Методы исследования Mrp4 содержащих макромолекулярных комплексов в регуляции миграции фибробластов

Summary

MRP4 регулирует различные циклические нуклеотид-зависимой сигнализации событий, включая недавно выяснены роль в миграции клеток. Мы описываем прямой, но многогранный подход к распутать вниз по течению молекулярные мишени из MRP4 что приводит к идентификации уникального MRP4 интерактома, который играет ключевую роль в отлаженной регулирования миграции фибробластов.

Abstract

Множественная лекарственная устойчивость белка 4 (MRP4) является членом АТФ-связывающего кассетного семейства мембранных транспортеров и является эндогенным Отток транспортировщик циклических нуклеотидов. Модулируя внутриклеточной концентрации циклических нуклеотидов, MRP4 может регулировать несколько циклических нуклеотидов-зависимых клеточных событий, включая миграцию клеток. Ранее мы показали, что при отсутствии MRP4, фибробласты содержат более высокие уровни внутриклеточного циклических нуклеотидов и могут мигрировать быстрее. Для того, чтобы понять основные механизмы этого факта, мы приняли непосредственное еще многосторонний подход. Во-первых, мы выделили потенциальные взаимодействующий белок комплексы MRP4 из MRP4 системы клеток избыточная экспрессия с использованием иммунопреципитации с последующим масс-спектрометрии. После идентификации уникальных белков в MRP4 интерактома, мы использовали изобретательности Pathway Analysis (IPA), чтобы исследовать роль этих белок-белковых взаимодействий в контексте передачи сигнала. Мы осветил роциальная роль белкового комплекса MRP4 в миграции клеток и идентифицировали F-актина как главный медиатор влияния MRP4 на миграцию клеток. В этом исследовании также была подчеркнута роль цАМФ и цГМФ в качестве ключевых игроков в миграционных явлений. Использование высокой содержанием микроскопии, мы проводили анализы клеточного миграции и наблюдали, что эффект MRP4 на миграцию фибробластов полностью отменена дезорганизацией цитоскелета или ингибирование цАМФ-зависимой киназы А (РКА). Для визуализации сигналов модуляций в мигрирующим камере в режиме реального времени, мы использовали датчик FRET на основе измерения активности РКА и обнаружили, наличие более поляризованным активности РКА вблизи передней кромки мигрирующего Mrp4 ^{- / -} фибробласты, по сравнению с Mrp4 ^{+ / +} фибробласты. Это, в свою очередь, увеличилась корковой актина образование и дополненное процесс миграции. Наш подход позволяет идентифицировать белки, действующие вниз по течению к MRP4 и дает нам чрезмерновид механизма, участвующего в MRP4-зависимой регуляции миграции фибробластов.

Introduction

Миграция клеток представляет собой сложный многоступенчатый процесс. Исследования показали, что во время миграции клеток поляризованы в передней и задней кромок. Присоединившись к внеклеточного матрикса, передний край обеспечивает тягу, необходимую для тела клетки, чтобы двигаться вперед. И, наконец, задняя кромка релизы в задние вложения и завершает ^1,2 цикла миграции.

Ячейка поляризации для эффективной миграции клеток регулируется пространственной сегрегации внутриклеточной сигнализации. Клеточные вторичные мессенджеры, такие как цАМФ, опосредуют обособления сигнальных событий , необходимых для отлаженной направленной миграции клеток ^3,4. Льготные скопления цАМФ и цАМФ-зависимой киназы РКА активности на переднем крае играют ключевую роль в направленной миграции клеток ^5,6. Фосфорилированием небольшие GTPases, такие как Рас-связанной С3 ботулинического токсина субстрата (Rac) и контроль клеточного деления белка 42 гомолога или Cdc42, PKАктивирует актин-родственный белок , 2/3 (Arp 2/3) на передней кромке и вызывает образование ламеллоподиях ^7-9. РКА также фосфорилирует анти укупорки агента, сосудорасширяющее стимулируется фосфопротеин (VASP), тем самым регулирует колебательные циклы расширения мембраны и втягивании ^10,11.

В клетках, уровни цАМФ регулируются тремя основными процессами: я) синтезом аденилатциклазы, II) деградации под действием фосфодиэстеразы и III) перевозки по мембраносвязанных эффлюксных транспортеров ^3. Множественная лекарственная устойчивость белка 4 (MRP4), член АТФ-связывающего кассетного семейства (ABC) мембранных транспортеров, функции как эндогенный эффлюксного переносчика циклических нуклеотидов. Поэтому MRP4 может регулировать уровни внутриклеточного цАМФ и цАМФ-зависимой клеточной сигнализации ^11-13. Ранее мы показали , что в Mrp4 ^{- / -} фибробласты содержат относительно более высокие уровни циклических нуклеотидов и мигрируют быстрее Compared к Mrp4 ^{+ / +} фибробластов ^14. Мы также сообщали, двухфазный эффект циклических нуклеотидов на миграцию фибробластов. На основе предыдущих исследований , и обнаружение того, что наша Mrp4 ^{- / -} фибробласты содержат более поляризованной цАМФ в процессе миграции, мы предположили , что этот MRP4-опосредованной регулирование миграции фибробластов является цАМФ зависимой. Для того чтобы понять механизм вниз по течению, мы приняли непосредственное еще многосторонний подход.

Для того, чтобы идентифицировать белки, связанные и во взаимодействии с MRP4, мы иммуноосажденного MRP4 содержащих высокомолекулярные комплексы из клеток НЕК293, что более выражающих MRP4. Использование масс-спектрометрии, мы идентифицировали несколько MRP4-взаимодействующих белков и анализировали их взаимосвязанности с помощью изобретательности Pathway Analysis (IPA). МПА является полезным инструментом для анализа белок-белковых взаимодействий (как структурные, так и функциональные) и исследовать их вклад в частности физиологических и патологическихсобытия , основанные на литературе и экспериментальных доказательств ^15,16. АПИ показали , что F-актин является основным объектом вниз по течению MRP4 в контексте миграции клеток , где цАМФ и цГМФ , являются ключевыми молекулами ¹⁷ передачи сигналов. Эти данные были подтверждены в дальнейшем высоким содержанием микроскопии. Высокое содержание-микроскопия может захватывать и анализировать поведение клеток , таких как миграция клеток в более удобной, точной и высокой пропускной способностью ¹⁸ образом. Данные высокомолекулярные содержания микроскопии показал , что влияние MRP4 на миграцию фибробластов полностью отменена после разрушения актинового цитоскелета или ингибирование ПКА ^17.

Кроме того, мы использовали Ферстер резонансный перенос энергии (FRET) основе датчика РКА следить за динамикой рКа в миграции клеток в реальном времени. FRET на основе датчиков киназы , как правило , состоят из специфических субстратного фосфорилирования пептидов фланкированных CFP и YFP флуорофоров ^19-21. pmAKAR3 является улучшенной и меняmbrane целевой FRET основе датчика РКА , который содержит Forkhead-ассоциированный домен 1 (FHA1) и последовательность ПКА субстрат LRRATLVD ^5,22. Фосфорилирование pmAKAR3 каталитическими увеличивается субъединиц рКа FRET сигнала между CFP и YFP ^19. Вставка липидного домена модификации в датчике мишенях к плазматической мембране для мониторинга динамики рКа, в частности , в мембранном отсеке ^23.

Используя pmAKAR3, мы показали , что передний край миграции Mrp4 ^{- / -} фибробласты экспонируются более поляризованный активность РКА чем Mrp4 ^{+ / +} фибробласты, что в свою очередь увеличило корковой образование актина на передней кромке ¹⁷ ячейки. Вместе эти события привели к улучшению клеточной поляризации и миграции быстрее направленной клеток в отсутствие MRP4. Наш конкретный и прямой подход определил ключевые вниз по течению цели для MRP4 и обеспечивает важное, но, какдо сих пор неизученными механизм MRP4-зависимого регулирования миграции фибробластов.

