Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

миРНК Трансфекция и EMSA Анализы на свежеизолированных ворсинок Cytotrophoblasts человека

10.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53995

⸱

20 сентября 2016 г.

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Quebec in Montreal, 2Department of Pharmacology and Therapeutics, McGill University, 3Department of Clinical Sciences, University of Montreal

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает способ эффективного трансфекции миРНК в свежеизолированных ворсинчатыми cytotrophoblasts человека с использованием microporation и идентификации ДНК-белковых комплексов в этих клетках. Трансфицированные клетки можно контролировать с помощью Вестерн-блоттинга и EMSA анализы в течение времени культивирования 4-дневного периода.

Аннотация

Первичные ворсинчатые цитотрофобласты человека являются очень полезным источником первичных клеток для изучения функций плаценты и регуляторных механизмов, а также для понимания заболеваний, связанных с беременностью. В этом протоколе первичные ворсинчатые цитотрофобласты человека, только что выделенные из плаценты с помощью стандартного протокола ДНКаза/трипсин, микропорируются с помощью малой интерферирующей РНК (миРНК). Этот подход обеспечил большую эффективность трансфекции миРНК по сравнению с методом, основанным на липофекции. Трансфицированные клетки могут быть впоследствии проанализированы с помощью стандартного вестерн-блоттинга в течение 3-4 дней после трансфекции. Кроме того, с использованием культивируемых первичных ворсинчатых цитотрофобластов был оптимизирован анализ электрофоретической подвижности (EMSA) и проведен анализ экстрактов с 1 по 4 день. Использование этих культивируемых первичных клеток и описанный протокол позволяют оценить влияние специфических генов и факторов транскрипции на процесс дифференцировки ворсинчатого цитотрофобласта в синцитиотрофобластный клеточный слой. Однако ограниченный временной промежуток времени, допустимый в культуре, исключает использование методов, требующих большего времени, таких как генерация стабильной клеточной популяции. Поэтому тестирование этой популяции клеток требует высокооптимизированных протоколов переноса генов.

Введение

Плацентарная дисфункция человека связана с развитием нескольких заболеваний, связанных с беременностью, таких как преэклампсия и задержка внутриутробного развития 1. Важной клеточной составляющей плаценты являются трофобласты, которые можно классифицировать как экстраворсинчатые или ворсинчатые цитотрофобласты. После слияния ворсинчатые цитотрофобласты далее дифференцируются в слой синцитиотрофобласта, многоядерную клеточную структуру, играющую важную роль в фето-материнском обмене и производстве гормонов 2. Первичные ворсинчатые цитотрофобласты человека и их дифференцированные аналоги представляют собой важные биологические образцы и позволяют исследователям изучать ряд процессов, связанных с плацентой, таких как слияние клеток, в культуре. Кроме того, в настоящее время предпринимаются значительные усилия по выявлению маркеров, которые будут способствовать надлежащему ведению и улучшению профилактической терапии, специфичной для заболеваний, связанных с беременностью. Лаборатории регулярно выделяют первичные ворсинчатые цитотрофобласты человека из свежих плацент с использованием стандартной процедуры выделения, основанной на расщеплении трипсина ворсинками плаценты 3. Поскольку культивируемые цитотрофобласты теряют свою способность к пролиферации и быстрой дифференцировке в синцитиотрофобластоподобном слое в культуре 4, необходимы очень эффективные методы трансфекции и оптимизированные подходы к анализу. В предыдущих исследованиях были определены оптимальные условия трансфекции этих первичных цитотрофобластов 5. В данной работе представлен другой способ трансфекции миРНК, который ранее был протестирован на этом типе клеток 6. По сравнению с подходом, основанным на липофекции, этот метод микропорации улучшает трансфекцию, что оценивается по степени подавления определенных генов.

Исследования промоторов и экспрессии генов также обеспечивают лучшее понимание функции плаценты. Несмотря на то, что анализ промоторов с использованием стандартных протоколов более сложен в использовании из-за короткого периода времени, в течение которого можно культивировать первичные ворсинчатые цитотрофобласты, тем не менее, можно использовать анализ промоторов с использованием стандартных протоколов, как было опубликовано ранее 7. Электрофоретический анализ сдвига подвижности (EMSA) является одним из широко используемых методов in vitro, позволяющим быстро и легко контролировать взаимодействия ДНК и белка. Ядерные экстракты из этих первичных трофобластов были использованы для тестирования области промотора синцитина-2 на предмет специфических взаимодействий. Результаты показали, что связанные факторы могут быть обнаружены в разные моменты культуры и специфическим и воспроизводимым образом.

Данные, представленные в этом протоколе, подтверждают, что наш подход к трансфекции и протокол EMSA могут быть использованы для выделенных первичных ворсинчатых цитотрофобластов и будут очень полезны для изучения различных функций ворсинчатых цитотрофобластов в норме или при патологии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Комитет по этике UQAM одобрил эти протоколы, которые в соответствии с руководящими принципами комитета по этике St Luc-больница Клинический центр Университетский-де-Монреаль (Монреаль, Канада). Участники подписали форму информированного согласия.

1. Средний Получение и выделение первичных ворсинок Cytotrophoblasts

  1. Подготовка культуральной среды для первичных ворсинок cytotrophoblasts человека, дополнив модифицированную Dilbecco среду Eagle (DMEM) с 25 мМ HEPES, 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), и 1% пенициллина / стрептомицина. Фильтр приготовленной среды через стерильный фильтр 0,22 мкм и хранить в -20 ° C морозильнике в аликвоты по 50 мл.
  2. Изолировать первичные ворсинчатых cytotrophoblasts из свежих плацентами следующих стандартных протоколов 3.
    1. Используя плоскогубцы, снимите плода мембрану из ткани, слегка царапая его, стараясь при этом не удалять ворсинок ткани. ОтрежьОставшиеся плацентарный ворсинки кубиками около 3 х 3 см с помощью скальпеля и ножниц. Тщательно промойте водой, содержащей 0,9% NaCl для удаления материнской крови.
      1. Держа каждый кубик с плоскогубцами, осторожно удалите ворсинок ткани из оставшихся сосудов и фиброзной ткани с помощью ножниц.
      2. От 15 до 30 мг ворсинок ткани, переваривать четыре раза в сбалансированном солевом растворе Хэнкса (HBSS) , содержащий трипсин (от 9,6 × 10 5 до 1,8 × 10 6 U; конечная концентрация 1,2 мг / мл) и ДНК - аза I (ДНКазы I) ( конечная концентрация 200 мкг / мл) в течение 30 мин при 37 ° с на водяной бане при непрерывном встряхивании.
        Примечание: Используйте 150 мл общий объем для первого переваривания, 100 мл для второго переваривания и 75 мл для двух оставшихся варок.
    2. Соберите супернатант, содержащий диспергированные клетки и центрифуге при 1250 мкг в течение 15 мин без тормоза. Удалить супернатант и ресуспендирования клеток в 1 мл предварительно нагретой DMEM, содержащей1% пенициллина / стрептомицина.
    3. Слой диспергированные клетки поверх разрывной 5% - 70% градиентом поливинилпирролидона покрытием диоксида кремния (см таблицу 1 для градиента подготовки) и центрифугировать в течение 23 мин при 507 XG без тормоза. Удалите слой плотности между 1,017 до 1,033 стремлением и собирать слои между 40% и 50% в градиенте с новым пипеткой. Промыть клетки экстенсивно с 10 мл предварительно нагретой DMEM, содержащей 1% пенициллина / стрептомицина.
      Примечание: Собранная фракция соответствует плотности между 1.048 и 1.062, которая укрывает трофобласта.
    4. Граф клеток с использованием гемоцитометра. Вкратце, смешать клетки и добавить 10 мкл в новую пробирку микроцентрифужных. Добавьте 10 мкл трипанового синего и осторожно снова перемешать. Оформи клеточной суспензии и заполняют гемоцитометра камеры. Граф клеток под цели 10X.
    5. Поместите 1 х 10 6 и 4,5 × 10 6 клеток в отдельные пробирки для использования в разделах 1.3 и 2, соответствующиеLY. Семенной оставшихся клеток при плотности 1,5 × 10 6 клеток / лунку в среде , дополненной и культуры DMEM при 37 ° С и 5% СО 2 в течение не более 4 дней для других экспериментов.
  3. Оценка чистоты изолированных первичных ворсинок cytotrophoblasts
    1. Спин 1 х 10 6 из свежеизолированных cytotrophoblasts в микропробирок при 300 х г. Жидкость над осадком сливают и добавляют 1 мл подогретой фосфатно-солевым буферным раствором (PBS). Центрифуга клетки при 300 мкг и удалить PBS путем аспирации.
    2. Добавить 1 мл холодного метанола к клеткам и инкубируют при -20 ° С в течение 20 мин. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин и удаления метанола путем аспирации.
      Внимание: Используйте канистру маску, защитные очки и резиновые перчатки при работе с метанолом.
    3. Добавить 1 мл PBS при комнатной температуре в регидратации клеток, центрифугируют при 300 х г и удалить PBS с помощью аспирации.
    4. Инкубируйте клетки в PBS, содержащих FBS (1:50 [v / v] разбавления) и FcRблокирующий реагент (1:10) в течение 45 мин при комнатной температуре, чтобы исключить неспецифическое связывание.
    5. Промыть два раза с 500 мкл PBS при комнатной температуре, центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин и удалить PBS путем аспирации. Ресуспендируют клеток в 100 мкл PBS при комнатной температуре.
    6. Инкубируйте клетки с мышиными моноклональными изотиоцианат флуоресцеина (FITC) -conjugated анти-человеческого клона цитокератина-7 антитела LP5K (1: 200) или контроль изотипа неспецифического антитела в PBS, содержащем 0,2% БСА в течение 45 мин при комнатной температуре темноте. Промыть клетки в PBS.
    7. Анализ клеток методом проточной цитометрии 3. С помощью клеточных препаратов, которые демонстрируют как минимум 96% СК-7-положительных клеток с помощью проточной цитометрии для дальнейших экспериментов.

