость, как описано в пункте 1.4.6, для предотвращения загрязнения воды.
  7. Повторите экстракцию еще раз, в общей сложности на двух извлечений. Используйте силанизированы пипетки Пастера перенести органический слой в маркированные силанизированы AS флаконах (надежно удерживается в стойке AS). Заполните флаконах в виде чуть ниже краев.
  8. Используйте предварительно нагретой, мелководными также нагревательный блок для сухих образцов (в ампулах) AS в течение 15 мин при 40 ° С в атмосфере газообразного азота. Не пересушивайте. Конечные продукты известны как частично метилированные ацетаты альдитов (PMAAs),

5. Газовая хроматография - масс-спектрометрия (ГХ-МС)

  1. Развести каждый образец в 100 мкл ацетона и хорошо перемешать. Используйте автосамплером вводить по 1 мкл каждого образца в режиме разделения в GC-сплит режиме вкладышем (поддерживается при 280 ° С и содержащий небольшое пробку силанизированного стекловаты). Используйте раздвоение отношение 40. Использование гелия в качестве газа-носителя в режиме постоянного потока при 0,8 мл / мин через 30-м DB-5 мс колонке GC с ID 0,25 мм и 0,25 микрон толщиной пленки.
  2. Держа начальную температуру ГХ печи при температуре 165 ° С в течение 0,5 мин. После первоначального времени удержания, программа духового шкафа, чтобы нарастить температуру, для каждого запуска, от 165 ° С до 265 ° С со скоростью 10 ° С / мин (что занимает 10 мин), а затем сразу же рампа температура 265 ° C до 325 ° с со скоростью 30 ° с / мин (которое занимает 2 мин) и поддерживают температуру при 325 ° с в течение 3 мин. Общее время работы на одном образце составляет 15,5 мин.
  3. Используйте профиPerly настроен и откалиброван масс-спектрометр, чтобы подвергать компоненты пробы, вытекающих из колонки ГХ электронной ионизации (ЭИ, 70 эВ при 250 ° C). Для масс - анализатора TOF, анализировать фрагменты из м / г 40 к м / г 800 со скоростью суммирования импульсов 0,1 сек. Установите EI-нити накала время задержки растворителя 2,5 мин.

Анализ 6. Данные

  1. При использовании масс-анализатора TOF, суммировать наиболее распространенным и / или диагностических ионов фрагмент для каждого ПМАК путем применения масс-окно 0.15 Da получить извлекаемого ионного хроматограмм. Целевые ионы для каждого ПМАК были опубликованы в другом месте, 33 но следующие изменения были сделаны: ионы трет-GLC теперь 145,1 + 205,1; 2 Человек-ионы 161,1 + 189,1; 3-Gal ионы 161,1 + 233,1, 6-Gal ионы 161,1 + 189,1 + 233,1; 2,6-Man ион 189,1; Ионы 3,6-Man являются 189,1 + 233,1.
  2. Используйте QuanLynx или другое программное обеспечение для автоматической интеграции площади пиков для каждого ПОДВЕДЕНЫ извлекаемого ионного хроматограмму.
    3. Вручную проверить результаты интеграции, рассматривая каждый интегрированный извлекаемого ионного хроматограмму. Затем экспортировать данные пика интеграции в электронную таблицу для дальнейшего анализа и нормализации данных, который включает в себя деление площади каждого отдельного гексозной Xic по сумме всех областей гексозная Xic; Подобным же образом, площадь каждого отдельного HexNAc Xic делится на сумму всех областей HexNAc Xic. Эта процедура производит нормированных содержаний для каждого отдельного гексозы и HexNAc.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ток Хроматограмма ионов общей (TIC) показывает успешный permethylation гидролиз, восстановление и ацетилирования образцов плазмы крови человека по отношению к случаям , в которых были выполнены неправильно два важных шага permethylation показаны на рисунке 3.