Protocol

1. Изобретательность Тропинка анализ

1. Выгрузка Белково-интерактом Dataset
   1. Вставьте белки / гены, представляющие интерес в электронной таблице с их уникальными идентификаторами генов (предпочтительно генных символов и чисел идентификаторов гена, полученных с помощью масс-спектрометрических данных).
   2. Назначают один столбец в таблице для идентификационный номер гена и один столбец для наблюдательной значения (например., Складывающиеся изменение или р-значение). Выберите 'содержит заголовок столбца' для просмотра заголовков столбцов.
   3. Загрузить набор данных на МПА, нажав на вкладке загрузки набора данных и выбора электронных таблиц, упомянутых выше. Выберите вкладку гибкий формат, и выберите соответствующую категорию идентификатора гена.
      Примечание: Гибкий формат набора данных преодолевает спецификации форматирования для загрузки.
   4. После того, как появится набор данных, выберите идентификатор и наблюдения столбцов. Убедитесь, что все белки (MRP4 интерактомных, как это определено с помощью масс-SPectrometry) отображаются путем проверки на вкладке Сводка набора данных. Набор данных готов к желаемого анализа.
2. Анализ данных
   Примечание: Описываются частичные виды использования функций АПИ, которые были использованы в этом исследовании.
   1. После загрузки MRP4 интерактомные с их именами генов в качестве уникальных идентификаторов, нажмите на новый и выбрать основной анализ в верхнем левом углу меню программного обеспечения ПНД.
   2. Установите значение выражения отсечек для интенсивности в соответствии с типом эксперимента (Intensity значение 100 рекомендуется для анализа).
   3. Вычислить загнутой изменение экспрессии при подготовке набора данных, если контрольные и экспериментальные условия участвуют и включить его в качестве части файла набора данных, если необходимо выполнить анализ сравнения (отсечка значение в 1,5 раза изменения обычно рекомендуется для анализа ).
      Примечание: После завершения анализа основного, можно получить несколько разделов анализов. Первая закладка показывает сводку гое общие анализы и предполагает верхние канонические пути, вверх по течению регуляторы, молекулярные и клеточные функции, а также сети среди других; все рассчитывается на основании уровня достоверности (р значение) и расположены в порядке возрастания значение р.
   4. Открыть основные канонические пути (с использованием опции открытый путь) в виде больших молекулярных сетей, которые изобразительно поперечные Talking, перекрывающийся, и затронутых сигнальных путей.
      Посмотрите на список канонических путей, которые вовлечены главно на основе значения р (р <0,05 считается значительным).
      Примечание: Значения значимости для канонических путей вычисляются путем точного критерия Фишера право хвостами. Значение указывает на вероятность объединения молекул из набора данных с каноническим пути одной только случайности.
   5. Проверьте входные белки (MRP4 интерактомные, как это определено с помощью масс-спектрометрии) среди списка белков, участвующих в каждом пути.
      Примечание: С помощью этого Optioп, было отмечено , что клеточная актин цитоскелета сети сигнализации является основным затрагиваемой путь и как входные белки вписываться в нее (рисунок 1). Такой подход позволяет определить, какие молекулярные сети будут тесно связаны и влияют испытания белков.
   6. Используйте вкладку сети в анализе выявления наиболее заболеваний и функции, которые потенциально связаны с конкретной белковой сети на основе числа молекул фокус.
      Примечание: Значение оценка дается на основе известных белков, которые определяются как часть сети , например, сотовой сборки и организации сети, с помощью литературы знаний и экспериментальных доказательств и сосредоточиться молекулы, которые определены из набора данных и стать частью сети. , В дальнейшем, сеть фильтруется в первую очередь на основе числа молекул фокус.