2. миРНК Трансфекция человека первичных ворсинок Cytotrophoblasts

  1. Трансфекция первичных ворсинок cytotrophoblasts человека с использованием устройства microporation
    1. Подготовка 6-луночные планшеты, содержащие2 мл среды DMEM, дополненной для инкубации microporated клеток.
    2. После выделения первичных cytotrophoblasts (смотри раздел 1.2), возьмите аликвоты клеток в суспензии и определяют количество клеток с помощью гемоцитометра.
    3. Перенесите 1,5 х 10 6 клеток в микроцентрифужных трубки и гранул клетки центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Промывают клетки с 1 мл PBS Дульбекко (DPBS) (Mg 2+, Ca 2+ -бесплатно) и осаждения клеток центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    4. Удалить супернатант и ресуспендирования клеток осторожно в 100 мкл буфера для ресуспендирования.
      Примечание: Во избежание перегорания клеточной суспензии в течение более 15-30 мин при комнатной температуре, чтобы максимизировать жизнеспособность клеток и эффективность трансфекции.
    5. Добавьте 300 нг Syncytin-2 миРНК (или одновременно зашифрованным миРНК) в 1,5 мл трубки микроцентрифужных и аспирация клеток-миРНК смеси с использованием 100 мкл трансфекции пипетку. Вставитьпипетка на станцию ​​(см перечень материалов) и подвергать клетки к 1300 V одиночного импульса 30 мс.
    6. Сразу передачи клетки на 6-луночные планшеты (приготовленным на стадии 2.1.1), содержащих 37 ° С предварительно нагреты дополненной среде, чтобы избежать повреждения клеток.
    7. Повторите шаги 2.1.5 и 2.1.6 для остальных образцов.
    8. Осторожно покачайте планшет в течение 30 с, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток. Инкубируйте планшет при 37 ° С в увлажненной СО 2 инкубаторе в течение 24 до 48 часов. Refresh культуральной средой через 24 часа после трансфекции.
    9. Оценка эффективности трансфекции методом Вестерн-блот-анализа (см шаги с 3 по 6).
  2. Липофекция миРНК в первичных cytotrophoblasts человека
    1. После выделения ворсинчатыми cytotrophoblasts, семена клеток при плотности 1,5 × 10 6 клеток на лунку в 6-луночные планшеты в 2 мл культуральной среды и инкубируют в течение 18 часов.
    2. Развести 300 нг Syncytin-2-специфической миРНК (или контрольно-вскарабкалсямиРНК) и 5 ​​мкл на основе липида реагента для трансфекции в отдельных 1,5 мл пробирки в общем объеме 10 мкл и антибиотикам не содержащей сыворотки среде. Инкубировать в течение 5 мин.
    3. Смешайте разбавленных реагентов и инкубировать в течение еще 20 мин при комнатной температуре с образованием комплекса трансфекцию. Добавьте 90 мкл и антибиотикам среде без сыворотки к смеси до конечного объема 100 мкл.
    4. Удалить культуральной среды из 6-луночные планшеты (этап 2.2.1). Добавляют 2 мл свежей среды и 100 мкл трансфекции смеси в каждую лунку. Инкубируйте клетки при 37 ° С в СО 2 инкубаторе в течение 24 до 48 часов. Refresh культуральной средой через 24 часа после трансфекции.
    5. Оценка эффективности трансфекции методом Вестерн-блот-анализа (см шаги с 3 по 6).

3. Получение лизатов из всей клетки культуры

  1. Выньте материал и промойте каждую лунку (от шагов , 2.1.8 и 2.2.4) с использованием предварительно нагретую DPBS (Mg 2+, Ca 2+ свободный), Аспирируйте DPBS и добавляют 500 мкл 0,25% трипсина / этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Инкубируют в течение 1-3 мин при температуре 37 ° С в СО 2 инкубаторе. Остановка обработки трипсином путем добавления 500 мкл сыворотки, содержащей ростовую среду.
    Примечание: Используйте объем соответствующие средства массовой информации в соответствии с типом опоки / блюдо: 1 мл на 10 7 клеток / 100 мм блюдо / 150 см 2 колбу; 0,5 мл на 5 × 10 6 клеток / 60 мм блюдо / 75 см 2 колбу.
  2. Передача клеток в 1,5 мл трубки микроцентрифужных, гранул клетки центрифугированием при 300 х г в течение 2 мин при комнатной температуре. Промывают клетки с ДЗФР (Mg 2+, Ca 2+ -бесплатно) и Гранул клетки центрифугированием при 300 х г в течение 2 мин при комнатной температуре.
  3. Осторожно удалите супернатант, не нарушая гранул. Поместите пробирку на льду. Ресуспендируют осадок в 50-200 мкл охлажденного льдом Радио-иммунопреципитации анализ (РИПО) буфера (смотри таблицу 2 для буферной композиции) , содержащие свеже добавитьред протеазы и ингибиторы фосфатазы на 1x конечной концентрации. Вкратце, вихревые трубки и оставьте на льду в течение 30 мин.
  4. Спин при 16000 х г в течение 20 мин при температуре 4 ° С. Аккуратно положите трубку на льду. С помощью пипетки переносят супернатант в свежую предварительно охлажденной трубки микроцентрифужных держали на льду. Выбросите осадок.

4. Подготовка ядерных экстрактов из культивируемых клеток

  1. Для каждой скважины (этап 1.2.5), промыть культивируемые cytotrophoblasts дважды 1 мл подогретого ДЗФР (Mg 2+, Ca 2+ свободный). Отберите DPBS и добавить 500 мкл 0,25% трипсина / ЭДТА. Инкубируют в течение 1-3 мин при температуре 37 ° С в СО 2 инкубатор и прекратить лечение трипсина путем добавления 500 мкл сыворотки , содержащей ростовую среду.
  2. Передача клеток в 1,5 мл трубки микроцентрифужных, гранул клетки центрифугированием при 300 х г в течение 2 мин при комнатной температуре. Вымойте клетки с ДЗФР (Mg 2+, Ca 2+ -Free) и гранул клеток путем центрифугированияпри 300 х г в течение 2 мин при комнатной температуре. Осторожно удалите все супернатант, не нарушая гранул и поместите трубку на льду.
  3. Извлечение ядерного белка в соответствии с инструкциями изготовителя. Определение концентрации белка в каждом образце с использованием количественного анализа белка (Bradford или анализа бицинхониновой кислоты (BCA)).