Абсолютный выход HexNAcs По отношению к гексоз:

N -acetylhexosam...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В целом, успешное производство частично метилированных полиолов ацетатов (PMAAs) от гексозы чревато меньшими трудностями и более надежна , чем успешного производства N -acetylhexosamine (HexNAc) PMAAs. Точный механизм этого явления позади , как он играет на каждом этапе этой процедуры неизвестна, но должна относиться к уникальной химии -он группы N (а не гидроксильной группой) , которая является уникальной для HexNAcs относительно гексоз. Механизм позади этого явления , как он относится к кислотному ги...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Колледжем свободных искусств и наук Университета штата Аризона в виде стартовых фондов лаборатории для CRB. Он также был поддержан грантом Фонда Флинна (грант No 1977) и Национальным институтом рака Национальных институтов здравоохранения под номером R33CA191110. JA была поддержана Национальным институтом общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения в рамках Программы послебаккалуреатного научного образования (PREP) под номером R25GM071798. Ответственность за содержание лежит исключительно на авторах и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Гранулы гидроксида натрия 367176Сигма-Олдрич 20-40 меш, марка реагента 97%
0,9 мл Спиновая колонка69705Pierce подразделение ThermoFisher Scientific В комплекте  пробки и полиэтиленовые фритки 
Флакон с автосамплером GC-MS (силанизированный)*C4000-9ThermoFisher ScientificTarget DP с высоким коэффициентом извлечения, 1,5  мл, 12  мм x 32  мм, в комплекте колпачки с тефлоновой подкладкой
1,5 мл полипропиленовые пробирки05-402-25ThermoFisher Scientific Крышка с защелкой
Пробирки полипропиленовые 2 мл05-408-138ThermoFisher Scientific Крышка с защелкой
Диметилсульфоксид (ДМСО)D8418Сигма-Олдрич Биореагент для молекулярной биологии, реагент марки >99,0%
Йодометан I8507Сигма-Олдрич Содержит медь в качестве стабилизатора, ReagentPlus 99%
АцетонитрилА955-4ThermoFisher Scientific Optima LC/MS
Микроцентрифуга75002436: Sorvall Legend Micro 17 CentrifugeThermoFisher Scientific Ротор 24 x 1.5/2.0 с крышкой биозащитной оболочки ClickSeal. Каталожный номер ротора: 75003424
стеклянная пробирка 13 x 100 (силанизированная)*53283-800VWR13 мм x 100 мм пробирки из боросиликатного стекла с резьбовой крышкой
Колпачки для стеклянных пробирок14-930-15DThermoFisher Scientific Kimble™ черные фенольные винтовые крышки; 13  mm-415 резьба GPI; Резиновый вкладыш с фторопластовым покрытием.
Хлорид натрия S7653Сигма-Олдрич >99,5% чистоты
Хлороформ4440-08Macron Fine Chemicals 
Трифторуксусная кислота 299537Сигма-Олдрич 99% очищено путем редистилляции для секвенирования белка 
Боргидрид натрия71321Fluka Analytical 99%
Раствор гидроксида аммония 320145Сигма-Олдрич Содержание NH3: 28,0-30,0%
МетанолAH230-4Honeywell Burdick & JacksonВЭЖХ марки
уксусной кислоты 320099Сигма-Олдрич 99,70%
Пластиковый вакуумный эксикатор Любая модель подходящего размераFoodSaver
Уксусный ангидрид 539996Сигма-Олдрич 99.50%
Дихлорметан D143SK-4ThermoFisher Научный Стабилизированный класс ВЭЖХ
Ацетон 9006-03J.T.BakerBaker Analyzed 
Испарительный коллектор с подогревом (основной блок)pi18823ThermoFisher Scientific нагрева и перемешивания Thermo Scientific* Reacti-therm*; Трехблочная модель с функцией нагрева и перемешивания
Нагретый испарительный коллектор (верхний испаритель)pi18826ThermoFisher Scientific Испаритель ThermoScientific* Reacti-VAP, 27-портовый; Для использования с трехблочным нагревательным модулем Reacti-Therm
Алюминиевые блоки-держатели образцов для испарительного коллектораpi18816ThermoFisher Scientific блок, алюминиевый, реакти-блок С-1, вмещает 13  Пробирки диаметром мм, 13 отверстий (14  мм Диаметр x 45  мм глубина)
Газовый хроматографмодели A7890Agilent Оснащен автосамплером CTC PAL
Масс-спектрометр GCT Premier (время полета)Waters 
Вкладыш сплит-режима (дезактивированный/силанизированный)5183-4647AgilentСодержит небольшую пробку из силанизированной стекловаты
DB-5ms GC колонка122-5532Agilent30 м x 0,25 мм ID x толщина пленки 0,25 мкм
Хлортриметилсилан95541Sigma-Aldrich 
Вакуумный эксикатор для стекла (для силанизации стеклянной посуды)EW-06536-30Cole-Parmerшириной 12 дюймов; размер пластины
* Силанизация стеклянной посуды осуществляется на месте, в течение ночи с использованием паров хлортриметилсилана в большом стеклянном вакуумном эксикаторе.
модуль 230 мм