2. Высоковольтный содержание Микроскопия

1. Получение клеток
   Примечание: Вся культура клеток работа была выполнена под горизонтальным потоком капот культуре клеток.
   1. Использование 96-луночного микропланшета для заживления ран анализа.
   2. Покрыть микропланшет с 1% -ным раствором фибронектина (восстанавливали в PBS), и держать пластину в стандартной СО ₂ инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 2 часов.
   3. Удалить Mrp4 ^{- / -} и Mrp4 ^{+ / +} мышь эмбриональных фибробластов (МЭФ) выращивали в 25 кв.см колбах для культивирования клеток из инкубатора, мыть 1 раз с PBS и Trypsinize клетки в течение 5 мин с использованием 1 мл 4 - кратным раствором трипсин-ЭДТА.
   4. Промывают клетки с полной средой Игла (DMEM, содержащей 10% FBS и 1% пенициллина / стрептомицина) и ресуспендируют их в 5 мл полной среды.
   5. Аспирируйте фибронектина раствора из лунок. Граф клеток с использованием гемоцитометра и семян 30000 клеток (количество клеток должна быть оптимизирована в зависимости от типа клеток) в каждую лунку.
   6. Grow клетки до 100% слияния в стандартномСО ₂ инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 24 ч.
2. Создание Рана
   1. Убедитесь, что все лунки заполняют раствором. Заполните неиспользованные лунки с PBS , чтобы предотвратить повреждение инструмента раны решений (например., WoundMaker).
   2. После подтверждения 100% слияния клеток, поместите 96-луночного планшета внутри инструмента раневой делая на опорной плите металла и нажмите контактный блок 96-луночного вниз.
   3. Вымойте клетки три раза PBS, чтобы удалить любые освобожденные клетки и добавить 100 мкл полной среды.
   4. Добавьте тестируемые соединения - Н-89 (50 мкМ; 1: 1000 разбавление полной среды с использованием 50 мМ акции в ДМСО) или латрункулин B (1 мкМ; 1: 1000 разбавление полной среды с использованием 1 мМ акции в ДМСО) на данном этапе ,
   5. Поместите планшет для анализа внутри считывателя при 37 ° С и контролировать миграцию в течение экспериментального периода.
3. Мониторинг миграции клеток
   Примечание: Миграция клеток контролировали с помощью микроскопа и программного обеспечения прovided с системой микроскопии высокого содержания. Использование 96-луночных микропланшетов гарантирует, что раны автоматически контролируется микроскопом и регистрируется с помощью программного обеспечения.
   1. Установите программное обеспечение для сканирования планшета для анализа каждый час для миграции анализов с помощью вкладки Расписание сканирования. Выберите время начала, по крайней мере 15 минут после размещения планшета для анализа внутри читателя, чтобы позволить уравновешивание до начала съемки.
   2. Выберите лоток и выбрать тип судна (96-луночный микропланшет) и тип эксперимента (Царапина Wound).
   3. Выберите цель 10X и выбрать параметры изображения фазового контраста. Выберите лунки, которые должны быть отсканированы с помощью опции редактирования шаблона сканирования.
   4. Укажите обработок групп и любых повторах, выбрав вкладку Свойства и настройки карты пластины. Сканирование может быть остановлена ​​в любой момент на основе экспериментальных условиях.
4. Анализ данных
   1. После того, как сканирование будет сделано, выберите вкладку просмотра сосуд для анализа пластины. гO для утилит заданий анализа и выбора запуска нового анализа работы.
   2. Установить царапанию рану как тип задания и выберите диапазон времени для (временной точки от 0 до 24 час момент времени) анализ.
   3. Выберите ячейки, которые будут выбраны для анализа с помощью одного нажатия на лунку и нажмите кнопку "OK", чтобы начать анализ. После того, как анализ делается, графически визуализировать данные относительной плотности Рана (RWD) для каждой лунки в каждый момент времени с помощью экспорта в опции графа.
   4. Просмотр фазового контраста набор изображений каждой лунки, соответствующие различные промежутки времени, используя вкладку Вид изображения. Выберите конкретной скважины, нажав на карте пластины, выберите конкретный момент времени на вкладке временного диапазона и нажмите на вкладку Вид изображения.

