Сканирующая электронная микроскопия из размоченной ткани для визуализации внеклеточный матрикс

Summary

Здесь показан метод визуализации ультраструктуры внеклеточного матрикса в децеллюляризированных тканях сердца.

Abstract

Фиброз является компонентом всех форм сердечных заболеваний, независимо от этиологии, и хотя в области биологии сердечного матрикса был достигнут большой прогресс, все еще существуют большие пробелы, связанные с тем, как формируется матрица, как отличается физиологическое и патологическое ремоделирование, и, самое главное, как динамикой матрицы можно манипулировать, чтобы способствовать заживлению и ингибировать фиброз. В настоящее время не существует вариантов лечения для контроля, профилактики или обращения вспять сердечного фиброза. Отчасти причина, вероятно, заключается в самой сложности образования сердечных рубцов, таких как образование после инфаркта миокарда, чтобы немедленно заменить мертвые или умирающие кардиомиоциты. Внеклеточный матрикс сам по себе участвует в ремоделировании, активируя резидентные клетки, а также помогая направлять инфильтрирующие клетки к мертвому поражению. Матрица также является своего рода хранилищем для матрицеллюлярных белков, которые имеют решающее значение для нормального оборота матрикса, а также для фиброзной сигнализации. Кроме того, было продемонстрировано, что матрица играет электромеханическую роль в сердечной ткани. Большинство методов оценки фиброза не являются качественными по своей природе, а скорее дают количественные результаты, которые полезны для сравнения двух групп, но не дают информации, связанной с базовой матричной структурой. Здесь представлена методика визуализации ультраструктуры сердечного матрикса. Сканирующая электронная микроскопия децеллюляризованной сердечной ткани выявляет поразительные различия в структуре, которые в противном случае могли бы быть упущены при использовании традиционных количественных методов исследования.

Introduction

Фиброз нарушает нормальную коллагеновую сеть миокарда, что имеет решающее значение для нормальных механистических функций кардиомиоцитов ^1,2, а также для межклеточной коммуникации, внутриклеточной сигнализации и выживания клеток ³. Развитие фиброза является основным фактором, определяющим сердечную функцию, и фиброзное ремоделирование сердечного интерстиция, возникающее в результате различных этиологий, приводит к увеличению жесткости левого желудочка и диастолической дисфункции ⁴. Фиброз миокарда также может приводить к аритмии, и независимо от того, является ли прогрессирование фиброзного ремоделирования общим или местным явлением, оно в значительной степени связано с плохим прогнозом у пациентов с ишемической и неишемической кардиомиопатией^. Кроме того, отсутствие фиброза миокарда является сильным предиктором функционального восстановления желудочков и долгосрочной выживаемости ⁶.

Отличительной чертой фиброза является отложение избытка коллагена, который имеет прочность на разрыв стали ⁷ и может негативно повлиять на функцию кардиомиоцитов на нескольких уровнях. Механические силы, возникающие в результате чрезмерного содержания коллагенового матрикса, могут привести к атрофии кардиомиоцитов ^8,9, пассивной жесткости тканей ¹⁰, индуцированной тоническим сокращением жесткости миокарда ^11-13 и снижению доставки кислорода к оставшейся популяции кардиомиоцитов. Щелевое соединение кардиомиоцитов и myoFbs также может нарушить электрические характеристики сердца, создавая больший риск развития аритмий ^14-16. Периваскулярный фиброз изменяет вазомоторную реактивность интрамуральных коронарных артерий и артериол ¹⁷ и способствует сужению просвета, что снижает поступление кислорода и, таким образом, выживаемость кардиомиоцитов ^17-22. Патогенное фиброзное и электрическое ремоделирование, исходящее из начального очага ишемического повреждения или энергетического дисбаланса, неизбежно прогрессирует до сердечной недостаточности.

Некроз кардиомиоцитов инициирует фиброзную реакцию, и последующее неблагоприятное фиброзное ремоделирование может произойти независимо от этиологии. Поиск способа контроля сердечного фиброза был бы клинически полезен для лечения ишемических и идиопатических кардиомиопатий, гипертонической болезни сердца, гипертрофической кардиомиопатии, клапанных пороков сердца и дистрофинопатий ^23-42. Независимо от того, с чего начинается процесс фиброзной болезни, растворимые профибротические факторы могут пересекать интерстициальное пространство и провоцировать активацию интерстициальных и адвентициальных фибробластов на участках, удаленных от первоначального фиброзного рубца, создавая каскадный эффект, который в конечном итоге приводит к сердечной недостаточности. Оптимальным сценарием было бы использование фибриллогенного процесса с помощью таргетной терапии, которая может быть применена во время компенсаторной гипертрофической стадии кардиомиопатии, прежде чем она перейдет в систолическую насосную недостаточность, диастолическую сердечную недостаточность или другие исходы терминальной стадии. Конечная цель состоит в том, чтобы обратить вспять фиброз, чтобы можно было заменить мертвые кардиомиоциты и полностью восстановить функцию сердца.

Важность матрицы широко известна, но методы изучения матрицы ограничены в основном количественными измерениями основных структурных компонентов, в частности коллагена, и относительными уровнями различных матриц и матрицеллюлярных белков. Этот протокол подчеркивает редко используемую технику, которая полезна для оценки качественных различий в сердечном матриксе. Этот метод недавно был использован для сравнения и сопоставления фундаментальных различий в сердечных матрицах из разных этиологий сердечных заболеваний (у эксплантов человека), для исследования сердец свиней после инфаркта, получавших изоформу нейрегулина-1β с глиальным фактором роста (GGF), по сравнению с необработанными животными ⁴³, а также для зондирования различий в матрицах сердечных тканей от MDX мышей (часто используемая животная модель мышечной дистрофии Дюшенна) в разном возрасте и по сравнению с контрольной группой дикого типа. Этот метод был впервые представлен докторами Колфилдом и Боргом в 1979 ^{году, но} с тех пор лишь немногие исследования использовали этот мощный метод ^45-47, вновь представленный здесь с небольшими изменениями. Эта методология является ценным исследовательским инструментом, поскольку она предоставляет качественную информацию об ультраструктуре внеклеточного матрикса, которую в противном случае можно было бы упустить из виду при простом измерении содержания компонентов матрикса и/или уровня фиброза.

Protocol

Заявление по этике: протоколы для обработки животных были одобрены Вандербильта Институциональные уходу и использованию животных комитета (IACUC, протоколы число М / 10/117 (свиной) и М / 10/219 (мышей) и проводится в соответствии с AAALAC-Международными стандартами. Использование насыпным сердечных тканей человека была одобрена Vanderbilt University Medical Center (IRB протокол номер 100887).

1. Сбор образцов и хранение

1. Сделать свежий 4% глутарового альдегида в растворе 0,1 М фосфатном буфере (PB).
   ВНИМАНИЕ: Глютаральдегид токсичен, перчатками и работу в вытяжном шкафу.
   1. Сделать 0,2 М исходного раствора PB, рН 7,4 , используя 21,8 г Na ₂ HPO ₄ и 6,4 г NaH ₂ PO _4. Quantum Satis (Qs) до 1000 мл дН ₂ O.
   2. Добавить 400 мкл 50% глутаральдегида до 2,5 мл PB исходного раствора и 2,1 мл дН ₂ O.
2. Погрузитесь не кусок (размером не более 2 см ²⁾ ткани в 4% -ный раствор глутарового альдегида. Примечание: Более мелкие куски могут быть также использованы , но должны быть достаточного размера (размером не менее 5 мм ²⁾ , чтобы быть легко визуализированы на глаз, чтобы облегчить последующие этапы протокола.
3. Инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч, а затем хранить неопределенно долго при температуре 4 ° С.

2. Decellularization ткани сердца

1. Сделать свежий 10% -ный водный раствор гидроксида натрия с использованием 10 г NaOH гранул / 100 мл дН ₂ O.
   ВНИМАНИЕ: NaOH растворы вызывают коррозию и может вызвать ожоги щелочью, носить перчатки.
2. Полоскание ткани в дН ₂ O.
3. Выдержите в 10% растворе NaOH при комнатной температуре в течение 6 - 10 дней (до изменения ткани от красновато-коричневого до грязно-белого или белого цвета).
4. Полоскание в дН ₂ O , пока ткань не станет прозрачным.
5. Погружают ткань в 1% дубильной кислоты в течение 4 ч при комнатной температуре. Используйте 1 мл 5% раствора на акции 4 мл дН ₂ O.
   ВНИМАНИЕ: Дубильные кислотыявляется сильным раздражителем, носить перчатки.
6. Полоскание в дН ₂ O в течение ночи.

