Методическая статья

Исследование функции Coronin А в раннем Реакция использовать голод Dictyostelium discoideum Агрегацией Assays

DOI:

10.3791/53972

⸱

18 июня 2016 г.

 ,  ,  , 
1Biozentrum, University of Basel

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Социальная амеба Dictyostelium discoideum претерпевает эволюционный переход в многоклеточный организм при голодании. Эволюционно консервативный белок коронин А играет решающую роль в начале развития. Используя агрегационные анализы в качестве основного метода, мы стремимся выяснить роль коронина А в раннем развитии.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dictyostelium discoideum амебы встречаются в почве, питаются бактериями. Когда источники питания становятся редкими, они секретируют факторы , чтобы инициировать многоклеточный программу развития, в ходе которой отдельные клетки chemotax по отношению к агрегации центров 1-4. Этот процесс зависит от высвобождения циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) 5. цАМФ вырабатывается в волнах через согласованные действия аденилатциклазы и фосфодиэстеразы, и связывается с G-белком рецепторов цАМФ 6,7. Широко используемый анализ для анализа механизмов , участвующих в цикле развития нижнего эукариот Dictyostelium discoideum основан на наблюдении агрегацией клеток в условиях затопленных 8,9. Этот протокол описывает анализ роли coronin А в цикле развития голоданием в тканевой культуре пластин , погруженных в сбалансированном солевом растворе (ПБС) 10. Coronin А является членом широко законсервированного прotein семейство coronins , которые были вовлечены в самых разнообразных мероприятиях 11,12. Dictyostelium клетки , лишенные coronin А не способны образовывать многоклеточные агрегаты, и этот дефект может быть спасен путем подачи импульсов цАМФ, предполагая , что coronin А действует выше по потоку от цАМФ каскад 10. Методы , описанные в этих исследованиях , обеспечивают надежные инструменты для исследования функции белков на начальных стадиях цикла развития Dictyostelium discoideum вверх по течению от цАМФ каскада. Поэтому, используя этот анализ агрегации может позволить дальнейшее изучение coronin функции и улучшения нашего понимания coronin биологии.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Coronin семейство белков высоко законсервирован на протяжении эукариот. Эти белки характеризуются наличием амино-концевой триптофан-аспартата (WD) повторяют , содержащие область, уникального региона , подключенного к карбокси-концевой домен биспиральных 13,14 (рисунок 1). Coronins участвуют в различных клеточных функций, включая регулирование цитоскелета и сигнальной трансдукции 12. У млекопитающих, вплоть до шести коротких coronin молекул (coronin 1-6), а также 'тандем' coronin 7, могут быть совместно выражены 12,15. Coronin 1 является наиболее широко изучены член семьи, и было показано, участвует в разрушении болезнетворных микроорганизмов, выживание Т-клеток и нейронного сигнала. Как именно, coronin 1 осуществляет эту деятельность, остается неясным. В то время как coronin 1 было показано, регулирует Ca 2+ и цАМФ-зависимого сигнализации, а также F-актин цитоскелета модуляции 16-18 потенциал сотрудничества-expression до 7 членов семьи у млекопитающих сделало его сложным для изучения молекулярной функции coronins в этих системах, из-за возможных увольнений. В отличие от млекопитающих организмов, нижняя эукариот Dictyostelium discoideum выражает только два coronin членов семьи (coronin A, ортологом млекопитающих coronin 1 и coronin B, ортологом coronin млекопитающих 7) , по- видимому , не избыточных функций 15,19,20. Этот факт делает Dictyostelium discoideum мощную модель для изучения функции coronins.

Изучить роль coronin А в Dictyostelium discoideum, мы побудила цикл развития от голода в тканевых культуральных планшетах , содержащих сбалансированный солевой раствор (BSS) буфер , используя либо клетки дикого типа или клетки , лишенные coronin A 10. Мы обнаружили, что клетки, лишенные coronin К оказались не в состоянии сформировать многоклеточные агрегаты при голодании. Для точного количественной оценки этого фенотипаавтоматизированный клеток изображений живых описано в данном протоколе, является жизненно важным инструментом. Дефект в инициации раннего ответа голодном в клетках, лишенных coronin А может быть спасен путем подачи импульсов цАМФ, предполагая, что coronin А действует вверх по течению от цАМФ каскада. Экзогенные применение цАМФ импульсов для имитации инициации развития была использована несколько лабораторий в прошлом 8,9. Тем не менее, эта процедура также известно, сильно зависит от плотности клеток и времени. Таким образом, протокол, описанный здесь, имеет целью уменьшить эти изменчивости, чтобы гарантировать высокую степень воспроизводимости. Взятые вместе, методы , используемые в этих исследованиях , обеспечивают надежные инструменты для исследования функции белков на ранних стадиях цикла развития Dictyostelium discoideum и имеют потенциал , чтобы определить вверх, а также вниз по течению эффекторов coronin функции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Обратите внимание на ранний ответ голоданию Dictyostelium discoideum путем покадровой микроскопии.
    1. Grow DH1.10 клетки или Cora дефицитных клеток в колбе , содержащей Эрленмейером HL-5 среде (1 л: 5 г протеоза пептон, 5 г thiotone E пептон, 10 г глюкозы, 5 г дрожжевого экстракта, 0,35 г Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, 0,35 г КН 2 РО 4, 0,05 г Дигидрострептомицин-сульфат, рН 6,6) при 22 ° C в инкубаторном шейкере с вращением 160 оборотов в минуту. Держите клетки при плотности в интервале от 0,01 × 10 6 клеток / мл и 2 × 10 6 клеток / мл.
    2. Изучение агрегации клеток, путем сбора лог-фаза растущей DH1.10 клеток 21 или Cora дефицитных клеток 10 генерируется в фоновом режиме DH1.10, выращенных в культуре с встряхивании HL-5 среде при температуре 22 ° C. Для этого принимают соответствующее количество клеток (как правило, от 10 до 50 мл), центрифуге в течение 3 мин при 400 мкг и промыть клетки дважды в ПБС (10 мМ NaCl, 10 мМ KCl, 2,5 мМ CaCl 2, рН 6,5).
    3. Граф клеток с использованием гемоцитометра. Затем клетки планшет при плотности (5, 10, 20, или 40) х 10 4 клеток / см 2 в 24-луночного планшета. Дайте им придерживаться в течение 1 часа при 22 ° С в ПБС.
    4. Визуализируйте агрегации покадровой микроскопии , как описано выше 10, принимая изображения каждые 135 сек. с использованием изображений живых клеток создать оборудованный с целью 5X и камеры устройства электронно-умножая зарядовой связью автоматизирован с помощью соответствующего программного обеспечения (см Материалы таблицу).
  2. цАМФ пульсацию discoideum клеток Dictyostelium во время голодания.
    1. Изучить влияние внешних приложенных импульсов цАМФ на развитие DH1.10 клеток 21 или DH1.10 Cora дефицитных клеток 10, путем сбора клеток. Для этого, возьмите соответствующее количество клеток (обычно от 10 до 50 мл), центрифуги в течение 3 мин при 400 мкг и мыть дважды в ПБС.
    2. CouКлетки нт с помощью гемоцитометра и ресуспендирования клеток до плотности 1 х 10 7 клеток / мл в ПБС. Взболтать культур (160 оборотов в минуту) при 22 ° С в течение 2 ч до применения импульсов. Добавить импульсы цАМФ с помощью таймера контролируется перистальтического насоса. Программировать насос, чтобы поставить 5 сек импульс каждый 6,5 мин 15 мкл 50 нМ цАМФ (конечная концентрация) в течение 5 часов.
    3. Граф клеток с использованием гемоцитометра. Затем пластины клетки при плотности (5, 10, 20, или 40) х 10 4 клеток / см 2 в 24-луночный планшет. Разрешить придерживаться в течение 1 часа в ПБС.