3. Ферстер-резонансная передача энергии (FRET)

1. Получение клеток
   1. Coat 35 мм со стеклянным дном посуды с 100 мкл 1% -ного раствора фибронектина (как описано в разделе 2.1) и держать их встандартный СО ₂ инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 2 часов.
   2. Аспирируйте фибронектин раствор из пластин и семенных равное число клеток НЕК293 (10000 клеток / планшет) в полной среде.
   3. Grow клетки до 60-70% слияния в фибронектина покрытием со стеклянным дном блюда в стандартной СО ₂ инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 24 ч.
2. трансфекция
   1. Выполнение всех временных трансфекций с использованием коммерческого реагента для трансфекции в соответствии с инструкциями изготовителя.
   2. Аликвоты в 250 мкл полной среды в двух отдельных 1,5 мл стерильного центрифужные пробирки для каждого 35 мм блюдо.
   3. Добавить 2 мкг ДНК (pmAKAR3 или pmAKAR3-TA) в одной пробирке и 5 мкл (2,5 раза концентрацию ДНК) реагента трансфекции в другую пробирку.
   4. Инкубировать пробирки в течение 20 мин при комнатной температуре, а затем передать разбавленный ДНК в реагент, содержащей трубку трансфекции.
   5. Тщательно перемешать и инкубировать при температуре 37° С в течение еще 30 мин.
   6. Аспирируйте среду выключения клеток и мыть их один раз PBS. Добавить 1 мл DMEM антибиотика свободной F-12 среды, содержащей 10% FBS к клеткам.
   7. Добавьте 507 мкл ДНК-липидных конъюгата со средой к клеткам в каждую тарелку, осторожно перемешать и хранить в СО ₂ инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 48 часов. С помощью 2 мкг ДНК (1 мкг / мкл) и наличии 5 мкл липидного для 10000-50000 клеток в каждой чашке.
3. Live-ячейки изображения
   1. После 48 ч трансфекции, удалить ростовой среды и промыть клетки 2 раза с Хэнкса сбалансированный солевой раствор (HBSS, предварительно нагретого до 37 ° С). Добавьте конечный объем 1,9 мл HBSS к промытым клеткам и смонтировать их на инвертированный микроскоп систему широкого поля для визуализации FRET внутри выполненного на заказ 37 ° С поддерживается камеру.
      Примечание: В этой системе свет возбуждения обеспечивается лампой 300 Вт ксеноновой ослабляется с нейтральным фильтром плотности с 50% света ступиона.
   2. Используйте цель 60X. Вручную сосредоточиться на клетки и установить оптимальное поле зрения с помощью микроскопа. Активировать выбранное поле зрения на экране компьютера с помощью опции Фокус "F" на программное обеспечение. Для выполнения измерений FRET, выбрать правильный набор фильтров (CFP / YFP набор фильтров с 430/25 нм возбуждения фильтр, двойной сплиттер дихроичная луча и два фильтра выбросов (470/30 нм для CFP и 535/30 нм для FRET) вручную.
   3. Визуализируйте флуоресценции сначала проверить на опции канала CFP / YFP / FRET затем нажав открытую вкладку фтористой. Повышение интенсивности сигнала с помощью инструмента интенсификации на вкладке камеры.
   4. Выделите ячейки, выражающие pmAKAR3 или pmAKAR3-TA избежать насыщения интенсивности сигнала. Используйте окно захвата, чтобы начать измерение ладу.
   5. Выберите опцию покадровой и настройка по времени сканирования в течение 30 мин с интервалом 30 сек. Отметьте опцию FRET и установить время экспозиции в 100 мс. Введите метку изображения апd Нажмите кнопку Старт, чтобы начать измерение.
   6. После пяти временных точек и установления базовой линии, добавить 25 мкМ форсколина (5 мкл 10 мкМ запаса в этаноле, разбавляют 100 мкл HBSS) к клеткам, не нарушая пластины и контролировать клетки в течение в общей сложности 30 мин.
4. Анализ данных
   Примечание: Используйте радиометрический модуль расчета для анализа данных.
   1. Нажмите на инструмент выбора на левой стороне окна изображения и выберите сплошной прямоугольник из выпадающего меню. Перетащите прямоугольник на поле изображения в свободной области ячеек и щелкните правой кнопкой мыши на нем, чтобы установить его в качестве фона для целей вычитания фона.
   2. Перейти к маске и использовать "создать новую маску" вариант. Перейти к выберите инструмент и выбрать перо из выпадающего меню, чтобы вручную сделать маску вокруг ячейки, чтобы выбрать его для измерения. Выберите по крайней мере 4-6 клеток в состоянии.
   3. Выберите вкладку Mask и выполнять статистические маски.
   4. Проверьте "Весь маска", разверните вариант кросс-канал и выбрать донора нормализованное FRET (N-FRET) (FRET / СФП). Значение N ладов является представителем активности РКА на плазматической мембране.
   5. Добавьте временные отметки, справочную таблицу и масштабную линейку с помощью аннотаций.