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, M., Song, L., Qin, X. Glycan changes: cancer metastasis and anti-cancer vaccines. J Biosciences. 35 (4), 665-673 (2010).
  2. Stanley, P., Schachter, H., Taniguchi, N. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 8: N-Glycans(2009).
  3. Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database. Biochim Biophys Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).
  4. Brockhausen, I., Schachter, H., Stanley, P. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 9: O-GalNAc Glycans (2009).
  5. Rini, J., Esko, J., Varki, A. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 5: Glycosyltransferases and Glycan-processing Enzymes (2009).
  6. Gercel-Taylor, C., Bazzett, L. B., Taylor, D. D. Presence of aberrant tumor-reactive immunoglobulins in the circulation of patients with ovarian cancer. Gynecol Oncol. 81 (1), 71-76 (2001).
  7. An, H. J., et al. Profiling of glycans in serum for the discovery of potential biomarkers for ovarian cancer. J Proteome Res. 5 (7), 1626-1635 (2006).
  8. Kanoh, Y., et al. Changes in serum IgG oligosaccharide chains with prostate cancer progression. Anticancer Res. 24 (5B), 3135-3139 (2004).
  9. Kyselova, Z., et al. Alterations in the serum glycome due to metastatic prostate cancer. J Proteome Res. 6 (5), 1822-1832 (2007).
  10. Okuyama, N., et al. Fucosylated haptoglobin is a novel marker for pancreatic cancer: a detailed analysis of the oligosaccharide structure and a possible mechanism for fucosylation. Int J Cancer. 118 (11), 2803-2808 (2006).
  11. Zhao, J., et al. Glycoprotein microarrays with multi-lectin detection: unique lectin binding patterns as a tool for classifying normal, chronic pancreatitis and pancreatic cancer sera. J Proteome Res. 6 (5), 1864-1874 (2007).
  12. Comunale, M. A., et al. Proteomic analysis of serum associated fucosylated glycoproteins in the development of primary hepatocellular carcinoma. J Proteome Res. 5 (2), 308-315 (2006).
  13. Goldman, R., et al. Detection of Hepatocellular Carcinoma Using Glycomic Analysis. Clin Cancer Res. 15 (5), 1808-1813 (2009).
  14. Aurer, I., et al. Aberrant glycosylation of Igg heavy chain in multiple myeloma. Coll Antropol. 31 (1), 247-251 (2007).
  15. Abd Hamid, U. M., et al. A strategy to reveal potential glycan markers from serum glycoproteins associated with breast cancer progression. Glycobiology. 18 (12), 1105-1118 (2008).
  16. Kyselova, Z., et al. Breast cancer diagnosis and prognosis through quantitative measurements of serum glycan profiles. Clin Chem. 54 (7), 1166-1175 (2008).
  17. Hongsachart, P., et al. Glycoproteomic analysis of WGA-bound glycoprotein biomarkers in sera from patients with lung adenocarcinoma. Electrophoresis. 30 (7), 1206-1220 (2009).
  18. Arnold, J. N., et al. Novel glycan biomarkers for the detection of lung cancer. J Proteome Res. 10 (4), 1755-1764 (2011).
  19. Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation. Anal Chem. 82 (24), 10208-10215 (2010).
  20. Kodar, K., Stadlmann, J., Klaamas, K., Sergeyev, B., Kurtenkov, O. Immunoglobulin G Fc N-glycan profiling in patients with gastric cancer by LC-ESI-MS: relation to tumor progression and survival. Glycoconj J. 29 (1), 57-66 (2012).
  21. Chen, G., et al. Human IgG Fc-glycosylation profiling reveals associations with age, sex, female sex hormones and thyroid cancer. J Proteomics. 75 (10), 2824-2834 (2012).