    4. Визуализируйте агрегации после 16 часов при 22 ° С в ярко-микроскопии с использованием объектива 5X.
  3. Индукция Dictyostelium discoideum развития путем воздействия кондиционированной среды.
    1. Подготовьте свежую кондиционированную среду , как описано 22. Собирают клетки DH1.10 лог-фазы 21 или DH1.10 Cora дефицитных клеток 10, от тряски культУРЭС с HL-5 среде при 22 ° С с использованием пипетки, центрифуги в течение 3 мин при 400 мкг и мыть клетки три раза в PBM (0,02 М фосфата калия, 10 мкМ CaCl 2 и 1 мМ MgCl 2, рН 6,1).
    2. Граф клеток с использованием гемоцитометра, ресуспендируют их в РВМ при плотности 1 х 10 7 клеток / мл и встряхивают в течение 20 часов при 110 оборотах в минуту / 22 ° C.
    3. Собирают кондиционированной среды после центрифугирования при 400 × г в течение 3 мин и уточнить центрифугированием при 8000 х г в течение 15 мин при температуре 4 ° С.
    4. Фильтр кондиционированной среды через фильтр 0,45 мкм (см Материалы таблицу) и развести три раза в РВМ.
    5. Граф клеток с использованием гемоцитометра и пластины с плотностью (5, 10, 20, или 40) · 10 4 клеток / см 2 в 24-луночный планшет. Дайте им придерживаться в течение 1 часа при 22 ° С.
    6. Обмен супернатанта клеток с предварительно приготовленным кондиционированной среды.
    7. Визуализируйте агрегациюосле 16 ч с помощью ярко-микроскопии с использованием объектива 5X.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клетки , дефицитные по coronin поднятием дефект на ранней стадии разработки (рисунок 2). При отсутствии coronin А клетки не способны образовывать многоклеточные агрегаты, что является первым шагом в процессе цикла развития Dictyostelium discoideum. Поэтому coronin-видимому, играет определенную роль в процессе раннего реагирования голодания и / или передачи сигналов цАМФ. Действительно, отсутствие многоклеточного образования агрегатов в отсутствие coronin А сопро...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В coronin белки встречаются в большинстве таксонов эукариотических клады. Dictyostelium discoideum coronin А, гомолог coronin млекопитающих 1, участвует в ранней реакции голодной, так как coronin А-дефицитные клетки не способны образовывать агрегации центров во время раннего развития цикл 10. Для того, чтобы иметь возможность количественно и точно оценить задержку в развитии между штаммами, микроскоп изображений живых клеток настройки с автоматизированным контроллером стадии является важным инструмен...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Конфликт интересов не декларируется.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Stock-центр Dictyostelium за штаммы и реагенты. Это исследование финансировалось за счет грантов Швейцарского национального научного фонда и кантона Базель.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Среда HL-5 (на 1 л: 5 г пептона протеоза, 5 г пептона тиотона Е, 10 г глюкозы, 5 г экстракта дрожжей, 0,35 г Na<суб>2HPO<суб>4*2H<суб>2О, 0,35 г KH<суб>2PO<суб>4, 0,05 г дигидрострептомицинасульфата, pH 6,6)
Протеозный пептонBD Bioscience211693
Тиотон Е пептонBD Bioscience211684
Дрожжевой экстрактBD Bioscience212750
GlucoseAppliChemA3666
Na2HPO4*2H2OFluka71643
KH2PO4AppliChemA1043
дигидрострептомицин-сульфатSigma-AldrichD1954000
PBM (0,02 М фосфат калия, 10 мкм; M CaCl2, и l mM MgCl2, pH 6,1)самостоятельно изготовленный
BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, pH 6,5)самостоятельно изготовленный
0,45-μ m Фильтр Filtropure SSarstedt83.1826
Falcon 24-луночный планшет для культуры тканейFisher Scientific08-772-1H
Микроскоп CellobserverZeissспециально построенное
программное обеспечение AxioVisionZeiss
IPC Микропроцессор– управляемый дозирующий насосISMATECISM 931
Axiovert 135M микроскопZeiss491237-0001-000
Инкубационный шейкерInforst HT Minitron

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weijer, C. J. Morphogenetic cell movement in Dictyostelium. Semin Cell Dev Biol. 10, 609-619 (1999).
  2. Devreotes, P. Dictyostelium discoideum: a model system for cell-cell interactions in development. Science. 245, 1054-1058 (1989).
  3. Kimmel, A. R., Firtel, R. A. cAMP signal transduction pathways regulating development of Dictyostelium discoideum. Curr Opin Genet Dev. 1, 383-390 (1991).
  4. Clarke, M., Gomer, R. H. PSF and CMF, autocrine factors that regulate gene expression during growth and early development of Dictyostelium. Experientia. 51, 1124-1134 (1995).
  5. Robertson, A., Drage, D. J., Cohen, M. H. Control of Aggregation in Dictyostelium discoideum by an External Periodic Pulse of Cyclic Adenosine Monophosphate. Science. 175, 333-335 (1972).
  6. Konijn, T. M., Chang, Y. Y., Bonner, J. T. Synthesis of cyclic AMP in Dictyostelium discoideum and Polysphondylium pallidum. Nature. 224, 1211-1212 (1969).
  7. Iranfar, N., Fuller, D., Loomis, W. F. Genome-wide expression analyses of gene regulation during early development of Dictyostelium discoideum. Eukaryot Cell. 2, 664-670 (2003).
  8. Darmon, M., Brachet, P., Da Silva, L. H. Chemotactic signals induce cell differentiation in Dictyostelium discoideum. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 3163-3166 (1975).
  9. Mann, S. K., Firtel, R. A. Cyclic AMP regulation of early gene expression in Dictyostelium discoideum: mediation via the cell surface cyclic AMP receptor. Mol Cell Biol. 7, 458-469 (1987).
  10. Vinet, A. F., et al. Initiation of multicellular differentiation in Dictyostelium discoideum is regulated by coronin A. Mol Biol Cell. 25, 688-701 (2014).
  11. Eckert, C., Hammesfahr, B., Kollmar, M. A holistic phylogeny of the coronin gene family reveals an ancient origin of the tandem-coronin, defines a new subfamily, and predicts protein function. BMC Evol Biol. 11, 268(2011).
  12. Pieters, J., Muller, P., Jayachandran, R. On guard: coronin proteins in innate and adaptive immunity. Nat Rev Immunol. 13, 510-518 (2013).
  13. Gatfield, J., Albrecht, I., Zanolari, B., Steinmetz, M. O., Pieters, J. Association of the Leukocyte Plasma Membrane with the Actin Cytoskeleton through Coiled Coil-mediated Trimeric Coronin 1 Molecules. Mol Biol Cell. 16, 2786-2798 (2005).
  14. Kammerer, R. A., et al. A conserved trimerization motif controls the topology of short coiled coils. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13891-13896 (2005).
  15. Uetrecht, A. C., Bear, J. E. Coronins: the return of the crown. Trends Cell Biol. 16, 421-426 (2006).
  16. Jayachandran, R., et al. Coronin 1 Regulates Cognition and Behavior through Modulation of cAMP/Protein Kinase A Signaling. PLoS Biol. 12, e1001820(2014).
  17. Suo, D., et al. Coronin-1 is a neurotrophin endosomal effector that is required for developmental competition for survival. Nat Neurosci. 17, 36-45 (2014).
  18. Mueller, P., et al. Regulation of T cell survival through coronin-1-mediated generation of inositol-1,4,5-trisphosphate and calcium mobilization after T cell receptor triggering. Nat Immunol. 9, 424-431 (2008).
  19. de Hostos, E. L., Bradtke, B., Lottspeich, F., Guggenheim, R., Gerisch, G. Coronin, an actin binding protein of Dictyostelium discoideum localized to cell surface projections, has sequence similarities to G protein beta subunits. EMBO J. 10, 4097-4104 (1991).
  20. Shina, M. C., et al. Redundant and unique roles of coronin proteins in Dictyostelium. Cell Mol Life Sci. 68, 303-313 (2011).
  21. Cornillon, S., et al. Phg1p is a nine-transmembrane protein superfamily member involved in dictyostelium adhesion and phagocytosis. J Biol Chem. 275, 34287-34292 (2000).
  22. Gomer, R. H., Yuen, I. S., Firtel, R. A. A secreted 80 x 10(3) Mr protein mediates sensing of cell density and the onset of development in Dictyostelium. Development. (112), 269-278 (1991).
  23. Iijima, N., Takagi, T., Maeda, Y. A proteinous factor mediating intercellular communication during the transition of Dictyostelium cells from growth to differentiation. Zoological science. 12, 61-69 (1995).
  24. Mehdy, M. C., Firtel, R. A. A secreted factor and cyclic AMP jointly regulate cell-type-specific gene expression in Dictyostelium discoideum. Mol Cell Biol. 5, 705-713 (1985).
  25. Jain, R., Yuen, I. S., Taphouse, C. R., Gomer, R. H. A density-sensing factor controls development in Dictyostelium. Genes Dev. 6, 390-400 (1992).
  26. Loomis, W. F. Cell signaling during development of Dictyostelium. Dev Biol. 391, 1-16 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Dictyostelium discoideumCoronin AAggregation AssayCyclic AMP PulsesCell AggregationTime lapse MicroscopyHemocytometer CountingConditioned MediumStarvation ResponseDevelopmental Biology

Похожие статьи