5. Подготовка проб и электрофорез

  1. Определить концентрацию белка для каждого клеточного экстракта с использованием анализа Количественную оценку белка (например, Брэдфорд 8 или 9 ВСА).
  2. В соответствии с инструкциями производителя (если антитела могут быть использованы в работе по уменьшению и денатурации условий), добавьте равный объем 2х Laemmli буфера выборок (таблица 2) до 20-30 мкг общего белка.
  3. Клеточные лизаты кипеть при 100 ° С в течение 5 мин. Аликвоты 50-100 мкл лизата, чтобы избежать повторных циклам замораживания / оттаивания и хранить оставшиеся пробирки при -20 ° С для последующего использования.
  4. В то время как образцы нагреваются, подготовить 1 л 1x рабочего буфера (таблица 2).
  5. Спин образцов при 16000 мкг в течение нескольких секунд и поместите их на лед.
  6. Нагрузку , равную количество белка в каждую лунку 12% SDS-PAGE гель (смотри таблицу 2 для гелевой композиции), а также маркер молекулярной массы. Выполнить гель течение от 1 до 2 ч при 100 В.

6. Перенос белка из геля на мембрану

  1. Активация поливинилиденфторид (ПВДФ) мембрану с метанолом в течение 1 мин и полоскание с раздаточной 1x буферным раствором / 10% метанола. В соответствии с инструкциями изготовителя, передачи в течение 30 мин до 1 ч в зависимости от размера белка.
    Примечание: эффективность передачи может быть оценена с помощью Понсо Red окрашивания перед стадией блокирования.

7. Антитело Окрашивание

  1. Блок мембраны в течение 1 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С с использованием 5% блокирующего раствора.
  2. Инкубируйте мембрану с анти-Syncytin-2 антитела (4 мкг / мл; 1: 5000) , 6 или с анти-глицеральдегид-3-фосфат - дегидрогеназы (GAPDH; 0,4 мкг / мл; 1: 500) в 5% блокирующего раствора в течение ночи при 4 ° С (анти-Syncytin-2) или в течение 45 мин при комнатной температуре. Промыть мембрану три раза в Трис-солевом буфере (Tween TBST, см таблицу 2 буферной композиции) в течение 5 мин.
  3. Инкубируйте мембраны с соответствующим пероксидазой хрена (HRP) анти-кроличий или анти-мышь (1: 10000) в 5% блокирующем буфере в TBST при комнатной температуре в течение 1 часа. Промыть мембрану три раза в TBST в течение 5 минут, а затем промыть в TBS. Обнаружение сигналов с использованием хемолюмияесценции на основе промокательной субстрата.

8. радиоактивной из одноцепочечный олигонуклеотид

  1. реакции фосфорилирования
    1. В пробирку микроцентрифужных, добавить 50 нг передней олигонуклеотида наряду с 1x T4 буфера полинуклеотид-киназы, 1 UТ4 полинуклеотид - киназы и 20 мкКи (γ- 32 P) АТР и составляют объем реакционной смеси до 20 мкл с нуклеазы без воды.
    2. Инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин. Остановить реакцию добавлением 5 мкл 0,5 М ЭДТА. Составляют объем до 50 мкл с нуклеазы без воды.
  2. Удаление неинкорпорированных нуклеотидов из олигонуклеотидов
    1. Подготовьте колонку G-25 , уравновешенную TE буфера (таблица 2) , следуя инструкциям изготовителя. Поместите колонку в свежей ДНКазой свободной 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
    2. Медленно добавляют 50 мкл зонда (из стадии 8.1.2) через смолу, стараясь не нарушить слой смолы. Спин в течение 2 мин при 350 мкг для сбора очищенного образца в центрифужную пробирку на 1,5 мл. Промыть колонку G-25 с 36 мкл нуклеазы без воды и спина в течение 2 мин при 350 мкг, чтобы собрать его в микроцентрифужных трубки.
  3. Скрещивание с комплементарной цепью олаigonucleotide
    1. Перенос радиоактивно меченого зонда (86 мкл) в 1,5 мл трубки микроцентрифужных и добавляют 200 нг обратного олигонуклеотида и 1 раз в буфере для отжига (таблица 2). Тепло 5 мин при 95 ° С и оставляют на ночь при комнатной температуре для охлаждения.
    2. Подготовить нерадиоактивных двухцепочные олигонуклеотиды добавлением 50 нг немеченного прямого и обратного олигонуклеотида и 1 раз в буфере для отжига в 1,5 мл трубки микроцентрифужных. Составляют объем до 100 мкл с нуклеазы без воды. Тепло и держать при комнатной температуре, как описано в пункте 8.3.1.