  22. Takeda, Y., et al. Fucosylated haptoglobin is a novel type of cancer biomarker linked to the prognosis after an operation in colorectal cancer. Cancer. 118 (12), 3036-3043 (2012).
  23. Parekh, R. B., et al. Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG. Nature. 316 (6027), 452-457 (1985).
  24. Mehta, A. S., et al. Increased levels of galactose-deficient anti-Gal immunoglobulin G in the sera of hepatitis C virus-infected individuals with fibrosis and cirrhosis. J Virol. 82 (3), 1259-1270 (2008).
  25. Horvat, T., Zoldoš, V., Lauc, G. Evolutional and clinical implications of the epigenetic regulation of protein glycosylation. Clinical Epigenetics. 2 (2), 425-432 (2011).
  26. Zoldoš, V., Novokmet, M., Bečeheli, I., Lauc, G. Genomics and epigenomics of the human glycome. Glycoconj J. 30 (1), 41-50 (2013).
  27. Lowe, J. B., Marth, J. D. A genetic approach to Mammalian glycan function. Annu Rev Biochem. 72, 643-691 (2003).
  28. Tuccillo, F. M., et al. Aberrant Glycosylation as Biomarker for Cancer: Focus on CD43. Biomed Res Int. , (2014).
  29. Varki, A., Kannagi, R., Toole, B. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 44: Glycosylation Changes in Cancer (2009).
  30. Brockhausen, I. Mucin-type O-glycans in human colon and breast cancer: glycodynamics and functions. EMBO reports. 7 (6), 599-604 (2006).
  31. Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
  32. Bertozzi, C. R., Sasisekharan, R. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch 48 Glycomics (2009).
  33. Borges, C. R., Rehder, D. S., Boffetta, P. Multiplexed surrogate analysis of glycotransferase activity in whole biospecimens. Anal Chem. 85 (5), 2927-2936 (2013).
  34. Mcinnes, A. G., Ball, D. H., Cooper, F. P., Bishop, C. T. Separation of Carbohydrate Derivatives by Gas-Liquid Partition Chromatography. J Chromatogr. 1 (6), 556-557 (1958).
  35. Ciucanu, I., Caprita, R. Per-O-methylation of neutral carbohydrates directly from aqueous samples for gas chromatography and mass spectrometry analysis. Anal Chim Acta. 585 (1), 81-85 (2007).
  36. Ciucanu, I., Kerek, F. A simple and rapid method for the permethylation of carbohydrates. Carbohydr Res. 131, 209-217 (1984).
  37. Kang, P., Mechref, Y., Klouckova, I., Novotny, M. V. Solid-phase permethylation of glycans for mass spectrometric analysis. Rapid Commun Mass Sp. 19 (23), 3421-3428 (2005).
  38. Kang, P., Mechref, Y., Novotny, M. V. High-throughput solid-phase permethylation of glycans prior to mass spectrometry. Rapid Commun Mass Sp. 22 (5), 721-734 (2008).
  39. Goetz, J. A., Mechref, Y., Kang, P., Jeng, M. H., Novotny, M. V. Glycomic profiling of invasive and non-invasive breast cancer cells. Glycoconj J. 26 (2), 117-131 (2009).
  40. Goetz, J. A., Novotny, M. V., Mechref, Y. Enzymatic/chemical release of O-glycans allowing MS analysis at high sensitivity. Anal Chem. 81 (23), 9546-9552 (2009).
  41. Mulloy, B., Hart, G. W., Stanley, P. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York. Ch. 47: Structural Analysis of Glycans (2009).
  42. Seed, B. Silanizing glassware. Curr Protoc Immunol. 21, A.3K.1-A.3K.2 (1997).
  43. Stellner, K., Saito, H., Hakomori, S. I. Determination of aminosugar linkages in glycolipids by methylation. Aminosugar linkages of ceramide pentasaccharides of rabbit erythrocytes and of Forssman antigen. Arch Biochem Biophys. 155 (2), 464-472 (1973).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи