Методическая статья

Подготовка 3D Коллаген Гели и микроканалов для изучения 3D взаимодействий В Vivo

DOI:

10.3791/53989

⸱

9 мая 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, 2Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison, 4Morgridge Institute for Research, University of Wisconsin-Madison, 5Paul P. Carbone Comprehensive Cancer center, University of Wisconsin-Madison

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Коллаген является одним из основных компонентов внеклеточного матрикса и обеспечивает необходимые сигналы для нескольких клеточных процессов, начиная от миграции к дифференциации и пролиферации. При условии, здесь является протоколом для встраивания клеток в 3D гидрогелей коллагена, и более продвинутый метод для генерации рандомизированные или выровненные матрицы коллагена с использованием PDMS микроканалов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исторически сложилось так, что большинство клеточных процессов изучались только в двух измерениях. Хотя эти исследования были информативными для общих клеточных сигнальных механизмов, они пренебрегают важными клеточными сигналами, полученными от структурных и механических свойств местного микроокружения и внеклеточного матрикса (ВКМ). Чтобы понять, как клетки взаимодействуют в рамках физиологической ВКМ, важно изучить их в контексте трехмерных анализов. Миграция клеток, клеточная дифференцировка и пролиферация клеток — это лишь некоторые процессы, на которые, как было показано, влияют локальные изменения механических свойств трехмерной ВКМ. Коллаген I, основной фибриллярный компонент ECM, является больше, чем просто структурным элементом ткани. В нормальных условиях механические сигналы от коллагеновой сети направляют морфогенез и поддерживают клеточные структуры. В пораженных микросредах, таких как опухолевое микроокружение, коллагеновая сеть часто резко ремоделируется, демонстрируя измененный состав, усиленное отложение и измененную организацию волокон. При раке молочной железы степень выравнивания волокон имеет важное значение, так как увеличение выровненных волокон перпендикулярно границе опухоли коррелирует с худшим прогнозом пациента1. Выровненные коллагеновые матрицы приводят к увеличению диссеминации опухолевых клеток за счет стойкой миграции2,3. Ниже приведен простой протокол встраивания клеток в трехмерный фибриллярный гидрогель с коллагеном. Этот протокол легко адаптируется ко многим платформам и может воспроизводимо генерировать как выровненные, так и случайные коллагеновые матрицы для исследования миграции клеток, деления клеток и других клеточных процессов в настраиваемом, трехмерном, физиологическом микроокружении.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Многие клеточные процессы были тщательно изучены в двух измерениях, тем самым формируя коллективные знания об основных клеточных сигнальных механизмах. Эти исследования, однако, пренебрегают важными клеточными сигналами, полученными из структурных и механических свойств локального клеточного микроокружения и внеклеточного матрикса (ВКМ). Чтобы лучше понять, как клетки взаимодействуют в физиологическом контексте, важно изучить их в трехмерных (3D) анализах. ВКМ для этих 3D-анализов может быть либо получена из клеток, либо восстановлена из очищенных белков. Независимо от источника ВКМ, 3D-матричные анализы оказались бесценными для понимания того, как клетки ориентируются и взаимодействуют в физиологическом мире. Например, клетки, выращенные в 3D-матрицах, демонстрируют различные режимы передвижения, которые зависят от механической природы окружающей их ЭВМ, но не наблюдаются в 2D-экспериментах4-6. Кроме того, клетки, культивируемые в 3D, также имеют меньше и менее выраженные стрессовые волокна и фокальные адгезии, чем их аналоги, выращенные на твердых поверхностях, таких как стеклоили пластик.

Однако важность контекстуальных 3D-анализов не ограничивается миграцией клеток. Некоторые другие клеточные сигнальные события могут быть исследованы только с помощью 3D-анализов. Во время дифференцировки тканей и клеток жесткость внеклеточной среды и ВКМ дает сигналы, которые могут влиять на морфогенные события. Например, тубулогенез эпителия молочной железы происходит только в 3D матрицах с низкой жесткостью, но не в жестких матрицах и не на 2D субстратах8,9. При культивировании в жестких 3D-матрицах эти же эпителиальные клетки приобретают аберрантный фенотип с повышенной пролиферацией и выступами клеточных мембран, вызванными измененной сигнализацией FAK и ERK10. Известно, что многие другие сигнальные пути и клеточные процессы аналогичным образом подвержены влиянию жесткости локальной клеточной среды, и эти сигнальные каскады подчеркивают важность исследования сигнальных событий и клеточного фенотипа в контексте соответствующих локальных механических свойств 3D ECM.

Коллаген I является особенно актуальным белком для использования в исследованиях in vitro, поскольку он является наиболее распространенным компонентом ВКМ и отвечает за многие механические свойства клеточного микроокружения. Хотя первоначально он считался просто структурным белком, теперь известно, что его роль гораздо более сложна. Состав, архитектура, ориентация, плотность и жесткость коллагеновых волокон обеспечивают концентрированную среду передачи сигнальной информации5. Во время прогрессирования некоторых заболеваний, таких как хроническое воспаление и онкогенез, коллагеновая сеть резко ремоделируется2,11. В частности, при раке молочной железы повышенное отложение коллагена и жесткость тканей сопровождают и, вероятно, способствуют прогрессированию опухоли. При этих ранних опухолях жесткая коллагеновая сеть выглядит напряженной и более выровненной, так что большая часть волокон инкапсулирует растущую опухоль2. По мере прогрессирования опухоли коллаген продолжает реорганизоваться, и участки фибриллярной сети становятся ориентированными перпендикулярно границе опухоли2,12. Перпендикулярное выравнивание служит прогностическим биомаркером при более низком прогрессировании заболевания без заболевания и общей выживаемости1. Одно из объяснений этой корреляции заключается в том, что плохие результаты являются следствием повышенной диссеминации опухолевых клеток через постоянную миграцию клеток в выровненныхколлагеновых сетях.

Чтобы понять, как клетки конкретно реагируют на выравнивание и организацию, которые наблюдаются при прогрессировании опухоли, необходимо генерировать как случайные, так и выровненные 3D коллагеновые матрицы для экспериментов. Существует три основные методологии для индуцирования выравнивания в фибриллярных сетях. В первом методе используется устройство, вызывающее деформацию, при котором коллаген между двумя точками сокращается или растягивается для создания выравнивания. Волокна, параллельные оси силы, натягиваются натянуто, в то время как волокна, перпендикулярные оси, сжимаются и сгибаются. В то время как методы, вызванные деформацией, обычно обеспечивают превосходную юстировку, этот подход требует громоздкого оборудования, которое нелегко адаптировать ко многим платформам3,13. В качестве альтернативы, индуцированный клетками штамм может быть создан путем размещения локализованных пробок клеток, которые впоследствии сокращаются и выравнивают коллаген13. Этот метод имеет проблему вариативности, так как многие параметры могут быть изменены. Второй метод использует магнитные шарики и магнитное поле во время полимеризации для индуцирования выравнивания коллагена13,14. Хорошие результаты могут быть получены с помощью этого метода с помощью несложного оборудования, но он требует использования антител или какого-либо другого метода для намагничивания полимера. Таким образом, его использование может быть несколько дорогим, а жесткость коллагенового геля потенциально изменяется из-за увеличения связей в сети. Более того, магнитные шарики, используемые в этом процессе, часто являются автофлуоресцентными, что проблематично для экспериментов с визуализацией. Наконец, выравнивание может быть обеспечено микрофлюидными каналами PDMS3,15,16. В этом методе выравнивание коллагена достигается путем протекания полимеризующегося коллагена через небольшие микрофлюидные каналы. Эти микрофлюидные каналы могут быть выполнены в различных конструкциях и легко адаптируются ко многим платформам. Кроме того, они очень экономичны, так как из-за их миниатюрных размеров используются очень малые количества коллагена и других реагентов.

Здесь представлен простой протокол для встраивания клеток в трехмерный фибриллярный коллагеновый гидрогель. Кроме того, предусмотрена более совершенная методика, при которой микрофлюидные каналы PDMS используются для контроля организации и выравнивания коллагенового матрикса. Этот протокол легко адаптируется ко многим платформам и может воспроизводимо генерировать как выровненные, так и случайные коллагеновые матрицы для исследования миграции клеток, деления клеток и других клеточных процессов в трехмерном физиологическом микроокружении.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Нейтрализация, разбавление и Полимеризация Коллаген решений для 3D Исследование и клеточных контракции Assays

  1. На льду в стерильной культуре ткани капот, нейтрализовать коллаген (1: 1) со стерильной, охлажденной льдом 100 мМ HEPES в 2 раза PBS, рН 7,4, в 15 мл коническую пробирку. Тщательно перемешать с пластиковой пипеткой до тех пор, пока раствор не станет однородным и смесительные завихрения больше не видны. Будьте осторожны, чтобы не вводить пузырьков воздуха в процессе смешивания. Хранить на короткое время на льду.
  2. Развести нейтрализованного коллагена в соответствующей концентрации клеток средах (таких , как RPMI, DMEM и т.д.).
    1. Для того, чтобы рассчитать количество нейтрализованного коллагена , необходимого , чтобы компенсировать желаемой концентрации коллагена, используют уравнение N = (D + V) / (S / 2), где N является количество нейтрализованного коллагена , необходимого, D является требуемая концентрация коллагена, V является конечный объем требуемой концентрации коллагена, и S является тон начинает концентрацию запас коллагена.
    2. Поднимают количество нейтрализованного коллагена до нужного объема с помощью добавления клеток и клеточных сред раствором. Тщательно перемешать и не хранить на льду до готовности бросить.
      1. Пример: 2 мг геля / мл в объеме геля в 1 мл (типичного объема для геля отлит в 6-луночный планшет или 50 мм со стеклянным дном тарелки), сначала умножают требуемую концентрацию (2 мг / мл) до желаемого конечного объема (1 мл). Возьмите это число (2 мг) и разделить его на половину акций концентрации перечисленных на бутылке (9,49 мг / мл). В этом случае 0,42 мл нейтрализованного коллагена разбавляют 0,58 мл смеси носителя / клеток.
  3. Пипетируйте леденящий коллаген / клетки / смесь носитель в любой культуре, не ткани обрабатывают 6-луночного планшета или 50 мм блюдо со стеклянным дном. Используйте наконечник пипетки, чтобы равномерно разложить решение.
    Примечание: Важно, чтобы использовать культуру без ткани обрабатывают пластины, чтобы свести к минимуму или прикрепление роста клеток за пределами collagан геля.
  4. Разрешить полимеризуется при комнатной температуре в течение приблизительно 10 - 15 мин. Гели должны непрозрачной при полимеризации.
  5. После того, как она превратилась непрозрачным, переместить тарелку или блюдо до 37 ° С в течение дополнительных 45 - 60 мин для завершения полимеризации.
  6. Через 45 - 60 мин, добавляют 2 - 3 мл среды и освободить гели от сторон скважины, запустив p200 пипеткой наконечник вокруг периметра колодца или блюдо. Вихревой блюдо аккуратно, чтобы освободить гель. Гель коллаген должен быть плавающим в средствах массовой информации.

2. Вестерн блот, Cell Морфогенез и гель Gontractility анализа

  1. Для оценки уровня белка, морфология или клеточного сократимость по отношению к ECM жесткости, начинают выливая коллагеновые гели, в соответствии с 1.1 - 1.6, засевали клетками для 7 - дневного анализа 10. Определите каждую норму высева клеточной линии эмпирически в зависимости от скорости роста и сплошности. Для 10-дневного теста на плотность посева может колебаться от 20000 - 100000 клеток / гель.
  2. Измерятьячейки сократимость, измерить диаметр геля с помощью линейки или камеры через каждые 24 ч или на соответствующем временном интервале.
    Примечание: Кроме того, соответствующие изображения, собранные с помощью микроскопа можно исследовать на морфологические черты, характерные для клеточной линии высевают в геле, такие как ацинусов-подобных структур, эпителиальных канальцев, клеточных выступов и lameliapodia.
  3. Для оценки уровня белка, лизировать гели в RIPA буфере и процесс для Вестерн - блот - анализ белков , представляющих интерес , как это описано в Возняком и др. 17 и Gallagher и др. 18.
    1. ВАЖНО: При сравнении сократительной между клеточными линиями, нормализуют сократительную к тотальной ДНК, которые могут быть извлечены из гелей , как это изложено Lui и др 19, или неизменного, ведение домашнего хозяйства белка (гистонов, GAPDH и т.д.) со стороны западных. блот - анализ, как описано в разделе Возняк и др. 17 и Gallagher и др. 18, Если подсчет клеток в геле с помощью гемоцитометра, убедитесь, чтобы нормализовать количество клеток в общей площади геля в качестве геля-заказчика будет концентрировать клетки.
  4. Кормовые гели каждые 3 - 4 дня путем удаления 1 мл среды и заменив его на 1 мл свежей среды. Убедитесь в том, чтобы кормить гели после измерения берется в качестве добавления свежего носителя / сыворотки вызовет всплеск сократимость.

3. Генерация PDMS микроканалов для выравнивания коллагеновых волокон

Примечание: Для создания выровненных матриц коллагена, пресс - форма для PDMS микроканалов (Рисунок 2А) требует мастер кремния SU-8 , сделанное с помощью мягкой литографии 15.

  1. Для того, чтобы PDMS каналов, перемешать тщательно PDMS в одноразовую чашку с корабля палкой. Для 6 дюймов Silicone Master, смешайте 20 г эластомерной основе с 2 г отвердителя.
  2. Де-газ смесь PDMS путем размещения одноразовые чашки в вакуумной камере под вакуумом давлением550 мм ртутного столба. Де-газ в течение 1 - 1,5 ч.
  3. В то время как де-газообразования PDMS, подготовить мастер силиконовый для заливки. Подготовьте, помещая чистый лист прозрачной пленки на плитке с последующим мастером силикона. Убедитесь в том, что Микроканал формы обращена вверх.
    Примечание: во время литья и отверждения PDMS, мастер силикон будет зажат между двумя листами прозрачной пленки.
  4. Через 1 - 1,5 ч, удалить дегазировали PDMS из вакуумной камеры, и медленно полить мастер силикона.
    ВАЖНО: Избегайте пузырьков воздуха. Продолжайте вливать в центре мастера, и позволить силе тяжести равномерно распределяют его.
    Примечание: Падение PDMS не нужно расширить весь путь до края мастера.
  5. После того, как PDMS вылили на хозяина, нанесите второй лист прозрачной пленки поверх мастера силикона и PDMS. Осторожно, раскатать вторую прозрачность листа вниз на верхней части мастера PDMS / силикона, чтобы избежать воздушных пузырей. Не спеши. PDMS должны быть равномерно распределены в настоящее время омастер вер.
  6. Аккуратно поместите резиновый лист на верхней части прозрачности, а затем 1/8 "акриловый лист.
  7. Добавьте три 10 фунтов веса на верхней части акрилового листа. Изначально весовые коэффициенты будут "плавать". Позвольте им урегулировать и стабилизировать, прежде чем продолжить.
  8. Установите температуру конфорки до 70 ° С и вылечить PDMS в течение 4 часов. Дайте остыть в течение минимум 1 дополнительный час, прежде чем нарушать.
  9. Аккуратно снимите верхний лист прозрачной пленки из пластины, и удалить каналы с пинцетом.
  10. Хранить в защищенном от пыли блюдо до готовности к использованию.

4. Преппинг PDMS Микроканалы для использования

  1. Место каналы вниз головой на новую, чистую прозрачную пленку. Очистить все порты (Рисунок 2b) с помощью кругового движения с острыми щипцами. Удалите все фрагменты PDMS.
  2. Чистые каналы, используя кусок упаковочной ленты в качестве гвоздя ткани. Нанесите ленту на поверхности скамейки (липкой стороной вверх), а затем установить канал Oп сверху. Надавите на каналах с круглым концом щипцов, чтобы обеспечить хороший контакт. Удалить и повторите с обеих сторон до образования видимого мусора не будет удален.
  3. Передача очищено, PDMS каналы нацелен в 50 мл коническую с 70% этанола. Vortex на максимальной скорости в течение 30 сек. Откажитесь этанола и заменить свежим 70% этанола. Хранить в 70% этанола до готовности к использованию.
  4. В культуре ткани капюшоном и с использованием асептических методов, передавать PDMS каналы чистой и стерильной стеклянной крышкой или стеклянным дном посуды. Поместите канал стороной вверх и УФ лечить, пока этанол не испарится.
  5. После высыхания, переверните PDMS поэтому каналы должны быть обращены вниз к покровного стекла. Нажмите канал PDMS вниз на стекло, чтобы сделать хорошее уплотнение. Добавить участок стерильной PDMS , чтобы покрыть / закрыть центральный порт (порт B, рис 2b). Дайте полностью высохнуть, прежде чем продолжить.
  6. Предварительное покрытие внутри канала с 10 мкг / мл коллагена в стерильной воде. Для покрытия, поместите 100 мкл капельку а на вершине Channэль, и проведем через с вакуумом. Через 1 ч при 37 ° С, передаточные каналы, заполненные раствором коллагена покрытия к холодильнику. Холод в течение приблизительно 15 - 30 мин.
  7. Удалить коллагена раствора покрытия с аспиратором или пипетку, и начать подготовку коллагена.