3. Osmication и Обезвоживание ткани сердца (в вытяжном шкафу для безопасности)

1. Сделать 0,2 М исходного раствора какодилатном натрия буфера с использованием 21,4 г какодилате натрия, 10,0 г хлорида кальция и 450 мл дН ₂ O. Смешать, затем добавляют соляную кислоту по мере необходимости для доведения рН до 7,4. Qs до 500 мл с дН ₂ O.
   ВНИМАНИЕ: натрия какодилат и соляная кислота являются токсичными, перчатками и работу в вытяжном шкафу.
2. Сделать 2% водный раствор с концентрацией осмия в вытяжном шкафу для безопасности путем растворения 1 г четырехокиси осмия кристалл в 50 мл дН ₂ O.
   ВНИМАНИЕ: четырехокись осмия представляет серьезную опасность для ингаляции; пара фиксации слизистых оболочек или глазных яблок можно, следовательно, обрабатывать только в вытяжном шкафу в перчатках. Рекомендуется брызговик.
3. Полоскание ткани в 0,1 М буфере какодилатном натрия (смесь исходного раствора 1: 1 с дН _{2 O) в течение 5 мин на ротатор (или мягком помешивании).}
4. Повторите предыдущий шаг дважды, в общей сложности три буфера полосканий.
5. Погрузите ткань в 1% осмия в 0,1 М буфере какодилатном натрия (смешать какодилате запас натрия и запас осмий осмия 1: 1) на ротатор в течение 1 ч.
6. Полоскание ткани в 0,1 М буфере какодилатном натрия 3 раза в течение 5 мин каждый на ротатора.
7. Полоскание ткани с использованием возрастающих концентраций этанола (30%, 50%, 75%, 85%, 95%, и, наконец, 100%) в течение 15 мин каждый на ротатора.

4. Подготовка поверхности Сечение SEM

1. Передача ткани в 100% этаноле в плоскую чашку Петри, также содержащей 100% этанола.
2. Держите две очень острые лезвия бритвы, такие, что квартиры сторон находятся в контакте друг с другом и Сквозные края, чтобы сформировать две стороны равностороннего треугольника над образцом. Для достижения этой цели, использовать левую руку, чтобы поместить одно лезвие на дальней правой стороне образца ипорез влево. В то же время, используйте правую руку, чтобы поместить второе лезвие на дальнем левом углу образца и среза вправо. Таким образом, лопасти будут скользить относительно друг друга с противоположных сторон, чтобы сделать одну гладкую разреза.
3. Наденьте плоские стороны лезвия друг против друга, чтобы сделать очень чистый срез образца с минимальным искажением или разрывая силы, предпочтительно подвергая, как большую площадь поверхности, насколько это возможно без повреждения образца.
4. Повторите эти действия для каждого образца, чтобы выставить чистейшие возможные поперечные сечения поверхности для исследования в РЭМ.

5. Точка сушки Критический (CPD) ткани сердца

1. С помощью шпателя или пинцет для передачи ткани в держатель образца критической точки сушилки (CPD), гарантируя, что ткань остается в 100% этаноле в любое время. Убедитесь, что держатель погружен в этаноле и что передача достигается с помощью ткани подвергаются воздействию воздуха в течение не более чем на несколько секунд.
2. Эксплуатация CPD за намипо эксплуатации Er для завершения 3 продувки и заполнения циклов, чтобы заменить этанол с жидким диоксидом углерода.
3. Эксплуатация CPD ​​за руководство пользователя для достижения критической точки сушки образцов и вернуть их к атмосферному давлению с контролируемой вентиляцией СО _2.

6. Монтаж сердца образцов тканей для SEM

1. Подготовка образца заглушки SEM для каждого образца, путем приклеивания клейку углерода на верхней поверхности алюминиевой заглушкой.
2. С помощью стереомикроскопа, тщательно придерживаться образца к клеевой с поперечным сечением выбранной поверхности лицевой стороной вверх (от вкладки, видимый), и как можно ближе к параллельно плоскости поверхности образца окурка. Не зондировать или прикасаться к поверхности интереса.
3. Перерыв деревянный аппликатор для достижения конусообразную кисть, идеально подходит для нанесения краски. Применение серебра или углерода краски у основания и стороны образца, чтобы улучшить соблюдение окурка.
4. Продлить очень тонкую линию серебра или углерода краска вплоть до края поверхности интереса, чтобы обеспечить путь заряда от поверхности интереса к земле.
5. Нанести 2 или 3 маленьких мазков из серебра или углеродной краски по всему периметру вкладки углерода, чтобы обеспечивать проводимость из вкладки углерода поверхности к металлической заглушкой и, таким образом, к земле.
6. Разрешить проводящая краске высохнуть в течение двух часов.
7. Эксплуатация устройства для нанесения покрытия каждого распылени руководстве пользователя, чтобы применять относительно тяжелое покрытие (целевой диапазон 30 - 40 нм), золото-палладиевого сплава или золота. Насос образца камеры приблизительно 0,1 мбар; установить таймер на 40 сек. Открытый Установить клапан на 8:00 позиции (умеренного потока газа аргона). Нажмите кнопку Старт, чтобы начать покрытие распылением при 30 мА. Фиолетовый тлеющий разряд должен быть виден в образце камеры.

