Многоцветная флуоресценция обнаружения для дроплета Microfluidics Использование оптических волокон

Summary

Многоцветное флуоресцентное детектирование в капельной микрофлюидике обычно включает в себя громоздкие и сложные системы детектирования на основе эпифлуоресцентного микроскопа. Здесь мы опишем компактную и модульную схему многоцветного обнаружения, которая использует массив оптических волокон для временного кодирования многоцветных данных, собранных одним фотодетектором.

Abstract

Флуоресцентные анализы являются наиболее распространенными показаниями, используемыми в капельной микрофлюидике из-за их ярких сигналов и быстрой временной реакции. Такие приложения, как мультиплексные анализы, эволюция ферментов и сортировка клеток с помощью молекулярной биологии, требуют обнаружения двух или более цветов флуоресценции. Стандартные многоцветные системы детектирования, которые связывают лазеры в свободном пространстве с эпифлуоресцентными микроскопами, громоздки, дороги и сложны в обслуживании. В данной работе мы описываем схему многоцветного детектирования путем возбуждения дискретных областей микрофлюидного канала с помощью лазеров, сопряженных с оптическими волокнами. Излучаемый свет собирается оптическим волокном, соединенным с одним фотодетектором. Поскольку возбуждение происходит в разных пространственных местах, идентичность излучаемого света может быть закодирована как временной сдвиг, что устраняет необходимость в более сложных схемах фильтрации света. Система использовалась для обнаружения популяций капель, содержащих четыре уникальные комбинации красителей, и для обнаружения субнаномолярных концентраций флуоресцеина.

Introduction

Капельные микрофлюидики обеспечивают платформу для высокой пропускной способности биологии путем compartmentalizing экспериментов в большом количестве водных капелек , взвешенных в носителе масла ^1. Капельки использовались для применения в качестве различных как одного клеточного анализа ^2, цифровой полимеразной цепной реакции (ПЦР) ^3, и фермент эволюции ^4. Флуоресцентные анализы стандартный режим обнаружения для микрофлюидики капель, так как их яркие сигналы и быстрого времени отклика совместимы с определением объемов капельные суб-nanoliter по ставкам килогерц. Многие приложения требуют обнаружения флуоресценции в течение по крайней мере двух цветов одновременно. Например, наша лаборатория обычно выполняет ПЦР-активированный капельные сортировки экспериментов , которые используют один канал обнаружения для результата анализе, и использует вторичный фон краситель , чтобы сделать тест-отрицательный капелька счетная ^5.

Типичные станции обнаружения для микрофлюидики капельных являются баСЭД на эпифлуоресцентной микроскопов, и требуют сложных световых схем манипуляции, чтобы ввести свет возбуждения от свободных космических лазеров в микроскоп, чтобы быть сфокусирован на образце. После того, как флуоресценция испускается из капелькой, испускаемый флуоресцирующих свет фильтруется таким образом, чтобы каждый канал обнаружения использует один фотоэлектронный умножитель (ФЭУ), завязанный на полосе длин волн. Эпифлуоресцентной микроскоп на основе оптических систем обнаружения обеспечивают барьер для выхода на рынок из-за их счет, сложности и необходимости технического обслуживания. Оптические волокна обеспечивают средства для создания упрощенной и надежной схемы обнаружения, так как волокна могут быть вручную вставлены в микрожидкостных устройств, устраняя необходимость прокладки света зеркала на основе, и позволяя легкие пути к сопрягаться с использованием волоконно-оптических соединителей.

В этой статье мы опишем сборку и проверку компактной и модульной схемы для выполнения многоцветной флуоресцентной детекции с использованием массива оптических волокон апда одиночный фотодетектор ^6. Оптические волокна связаны с отдельными лазерами и вставлены нормально к форме L канала потока при регулярных пространственных смещений. Коллекция флюоресценции волокна ориентированы параллельно областей возбуждения и подключен к одному ФЭУ. Поскольку капелька проходит через лазерные лучи в разные моменты времени, данные, записанные с помощью ФЭУ показывает временное смещение, которое позволяет пользователю различать флуоресценции, испускаемой после того, как капелька возбуждается каждого отдельного лазерного луча. Этот временной сдвиг исключает необходимость разделения излучаемого света для отдельных ФЭУ с использованием ряда дихроичных зеркал и полосовых фильтров. Для того, чтобы проверить эффективность детектора, мы количественной оценки флуоресценции в популяциях капельных заключающих красители разного цвета и концентрации. Чувствительность системы исследуется для обнаружения одного цвета флуоресцеина, и показывает способность обнаруживать капли с концентрацией до 0,1 нМ, в 200х чувствительности улучшения мovement по сравнению с последними подходами волокна на основе описанных в литературе ^7.

