Этот протокол эффективно направляет эмбриональных стволовых клеток мыши, полученных окончательное энтодермы для зрелых эпителиальных клеток дыхательных путей. Эта методика дифференциации использует 3-мерные decellularized каркасы легких направить спецификации клонов легких, в определенной, не содержащей сыворотки настройки культуры.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Генерация ESC происхождения мыши эпителиальных клеток дыхательных путей с использованием легких Decellularized Строительные леса
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Lung родословная дифференциация требует интеграции сложных экологических сигналов, которые включают в себя передачу сигналов фактора роста, межклеточных взаимодействий и клетка-матрица взаимодействий. Из - за этой сложности, рекапитуляцию развития легких в пробирке способствовать дифференциации стволовых клеток в легких эпителиальных клеток было сложной задачей. В этом протоколе decellularized подмости легочные используются для имитации 3-мерную среду легкого и генерировать полученной из культур клеток эпителиальных клеток дыхательных путей стволовых клеток. Эмбриональных стволовых клеток мыши сначала дифференцированы в энтодермы линии с использованием метода культуры эмбриоидного тела (EB) с энтодермы клетками активина A. Затем высевали на decellularized подмостей и культивировали при воздушно-жидкостной интерфейс на срок до 21 дней. Этот метод способствует дифференциации посеянных клеток к функциональным эпителиальных клеток дыхательных путей (реснитчатые клетки, клубные клетки и базальных клеток) без дополнительного добавок фактора роста. Эта установка культуры определяется, Серум-свободный, недорогой и воспроизводимым. Хотя существует ограниченное загрязнение от не-легочных энтодермальных линий в культуре, этот протокол генерирует только в дыхательных путях эпителиальные населения и не приводят к гиперплазии эпителиальных клеток. Эпителий дыхательных путей, генерируемые с этим протоколом могут быть использованы для изучения клеточной матрицы взаимодействий во время органогенеза легких и для моделирования заболевания или наркотиков обнаружения платформ дыхательных патологий, таких как кистозный фиброз.
Введение
Направленной дифференцировки плюрипотентных клеток к линии легкого зависит от точных сигнальных событий в микросреде 1,2. Из - за динамической природы этого процесса он был сложным , чтобы имитировать точные события органогенеза легких в лабораторных условиях . Последние отчеты использовали пошаговый стратегии ограничения родословная с фактором роста растворимы добавок двумерных культур для достижения дифференциации легких 3-8. В ступенчатых протоколов дифференцировки, плюрипотентные клетки, то ли эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, были впервые дифференцированы к окончательному энтод....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами для животных комитета по охране госпиталя для больных детей Научно-исследовательского института.
1. Подготовка Эшафот
- Decellularization легких
- Эвтаназии взрослых крыс линии Вистар с использованием СО 2 камеры. Поместите животное в камеру и начать воздействия 100% СО 2 при скорости заполнения 10-30% от объема камеры в минуту.
- Заметим, животное для бессознательности; это произойдет после того, как приблизительно 2-3 мин. Если потеря сознания не происходит в этот период времени, проверьте скорость и камеры уплотнения заполнения. Пос....
- Эвтаназии взрослых крыс линии Вистар с использованием СО 2 камеры. Поместите животное в камеру и начать воздействия 100% СО 2 при скорости заполнения 10-30% от объема камеры в минуту.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Как указано в этом протоколе, надежная дифференциация окончательного энтодермы созревать дыхательные пути эпителиальные клетки могут быть достигнуты с использованием расширенной культуры посеяны клеток на decellularized секций строительных лесов легких. Рекомендуется, чтобы decellularized подмости быть охарактеризован для обеспечения (1) клетки-хозяева полностью удалены, и (2) белки внеклеточного матрикса сохраняются до использования Каркасы для дифференцировки. Decellularization может б.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Протокол, описанный здесь, генерирует зрелый эпителий ESC полученные в дыхательных путях, используя только каркасы природного легкого направлять дифференцировку без других добавок. Эта установка культура определяется, не содержащей сыворотки, недорогой и воспроизводимым. Ни один фактор роста добавок базовой дифференцировки не требуется. Ранее опубликованные способы получения клеток , полученных эпителиальные клетки легких стволовых использовали 2-мерных стратегий с фактором роста добавок для содействия ограничению клоно.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Там нет конкурирующих финансовых интересов в таможенной декларации.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить д - ра Rossant и доктора Bilodeau для mcherry ESC Nkx2-1 , используемых в экспериментах , изображенных на рисунках 1-3. FACS проводили в SickKids-UHN проточной цитометрии фонда. Эта работа была поддержана операционной гранты от Канадского института исследований в области здравоохранения и грант инфраструктуры (CSCCD) из Канадского фонда инноваций.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильно>Реагенты | |||
| перфузионный раствор | Sigma | H0777 | 10 Ед/мл гепарин |
| Перфузионный раствор | Gibco | 14170112 | растворенный в сбалансированном солевом растворе Хэнка (HBSS-) |
| Децеллюляризация раствор | BioShop | CHA003 | 8 Решение для |
| децеллюляризации | Sigma | E9884 | 25 Решение для |
| децеллюляризации | BioShop | SOD002 | 1 Раствор |
| для децеллюляризации | Gibco | 14190-144 | растворенный в нуклеазе |
| бензоназы | PBS Novagen | 70664-3 | 90 U/ml Нуклеаза бензоназы |
| Бензоназа нуклеаза | Gibco | 14190-144 | разведенная в PBS |
| Антимикробном растворе | Gibco | 15140 | 200 U/ml пенициллин стрептомицин |
| Антимикробный раствор | Gibco | 15290 | 25 μ г/мл амфотерицин B |
| Антимикробный раствор | Gibco | 14190-144 | разведенный в PBS |
| Trypsinization | Gibco | 12605-028 | TrypLE |
| Сыворотка Среда для свободной дифференцировки (SFDM) | Gibco | IMDM 2440-053, F12 11765-054 | Соотношение IMDM и ветчины 3:1 Модифицированная среда F12 |
| Безсывороточная среда для дифференцировки (SFDM) | Gibco | 12587-010 | Добавка B27 (50-кратное разведение) |
| Бессывороточная дифференцировочная среда (SFDM) | Gibco | 17502-048 | Добавка N2 (100-кратное разведение) |
| Бессывороточная дифференцировочная среда (SFDM) | Gibco | 15260-037 | 0,05% (Фракция V) Бычий сывороточный альбумин |
| Сывороточная среда для свободной дифференцировки (SFDM) | Gibco | 35050-061 | 200 mM Глутамакс |
| Сыворотка для свободной дифференцировки (SFDM) | Sigma | M6145 | 4 μ M монотиоглицерин |
| Сыворотка для свободной дифференцировки (SFDM) | Sigma | A4403 | 0.05 мг/мл аскобиновая кислота |
| индукция энтодермы | R& D | 338-AC/CF | Activin A |
| Антитела | |||
| CDH1 | BD Biosciences | 610181 | мыши, неконъюгированный, 1:100 |
| C-KIT | BD Biosciences | 558163 | крыса, PE-Cy7, 1:100 |
| CXCR4 | BD Biosciences | 558644 | крыса, APC, 1:100 |
| KRT5 | Abcam | ab24647 | Кролик, неконъюгированный, 1:1,000 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | Кролик, неконъюгированный, 1:200 |
| Laminin | Novus Biologicals | NB300-144 | Кролик, неконъюгированный, 1:200 |
| SCGB1A1 | Santa Cruz | sc-9772 | Коза, неконъюгированный, 1:1,000 |
| SOX2 | R& D Systems | AF2018 | Козлятник, неконъюгированный, 1:400 |
| TRP63 | Santa Cruz | sc-8431 | Мышь, неконъюгированная, 1:200 |
| TUBB4A | BioGenex | MU178-UC | Мышь, неконъюгированная, 1:500 |
| Козья IgG | Invitrogen | A-11055 | Осел, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Мышь IgG | Invitrogen | A-21202 | Осел, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Мышь IgG | Invitrogen | A-31571 | Осел, Alexa Fluor 647, 1:200 |
| Кролик IgG | Invitrogen | A-21206 | Осел, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Кролик IgG | Invitrogen | A-31573 | Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200 |
| Other Materials | |||
| Low adherent plates | Nunc | Z721050 | Пластины с низким содержанием связывания, 6 лунок |
| Мембраны воздушно-жидкостного интерфейса | Ватман | 110614 | гидрофобная нуклеопорная мембрана, 8 μ m размер пор |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Leica Vibratome |
| Тканевый клей | Ted Pella | 10033 | Pelco тканевый клей |
Ссылки
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Daley, W. P., Peters, S. B., Larsen, M. Extracellular matrix dynamics in development and regenerative medicine. J. Cell....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