5. Коллаген Подготовка к использованию в микроканалов

  1. На льду, нейтрализуют коллаген (1: 1) с охлажденным льдом 100 мМ HEPES в 2 раза PBS, рН 7,4. Тщательно перемешивайте до получения однородной консистенции (Для получения более подробной информации, смотрите раздел 1.1).
  2. Развести нейтрализованного коллагена в соответствующих концентрациях с клеточной среды (Для получения более подробной информации, смотрите раздел 1.2). Выдержите в течение 15 мин на льду.
  3. В то же время, озноб установлены каналы на льду.
    Примечание: Цель состоит в том, чтобы иметь все компоненты, необходимые для процесса канала при 4 ° С или ниже. Коллаген температура и время нуклеации являются ключевыми параметрами в процессе полимеризации, и может быть отправной точкой для дальнейшей оптимизации, если это необходимо.
  4. CounТ-клетки с гематоцитометре и ресуспендируют при соответствующей плотности посева в это время. Для простоты вычислений, ресуспендируют в 1 - 3 миллиона клеток / мл. (Для получения более подробной информации, смотрите также раздел 2.1).
  5. После того, как клетки были подсчитаны и 15 мин прошло, приступить к заливке коллагена.

6. Обливание Унифицированные и случайный Коллагеновые Микроканалы

  1. Перед нанесением коллагена через каналы, отрегулировать и установить давление вакуума с инлайн регулятором вакуума. Давление вакуума обеспечивает силу, чтобы вызвать и контролировать скорость потока коллагена, который определяет степень выравнивания.
    1. Для случайных или выровненными матриц, используют широкий канал (3 мм в ширину х 200 мкм в высоту) с вакуумным давлением 10 мм рт.ст. или менее.
    2. Для совмещенных матриц, использовать узкий канал (1 мм в ширину х 200 мкм высотой) с вакуумным давлением 60 мм рт.ст. и более.
  2. Удалить установленный канал из льда и поместите на чистую, продезинфицировать поверхность ламинарного потока чООД.
  3. Работают быстро и загрузить 120 - 150 мкл нейтрализованного коллагена в порт A (рис 2b).
  4. Draw коллаген через канал, помещая 25 мл пипетку , прикрепленную к вакуумной линии через порт C (рисунок 2b). Draw коллаген через в едином равномерном движении. ВАЖНО: Для случайных или выровненным матриц, рисовать коллаген медленно через канал (примерно 0,5 - 1 мм в секунду), и остановиться, как только он достигает конца. Для совмещенных матриц, рисовать коллаген через более быстро, но будьте осторожны, чтобы избежать воздушных пузырей.
  5. Осторожно удалите избыток коллагена из региона порта с P200 Pipetman или аспиратора.
  6. Поместите стерильные PDMS участки над обоими портами А и С. Все порты в настоящее время должны быть охвачены.
  7. Через 2 - 3 минут, снимите центральный PDMS патч (порт B) и добавьте 2 - 3 мкл клеток (5 - 10 тысяч клеток) в центральный порт. Разрешить частично полимеризуется (непрозрачной) при комнатной температуре в течение еще 10 - 15 мин.
  8. После того, как 10- 15 мин, передача до 37 ° С в течение дополнительных 15 - 30 мин для завершения полимеризации. Удалить PDMS крышки и добавлять носители, чтобы полностью покрыть канал и культуры клеток по мере необходимости. Клетки могут быть поданы путем удаления мл старых средств массовой информации, и заменив его на мл новых средств массовой информации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В то время как 3D-анализы могут быть сделано в пределах той же жесткости коллагеновый гель, изменяя жесткость гель может быть использован, чтобы определить, каким образом клетки будут реагировать на механические изменения в их клеточной микросреде. Жесткая коллагеновый гидрогель определяется как гель, когда вложенное клетки не способны локально сжиматься окружающий коллаген. Внутреннюю сократимость различных типов клеток является уникальным, и, таким образом, лучше всего начать с простой...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3D гели коллагена являются ценным дополнением к нашей панели инструментов, чтобы понять, как клетки интерпретировать и реагировать на их микроокружения. Эта рукопись предоставила очень простой протокол для встраивания клеток в 3D-матрицу коллагена и воспроизводимо генерировать матрицы со случайными или выровненных коллагеновых волокон. Оба протокола работают, как адаптивные платформы, на которых потенциально могут быть добавлены различные изоформы коллагена, сшиватели, или другие матричные белки во время полимеризации. ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы отметить номера грантов UO1CA143069, R01CA142833, R01CA114462, RO1CA179556, Т32-AG000213-24 и T32-GM008692-18 для финансирования этой работы. Мы также признаем, Джереми Bredfelt и Yuming Лю локусов для развития и помощи при анализе КТ-FIRE.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Высококонцентрированный коллаген Rat TailCorning354249
SylGard184 набор эластомеровCorningNC9285739Эластомер для каналов PDMS
HEPESFisherBP310Для нейтрализующего буфера HEPES
KCl FisherBP366Для буфера нейтрализации HEPES
KH2PO4FisherBP362Для буфера нейтрализации HEPES
Na2HPO4FisherS374Для буфера нейтрализации HEPES
NaClFisherBP358Для буфера нейтрализации HEPES
Levy Улучшенный гемацитометр НейбауэраFisher15170-208
6-луночный планшет для нетканевых культурCorning351146
50 мм тарелка со стеклянным дномMatTekP50g-1.5-30-f
Bel-Art Пластиковый вакуумный эксикаторBel-ArtF4200-2021Дегазационная камера для
прозрачной пленки PDMS 3Mpp2950Пластиковая пленка для заливки pdms каналов
ThermoScientific CimaRecThermoScientific HP141925Нагревательная пластина для отверждения микроканалов PDMS
Вакуумный регуляторPrecision MedicalPM3100Вакуумный регулятор для коллагеновых микроканалов
8" x 8" резиновый листAmazon - Rubber-CalSilicone - 60Aрезиновый лист для заливки микроканалов PDMS
8" x 8" x 0,125" акриловый листAmazonPlexiglass листыдля заливки микроканалов PDMS
Грузы 10 фунтовAmazonCAP Штангадля заливки микроканалов PDMS
15 мл Конические трубкиFisher352097
50 мл Конические трубкиFisher352098
пластиковые пипеткиDot Scientific229202B, 229206B и 667225B2  мл, 5  ml, и 25  мл
70% EtOHFisherNC9663244