Protocol

1. SU8 Мастер изготовления

1. Конструкция Микрожидкостных структуры для изготовления трехслойного с помощью разработки программного обеспечения и имеют конструкции напечатанные поставщика на печатной плате пленки с разрешением 10 мкм. Детали конструкции прибора приведены в прилагаемой ссылке ⁶ и геометрические формы каналов показаны на рисунке 1. Слои должны включать меток выравнивания , чтобы помочь расстанавливать функции от каждого изготовления слоя ^8.
2. Поместите предварительно очищенную 3 дюйма диаметром кремниевой пластины на спин для нанесения покрытий и включите вакуум, чтобы прикрепить ее к патроне. Нанести 1 мл SU8-3050 в центре пластины и спина в течение 20 сек при 500 оборотах в минуту, а затем 30 с при 1750 оборотах в минуту, обеспечивая толщину слоя 80 мкм.
3. Удалите пластину и выпекать на 135 & deg; C плитке в течение 30 мин. Дайте вафля остыть до комнатной температуры, прежде чем перейти к следующему шагу.
4. Выставляют пластины на 1 - ^й маски слоя , покрытого под коллимирован- 190 мВт, 365 нм светодиод в течение 3 мин. После экспозиции, поместите пластину на C конфорки 135 ° в течение 1 мин, затем охлаждают до комнатной температуры, прежде чем перейти к следующему шагу.
5. Поместите пластину на спин для нанесения покрытий и включите вакуум, чтобы прикрепить ее к патроне. Нанести 1 мл SU8-3050 в центре пластины и спина в течение 20 сек при 500 оборотах в минуту, а затем 30 с при 5000 оборотах в минуту, в результате чего слой, который обеспечивает дополнительную толщину 40 мкм.
6. Удалите пластину и испечь на 135 ° C плитке в течение 30 мин, затем охлаждают до комнатной температуры, прежде чем перейти к следующему шагу.
7. Совместите маску 2 - ^й слой на геометрии узорной в 1.3 и подвергать пластины с покрытием коллимированному 190 мВт, 365 нм светодиода в течение 3 мин. После экспозиции, поместите на 135 ° C плитке в течение 4 мин 30 сек, а затем охлаждают до комнатной температуры, прежде чем перейти к следующему шагу.
8. Поместите пластину на спин для нанесения покрытий и включите вакуум, чтобы прикрепить ее к патроне. Нанести 1 мл SU8-3050 в центре пластины и спина в течение 20 сек при 500 оборотах в минуту, а затем 30сек при 1000 оборотах в минуту, в результате чего слой, который обеспечивает дополнительную толщину 100 мкм.
9. Удалите пластину и испечь на 135 ° C плитке в течение 30 мин, затем охлаждают до комнатной температуры, прежде чем перейти к следующему шагу.
10. Совместите маску 3 - ^го слоя на геометрию узорной в 1.3 и подвергать пластины с покрытием коллимированному 190 мВт, 365 нм светодиода в течение 3 мин. После экспозиции, поместите на 135 ° C плитке в течение 9 мин, а затем охлаждают до комнатной температуры, прежде чем перейти к следующему шагу.
11. Разработка маски, погружая в перемешиваемой бане монометилового эфира пропиленгликоля ацетата в течение 30 мин. Промыть пластины в изопропаноле и выпекать на 135 ° C плитке в течение 1 мин. Поместите разработанный мастером в 100 мм чашки Петри для полидиметилсилоксана (PDMS) под давлением.

2. PDMS изготовления приборов

1. Подготовка 10: 1 PDMS путем объединения 50 г силиконового основания с 5 г отвердителя в пластиковую чашку. Смешайте содержимое с помощью роторного инструмента, снабженного перемешивающим палочкой. градусне в качестве смеси внутри эксикаторе в течение 30 мин, или пока все пузырьки воздуха не будут удалены.
2. Налить PDMS, чтобы дать толщину 3 мм над мастером и поместите обратно в эксикатор для дальнейшей дегазации. После того, как все пузырьки будут удалены, выпекать устройство при температуре 80 ° С в течение 80 мин.
3. Обрежьте устройство из пресс-формы, используя скальпель и место на чистой поверхности с узорной стороной вверх и удар жидкостный впускные и выпускные отверстия с трепанобиопсия 0,75 мм. Устройство должно быть разрезан таким образом, что высокие геометрий 120 мкм и 220 мкм, доступны со стороны устройства.
4. Плазменный лечить устройство, с помощью функции стороной вверх, вместе с предварительно очищенную 2 дюйма на 3 дюйма стекло на 1 мбар O ₂ плазмы в течение 20 секунд в плазме очиститель 300 Вт. Скрепить устройство PDMS, помещая узорчатую сторону устройства PDMS на плазменной обработки стороне предметного стекла. Поместите устройство в C духовке 80 ° и выпекать собранное устройство в течение 40 мин.
5. Рендер каналыгидрофобный с помощью шприца для промывки устройства с фторированной обработки поверхности жидкости. Сразу же выпекать устройство при температуре 80 ° С в течение 10 мин для испарения растворителя.

3. Получение оптических компонентов

1. Подготовьте лазерное волокно возбуждения путем удаления изоляции от последнего 5 мм сердцевины 105 мкм, оболочки 125 мкм, NA = 0,22 оптическое волокно.
2. Подготовьте 2 - ^й цветной лазерный волокно возбуждения путем повторения 3.1 для 2 - ^го идентичного волокна.
3. Подготовьте волокно для сбора сигнала флуоресценции путем повторения 3.1 для сердцевины 200 мкм, оболочки 225 мкм, NA = 0,39 оптическое волокно.
4. Проверьте кончики всех волокон - если кончики не заканчиваются на плоской поверхности, повторно расщепляют концы с волокном писца.
5. Приложить лазерный волоконный ответвитель 50 мВт, 405 нм лазера и прикрепить один из основных волокон к лазеру 105 мкм. Прямой зачищенный конец на датчике мощности лазераметр, и использовать точную настройку лазерного ответвителя, чтобы максимизировать мощность лазера.
6. Повторите 3.5 для нм лазера 50 мВт, 473.
7. Смонтировать 446/510/581/703 нм квадроциклов полосовых фильтров на ФЭУ с помощью объектива трубы, чтобы блокировать лазерный луч и передавать испускаемый флуоресценции. Прикрепите волоконный ответвитель так, что свет проходит через фильтры прежде, чем поразить ФЭУ.
8. Приложите волокно от 3,3 до блока собранного в 3.7.

4. Offline Смешанная Эмульсия Generation

1. Получить фокус потока микрофлюидики dropmaker устройство с отверстием мкм 60 мкм х 60.
2. Заполните 1 мл шприц с HFE 7500 масла с 2% ионной фторсодержащего ^9.
3. Заполните серию 1 мл шприцы со следующими комбинациями флуоресцеина (FITC) и декстран-конъюгированные голубых красителей (CB) в PBS: 1 нМ ФИТЦ / 10 нМ CB, 10 нМ ФИТЦ / 10 нМ CB, 1 нМ ФИТЦ / 100 нМ CB, и 10 нМ ФИТЦ / 100 нМ СВ.
4. Установите устройство dropmaker на сцене перевернутой микроновсправиться и водные и масляные шприцы на шприцевые насосы. Пара шприцы к устройствам с помощью PE-2 трубки.
5. Запуск шприцевые насосы со скоростью 500 мкл / ч для масла и 250 мкл / ч для водных растворов, создать смесь 80 мкм капель, содержащих растворы с 4,3. Для каждого типа водного образца, используют свежий устройство dropmaker для устранения перекрестного загрязнения. Сбор ~ 200 мкл эмульсии из каждой комбинации красителя в пустой шприц.
6. После того, как 4 типа капельки были собраны в единую коллекцию шприц, смешайте эмульсию путем многократного вращением шприца.
7. Повторите шаги 4.2-4.6 с водными растворами, содержащими 0,1, 1, 10 и 100 нМ FITC в PBS.

5. Волоконно-оптические вставки

1. Поместите микрожидкостных чип, изготовленный на шаге 2 на стадии инвертированного микроскопа в сочетании с цифровой камерой, способной <100 мкс скорости затвора.
2. тщательно Работая со стороны, InSeк.т. волокно, соединенное с лазером 473 нм в дальний канал вверх по течению 120 мкм, следя за тем, чтобы не через прокол на основной канал потока.
3. Вставьте волокно, соединенное с лазером 405 нм в самый дальний вниз по течению мкм высокого бокового канала 120, обеспечивая расстояние волокна 300 мкм.
4. Вставьте ПМТ-соединенный волокно в 220 мкм высотой канала по нормали к двум волокнам лазерного возбуждения.