9. Подготовка неденатурирующем полиакриламидном геле для EMSA

  1. Подготовьте 4% нативный гель (10 х 12 см) с 1,5 мм пространства-расчески (смотри таблицу 2 для гелевой композиции). Очистите все стеклянные пластины с использованием дистиллированной воды.
    Примечание: Очень важно, чтобы пластины быть полностью свободным от ионного детергента, как SDS.
  2. Сразу рнаше решение акриламид между пластинами и позволяют полимеризации продолжить (примерно 30 мин).
  3. Соберите устройство электрофореза и заполнить бак с 0,5 × КЭ. Предварительно запустить гель в течение 30 мин до 1 ч при 150 В до загрузки образца.

10. ДНК реакции связывания

  1. В 1,5 трубки микроцентрифужных мл, добавляют 10 мкг ядерного экстракта (стадия 4.3) , в 1x Gel Смена буфера для связывания (таблица 2) и составляют конечный объем до 10 мкл с нуклеазы без воды. В качестве контроля, подготовить трубку, без ядерного экстракта. Для реакции конкуренции, добавить 1 мкл холодной неспецифической или специфической двухцепочечной олигонуклеотида (этап 8.3.2).
  2. Добавить 1 мкл радиоактивного зонда со стадии 8.3.1 к каждой реакции. Инкубируют реакционную смесь при комнатной температуре в течение 20 мин. Добавляют 1 мкл 10х буфера гель загрузки на реакцию и загружать каждую пробу на гель, приготовленный в разделе 9.
  3. Выполнить гель в течение 1 1/2 до 2 часов при температуре 150 В. После миграции, обернуть гель и стекло в полиэтиленовую пленку и положение в кассете экспозиции под люминесцентным экраном. Оставьте кассету при температуре 4 ° С в течение 24 ч.
  4. Удалить экран из кассеты экспонирования и вставить в устройство формирования изображения люминофора для сканирования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Свежий плацента от срока беременности были использованы для выделения первичных ворсинчатых cytotrophoblasts человека провести множество экспериментов, представленных в разделе протокола. После их изоляции, мы сначала проанализировали чистоту cytotrophoblasts через использование цитокератин-7 маркера (рисунок 1). Клеточные препараты , таким образом , окрашивали с использованием моноклонального анти-Цитокератин-7 антитела. На рисунке 1 представляет резуль...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Исследования в области плацентарной функции и человеческого развития были значительно улучшены с помощью протоколов, направленных на оптимизацию изоляции различных популяций плацентарных клеток. Одним из наиболее хорошо изученных плацентарной клеточной популяции остается ворсинчатого cytotrophoblasts, изучение которых значительно извлекли выгоду из оптимизированных протоколов, позволяющих эффективную и надежную изоляцию. Это позволило в дальнейшем ряд экспериментов, таких как трансфекция и промоторов исследований. С пом...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом Национального и технических наук Научно-исследовательский совет Канады (NSERC) (# 298527) (BB). КТ была поддержана институциональной FARE науки. AV была поддержана Ph.D. NSERC Грэм Белл стипендия. BB провели исследования Канады кресло в ретровирусологии человека (уровень 2). Благодаря Беатрикс Beisner за помощь в пересмотре текста.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
HBSS без  Ca2+, Mg2+ Sigma#H2387
HBSS (10x)Sigma#14060-057
DMEM Высокий уровень глюкозы без HepesGibco#12100-061
Hepes (1 M)Gibco#15630-080
Пенициллин-стрептомицин-неомицин (100x)Gibco#15640-055
Амфотерицин B Sigma#A2411
CaCl2Sigma#C4901
MgSO4.7H2O Sigma#M
Фетальная бычья сывороткаGibco#16170-078 
Перколл Sigma#P-1644Для градиента плотности
Syncytin-2 siRNAAmbion Life technologies#AM16708
Scrambled siRNAQiagen# SI03650318
DNase ISigma-Aldrich#D5025
Trypsine, тип I Сигма#T8003
ДхармаФЕКТ Липотрансфектия  реагенты GEhealthcare# T-2001-01
Trypsin/EDTALife technologies#25300-062
Коктейль ингибиторов протеазыRoche Diagnostic#11873580001
Набор для анализа белка BCA PierceThermo Scientific#23225
BSASigma#A7906
TWEEN 20Sigma#P9416 
Антикроличий IgG, HRP-связанные антитела Клеточная сигнализация#7074
BM Хемилюминесценция Вестерн-блоттинг-субстрат (POD)Roche Diagnostic#11500708001
DPBS Life technologies#14287-080
T4 ПолинуклеотидкиназаNEB
АТФ, [γ-32P]Perkin Elmer#BLU002A100UC
AcrylmideSigma 
TEMEDLife technologies#17919
Персульфат аммонияSigma 
Клон антитела к цитокератину-7 человека LP5K, конъюгированный с FITCмиллипорCBL194Fразведении 1:200
FcR Miltenyi Biotec130- 059-901Разведение 1:10
Проточный цитометр BD Acuri системаBecton Dickinson
Microporator MP-100 аппарат Цифровой
буфер R (неоновая трансфекционная система 100  &микро; l Kit)Технологии жизниMPK10096
мембраны из ПВДФ MilliporeIPVH00010 Активация с помощью метанола
Антитело к человеческому GAPDHSanta Cruz Biotechnologysc-1371791:500
Пероксидаза лошадиной редьки (HRP) - конъюгированное антитело козы против кролика или антитела против мышиCell Signalling#70741:10 000
Пероксидаза лошади (HRP) - конъюгированное с пероксидазой козы против мышейCell Signalling#7076 1:10,000
NE-PER Реагент для ядерной и цитоплазматической экстракцииThermo Scientific#78833
G-25 колонка GE Healthcare#27-5325-01
Аппарат хемилюминесценсцентной и флуоресцентной визуализацииMontré al BiotechFusion FX5
4% нативный гельДомашнее производство
PBSДомашний1x
Персональный молекулярный имиджер (PMI) СистемаBioRad
#M0201S #A9099#A3678 реагентом для блокирования биоресуспензионный