7. SEM Исследование сердца образцов тканей

1. Выполнение сканирующей электронной микроскопии при относительно низком ускоряющего напряжения, чтобы свести к минимуму изображения рroblems, связанные с плохой рассеивание заряда в образце (зарядка). Похожие условия начальная визуализация являются: 5 кВ ускоряющего напряжения, 10 мм рабочее расстояние.
2. С помощью опытного оператора, Наймите увеличил рабочее расстояние, чтобы расширить глубину резкости в условиях, требующих визуализации фокус волокон в нескольких фокальных плоскостях или волокон, проходящих в течение значительной длины в размерности г.
   1. Для микроскопа , используемого здесь (см таблицу материалов), в доступе пользовательского интерфейса на вкладке навигации в правом верхнем углу.
   2. Перейти на вкладку Координаты в меню Stage. Чтобы увеличить рабочее расстояние, введите большее значение в миллиметрах для координаты Z и нажмите на Перейти на вкладку, чтобы переместить сцену образец введенному рабочее расстояние.
3. С помощью опытного оператора, использовать наклон образца и угол поворота в положение поверхности интереса, ортогональной электронным пучком. Дополнительный угол наклона от 10 до 30 градEES из этого положения может улучшить наблюдение и документирование матричной структуры.
   1. Для микроскопа , используемого здесь (см таблицу материалов), в пользовательском интерфейсе, нажмите и удерживайте правую кнопку мыши, а затем проведите пальцем влево или вправо , чтобы сосредоточить внимание на образец вблизи периферии подготовленной плоскости поверхности интерес, отметив целенаправленный рабочее расстояние ,
   2. Переход с ручного джойстика интерфейса пользователя для перемещения вблизи противоположной кромки поверхности и повторите фокус. Если рабочее расстояние не равно примерно равна первой позиции, наклона образца для достижения приблизительное согласование в обоих местах с помощью вкладки Координаты меню Stage (7.2) и введите значение наклона в T координат.
   3. Поворот SPECIMEN на девяносто градусов (введите значение в поле R координат) и повторите процесс, пока все позиции не ориентированы примерно на том же рабочем расстоянии.
      Примечание: переменное давление при этом может быть использовано для улучшения рассеивания зарядаесли доступно. Высокий вакуум стандартный рабочий режим для сканирующей электронной микроскопии.

Results

Выделенное методика была применена к сердечной ткани от неиспользованного человеческого трансплантата сердца донора (рис 1), эксплантированных тканей от реципиентов, сердца от дикого типа и дистрофических мышей (рисунок 3), и в пост-инфарктов образцах миокарда сердца от свиньи модель повреждения сердца (Рисунок 2). Как показано на рисунке 1, сердечная матрица человеческого представляет собой сложную плетение сшитых белко...

Discussion

Подготовка Сечение поверхности является наиболее важным шагом в процессе протокола. Чтобы сохранить тонкую структуру, обезвоженные образцы должны оставаться в 100% этаноле в любое время до тех пор, пока вводить в процесс критической точки сушки. Поэтому нарезка образцов для достижения поверхности для EM экспертизы должно быть сделано в то время как образцы погружают в этаноле в неглубокой посуде. Кроме того, важно, чтобы открытая поверхность не затрагивается или зондировали во время последующей обработки. Каких-либо сер...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Хлорид кальция	Электронная микроскопия Науки	12340	100 г
Углеродный адгезив	Электронная микроскопия Науки	12664	30 г
Углеродные адгезивные вкладки	Электронная микроскопия Науки	77825	заказать оборки
Лезвия бритвы с двойным лезвием Нержавеющая сталь Ted	Pella, Inc	121-6	250/кг
Этанол	Электрон Микроскопия Науки	15055	450 мл
Глутеральдегид, 50% раствор	Электронная микроскопия Науки	16310	Класс EM, дистилляция очищенная
Соляная кислота	Электронная микроскопия	Науки 16760 или 16770	100 мл
Мононатрия фосфат<суб>2PO<суб>4	Сигма-Олдрич	S9251-250G	250 г
Осмий Тетраоксидная	электронная микроскопия	Науки 19100	1 г
серебряного проводящего адгезивного	электронного микроскопии Науки	12686-15	15 г
Гидроксид натрия (NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045-1KG	1 кг
двухосновного фосфата натрия (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S3264-500G	500 г
дубильной кислоты, 5% Водный	Электронная микроскопия	Науки 21702-5	500 мл
Тригидрат Какодилат натрия	Электронная микроскопия	Науки 12300	100 г
Золото-палладиевый сплав или Gold	Аффинажные системы, Inc.	варьируется	в зависимости от производителя и модели напыляемого устройства
Critical Point Dryer	Electron Microscopy Sciences	850
Простые деревянные аппликаторы	Fisher Scientific	23-400-102
Quanta 250 Environmental SEM	FEI	Q250 SEM
Sputter Coater	Cressington Scientific Instruments Ltd.	Модель 108
Алюминий SEM Огрызки образцов	электронной микроскопии Науки	75220-12	специфичные для мискроскопа