6. Флуоресцентная Обнаружение смешанных Эмульсии

1. Монтирование 5 мл шприц, заполненный HFE 7500 с 2% ионной фторсодержащего к распорной входе масла устройства обнаружения с ПЭ-2 трубки.
2. Установите шприц, содержащий смешанный FITC / CB эмульсии на вертикально ориентированной шприцевой насос, и пара на входе капелька реинжекции устройства с использованием PE-2 трубки. Подключите длину PE-2 трубки от выхода устройства в контейнер для отходов.
3. Премьер-устройство с помощью не работает каждый из насосов при 1000 мкл / ч до тех пор, какмасла и капельки видно, регулярно совмещая в устройстве и течет вниз по течению.
4. Регулировка скорости потока таким образом, чтобы распорки масло работает на частоте 6000 мкл / ч и капли в количестве 100 мкл / ч, что обеспечивает значительное расстояние между каплями, проходящих через область детектирования.
5. Включите лазеров, запустите программу сбора данных, а также регулировки усиления ФЭУ, чтобы обеспечить сигналы, которые более чем 100x базового уровня шума. Регулировка мощности лазера, так что все пики дублетных отчетливо видны на одном, линейно масштабируется timetrace.
6. Приобретать 60 сек timetrace PMT напряжения по меньшей мере, 20 кГц. Импорт данных в вычислительную программу, такие как Matlab и измерить высоту пиков регистрируемых дублетов с использованием сценария пользовательских вычислений программы.
   Примечание: Это предусмотрено в качестве дополнительной информации.
7. Повторите шаги 6.2-6.7 с использованием FITC-только смешанную эмульсию, созданную в 4,7, с нм лазер 405 выключен.

Results

Изготовление устройства PDMS , который позволяет для вставки оптических волокон требуется многоэтапную процедуру фотолитографии для создания каналов различной высоты (рисунок 1). Во-первых, высокий слой SU-8 80 мкм формуют на кремниевой подложке и с рисунком, используя маску, чтобы создать геометрию обработки жидкости. Далее, еще 40 мкм слой SU-8 вращают на пластину, и с рисунком, используя вторую маску, чтобы создать функции, которые будут формировать высокие лазерные в...

Discussion

Обнаружение Оптоволоконный требует выравнивания оптических волокон относительно каналов для текучей среды. Поскольку наше устройство использует каналы программы передач изготавливаемых с многослойным фотолитографии, размещение масок по отношению друг к другу имеет большое значение. Если волоконный каналы расположены слишком близко к каналу жидкости, существует возможность утечки жидкости; если направляющие каналы расположены слишком далеко или криво, сигнал флуоресценции, собранные волокна обнаружения может быть значите...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Фотошаблоны	CadArt Servcies
3" силиконовые пластины, тип P, первичный тестовый класс	University Wafers	447
SU-8 3035	Microchem	Y311074
SU-8 2050	Microchem	Y111072
Sylgard 184 набор силиконовых эластомеров	Krayden	4019862
1 мл шприцы	BD
шприцы 10 мл	BD	309604
27 игл Гоге	BD	305109
PE 2 полиэтиленовые трубки	Scientific Commodities, Inc.	B31695-PE/2
Novec 7500	Fisher Scientific	98-0212-2928-5	Широко известен как HFE 7500
ионного криптокса поверхностно-активного вещества			в ссылке #10
Декстран-сопряженный каскадный синий краситель	Life Technologies	D-1976
Флуоресцеиновая натриевая соль	Sigma	28803
Четырехполосовой фильтр	Semrock	FF01-446/510/581/703-25
PMT	Thorlabs	PMM02
Оптоволоконный порт	Thorlabs	PAFA-X-4-A
Трубка для линз	Thorlabs	SM1L05
Патч-кабель с 200 μ м сердечник / 225 μ m облицовка оптического волокна с одним зачищенным концом и одним разъемом FC/PC	Thorlabs	Custom
Patch cable с 105 μ м ядро / 125 μ m облицовка оптическое волокно с одним зачищенным концом и одним разъемом FC/PC	Thorlabs	Custom
125 μ m инструмент для зачистки волокна	Thorlabs	T08S13
225 μ m инструмент для снятия изоляции волокна	Thorlabs	T10S13
лазерный волоконный адаптер	OptoEngine	FC/PC адаптер
405 нм CW лазер на 50  mW	OptoEngine	MDL-III-405	Распределитель для CNI лазеров
473 нм непрерывного лазера на 50	Оптодвигатель	mW MLL-FN-473-50