Ссылки

  1. Huppertz, B. Placental origins of preeclampsia: challenging the current hypothesis. Hypertension. 51, 970-975 (2008).
  2. Huppertz, B. IFPA Award in Placentology Lecture: Biology of the placental syncytiotrophoblast--myths and facts. Placenta. 31, Suppl . S75-S81 (2010).
  3. Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol. Biol. 550, 73-87 (2009).
  4. Morrish, D. W., et al. In vitro cultured human term cytotrophoblast: a model for normal primary epithelial cells demonstrating a spontaneous differentiation programme that requires EGF for extensive development of syncytium. Placenta. 18, 577-585 (1997).
  5. Forbes, K., Desforges, M., Garside, R., Aplin, J. D., Westwood, M. Methods for siRNA-mediated reduction of mRNA and protein expression in human placental explants, isolated primary cells and cell lines. Placenta. 30, 124-129 (2009).
  6. Vargas, A., et al. Syncytin-2 plays an important role in the fusion of human trophoblast cells. J. Mol. Biol. 392, 301-318 (2009).
  7. Toufaily, C., Lokossou, A. G., Vargas, A., Rassart, E., Barbeau, B. A CRE/AP-1-Like Motif Is Essential for Induced Syncytin-2 Expression and Fusion in Human Trophoblast-Like Model. PLoS One. 10, e0121468(2015).
  8. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  9. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
  10. Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21, 733-741 (2000).
  11. Desforges, M., et al. The SNAT4 isoform of the system A amino acid transporter is functional in human placental microvillous plasma membrane. J. Physiol. 587, 61-72 (2009).
  12. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 7413-7417 (1987).
  13. Guilbert, L. J., et al. Preparation and functional characterization of villous cytotrophoblasts free of syncytial fragments. Placenta. 23, 175-183 (2002).
  14. Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
  15. Ma, B., Zhang, S., Jiang, H., Zhao, B., Lv, H. Lipoplex morphologies and their influences on transfection efficiency in gene delivery. J. Control. Release. 123, 184-194 (2007).
  16. Freeley, M., Long, A. Advances in siRNA delivery to T-cells: potential clinical applications for inflammatory disease, cancer and infection. Biochem. J. 455, 133-147 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Метод микропорированияанализ EMSAпроточная цитометриявестерн-блоттингсиРНК к синцитину-2взаимодействие ДНК и белкаизоляция первичных клетокжизнеспособность клеток
миРНК Трансфекция и EMSA Анализы на свежеизолированных ворсинок Cytotrophoblasts человека
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.