Results

Для изучения влияния MRP4 на миграцию фибробластов, мы использовали ранозаживляющим анализа с использованием высокого содержания микроскопии ^14. Точные раны были сделаны на сливных монослоев MEFs , выделенных из либо Mrp4 ^{- / -} или Mrp4 ^{+ / +} мышей, и изображения были взяты через 1 час с интервалом в течение 24 часов. Мы наблюдали более высокую скорость миграции для Mrp4 ^{- / -} MEFs по сравне...

Discussion

Миграция клеток является сложным процессом, который играет незаменимую роль во многих важных физиологических событиях, включая заживление ран^1,2. Аберрантные миграции клеток могут вызывать катастрофические события, такие как метастазирование опухоли и ангиогенез^24,25. Поэтому для поддержания нормального функционирования организма требуется тонко настроенная регуляция миграции клеток.

Используя микроскопию с высоким содержанием¹⁸, мы продемонстрировали, что МЭФ ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Липофектамин 2000	Invitrogen(Карлсбад, Калифорния)	11668-027
DMEM	Invitrogen (Карлсбад, Калифорния)	11965-092
Микропланшеты IncuCyte Zoom	Essen BioScience
96 лунок IncuCyte Image-Lock	Essen BioScience	4493
Latrunculin B	Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури).	L5288	Запас в DMSO
H-89	Enzo Life Sciences (Фармингдейл, Нью-Йорк)	BML-EI196	Запас
в ДМСО 35 мм со стеклянным дном	(Корпорация MatTek; Ашленд, Массачусетс)	P35G-1.5-20-C
Фибронектин	Сигма-Олдрич (Сент-Луис, Миссури).	F1141
Opti-MEM Сниженный уровень сыворотки	(Карлсбад, Калифорния)	31985-088
Система для микроскопии FRET	Olympus инвертированный микроскоп (IX51)
ПЗС-камера	Хамамацу, Япония	ORCA285
программное обеспечение SlideBook 5.5	Intelligent Imaging Innovation ( Денвер, Колорадо)
Программное обеспечение Ingenuity Pathway Analysis	IPA, QIAGEN Redwood City,
Forskolin	Tocris (Эллисвилл, Миссури).	1099	Запас 100% EtOH
DMEM F-12	Invitrogen (Карлсбад, Калифорния)	11330-057
HBSS	Invitrogen (Карлсбад, Калифорния)	14025-134
Excel	Microsoft
PBS	Invitrogen(Карлсбад, Калифорния)	10010-023
Раствор трипсина/ЭДТА (TE)	Invitrogen(Карлсбад, Калифорния)	R-001-100
Пенициллин-стрептомицин	инвитроген(Карлсбад, Калифорния)	15140-122