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. Am J Pathol. 178, 1221-1232 (2011).
  2. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4, 38(2006).
  3. Riching, K. M., et al. 3D collagen alignment limits protrusions to enhance breast cancer cell persistence. Biophys J. 107, 2546-2558 (2014).
  4. Even-Ram, S., Yamada, K. M. Cell migration in 3D matrix. Curr Opin Cell Biol. 17, 524-532 (2005).
  5. Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. J Cell Biol. 188, 11-19 (2010).
  6. Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration. J Cell Biol. 197, 439-455 (2012).
  7. Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Curr Opin Cell Biol. 14, 633-639 (2002).
  8. Wozniak, M. A., Desai, R., Solski, P. A., Der, C. J., Keely, P. J. ROCK-generated contractility regulates breast epithelial cell differentiation in response to the physical properties of a three-dimensional collagen matrix. J Cell Biol. 163, 583-595 (2003).
  9. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
  10. Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage. Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).
  11. Tlsty, T. D., Coussens, L. M. Tumor stroma and regulation of cancer development. Annu Rev Pathol. 1, 119-150 (2006).
  12. Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11(2008).
  13. Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by Rho/ROCK-dependent matrix reorganization. Biophys J. 95, 5374-5384 (2008).
  14. Guo, C., Kaufman, L. J. Flow and magnetic field induced collagen alignment. Biomaterials. 28, 1105-1114 (2007).
  15. Sung, K. E., et al. Control of 3-dimensional collagen matrix polymerization for reproducible human mammary fibroblast cell culture in microfluidic devices. Biomaterials. 30, 4833-4841 (2009).
  16. Lee, P., Lin, R., Moon, J., Lee, L. P. Microfluidic alignment of collagen fibers for in vitro cell culture. Biomed Microdevices. 8, 35-41 (2006).
  17. Wozniak, M. A., Keely, P. J. Use of three-dimensional collagen gels to study mechanotransduction in T47D breast epithelial cells. Biol Proced Online. 7, 144-161 (2005).
  18. Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 10, Unit 10 18(2008).
  19. Liu, X., Harada, S. DNA isolation from mammalian samples. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 2, Unit 2 14(2013).
  20. Roeder, B. A., Kokini, K., Sturgis, J. E., Robinson, J. P., Voytik-Harbin, S. L. Tensile mechanical properties of three-dimensional type I collagen extracellular matrices with varied microstructure. J Biomech Eng. 124, 214-222 (2002).
  21. Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. J Biomed Opt. 19, 16007(2014).
  22. Bischel, L. L., Beebe, D. J., Sung, K. E. Microfluidic model of ductal carcinoma in situ with 3D, organotypic structure. BMC Cancer. 15, 12(2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

3D3D

Похожие статьи