Методическая статья

Генерация ESC происхождения мыши эпителиальных клеток дыхательных путей с использованием легких Decellularized Строительные леса

DOI:

10.3791/54019

⸱

5 мая 2016 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology and Experimental Medicine, Peter Gilgan Centre for Research and Learning, Hospital for Sick Children

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол эффективно направляет эмбриональных стволовых клеток мыши, полученных окончательное энтодермы для зрелых эпителиальных клеток дыхательных путей. Эта методика дифференциации использует 3-мерные decellularized каркасы легких направить спецификации клонов легких, в определенной, не содержащей сыворотки настройки культуры.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lung родословная дифференциация требует интеграции сложных экологических сигналов, которые включают в себя передачу сигналов фактора роста, межклеточных взаимодействий и клетка-матрица взаимодействий. Из - за этой сложности, рекапитуляцию развития легких в пробирке способствовать дифференциации стволовых клеток в легких эпителиальных клеток было сложной задачей. В этом протоколе decellularized подмости легочные используются для имитации 3-мерную среду легкого и генерировать полученной из культур клеток эпителиальных клеток дыхательных путей стволовых клеток. Эмбриональных стволовых клеток мыши сначала дифференцированы в энтодермы линии с использованием метода культуры эмбриоидного тела (EB) с энтодермы клетками активина A. Затем высевали на decellularized подмостей и культивировали при воздушно-жидкостной интерфейс на срок до 21 дней. Этот метод способствует дифференциации посеянных клеток к функциональным эпителиальных клеток дыхательных путей (реснитчатые клетки, клубные клетки и базальных клеток) без дополнительного добавок фактора роста. Эта установка культуры определяется, Серум-свободный, недорогой и воспроизводимым. Хотя существует ограниченное загрязнение от не-легочных энтодермальных линий в культуре, этот протокол генерирует только в дыхательных путях эпителиальные населения и не приводят к гиперплазии эпителиальных клеток. Эпителий дыхательных путей, генерируемые с этим протоколом могут быть использованы для изучения клеточной матрицы взаимодействий во время органогенеза легких и для моделирования заболевания или наркотиков обнаружения платформ дыхательных патологий, таких как кистозный фиброз.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Направленной дифференцировки плюрипотентных клеток к линии легкого зависит от точных сигнальных событий в микросреде 1,2. Из - за динамической природы этого процесса он был сложным , чтобы имитировать точные события органогенеза легких в лабораторных условиях . Последние отчеты использовали пошаговый стратегии ограничения родословная с фактором роста растворимы добавок двумерных культур для достижения дифференциации легких 3-8. В ступенчатых протоколов дифференцировки, плюрипотентные клетки, то ли эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, были впервые дифференцированы к окончательному энтодермы зародышевого слоя. Энтодермальная клетки впоследствии доводятся до передней энтодермы судьбы, а затем к клеткам-предшественников легких, которые, как определено выражением гомеодоменовым содержащих фактора транскрипции NKX2-1. Эти клетки-предшественники легких были дополнительно дифференцированы проксимальных (дыхательные пути) или дистальных (альвеолярных) эпителиальных клетках легких Wiго фактора роста по-прежнему добавок. Такие 2-мерные стратегии имели некоторый успех в создании легких эпителиальных клеток, однако есть несколько ограничений, включая неясными эффективности, возможного загрязнения от других энтодермальных линий, отсутствие 3-мерного (3D) структуры, а в некоторых случаях использование неопределенных культур с добавками сыворотки. Культура плюрипотентные или дифференцированных клеток на decellularized каркасах легких все чаще используется в качестве анализа для оценки регенеративный потенциал посеянных клеток в формировании легочных эпителиальных структур 3,5,6,8,9. Такие отчеты культуры высевали клетки на каркасах с продолжающимся фактором роста или сыворотки добавок.

Развитие легкого включает в себя разделение, миграцию, экспрессию генов и дифференцировки отдельных клеток в ответ на сигналы окружающей среды. Внеклеточного матрикса (ЕСМ) является решетчатой ​​гликопротеинов, которые в дополнение к обеспечению структурной поддержки, направляет Tissuе формообразование путем интеграции и регулирования этих процессов 10,11. При использовании ECM легких строительных лесов в качестве естественной платформой для энтодермы культуры , чтобы лучше имитировать в естественных условиях легких среду развития, мы сгенерировали стволовых клеток , полученных эпителиальных клеток дыхательных путей в определенной 3D-культуры настройки с высокой эффективностью и воспроизводимостью.

Крыса легких ECM каркасы были сгенерированы decellularization, а также мышь ESC-полученных энтодермальных клеток были получены и впоследствии высевали на этих каркасах. Двойное выражение CXCR4 & C-KIT белков указывает на окончательную идентичность клеток энтодермы и клеток положительный результат как для SOX2 и экспрессии NKX2-1 идентифицированы как клетки в дыхательных путях (проксимальная легких) предшественниках. Definitive энтодермальные клетки культивировали при воздушной жидкости интерфейс (ALI) на срок до трех недель для создания функциональной эпителиальных клеток дыхательных путей в пробирке.

Этот протокол способствует легких клонов дифференциации опреденый энтодерма уже 7 дней, наблюдаемые с появлением NKX2-1 + / + SOX2 ранние проксимальных клеток - предшественников легких. На 14 -й день и 21 культуры популяций зрелых клеток в дыхательных путях эпителиальных появляются , в том числе ресничного (TUBB4A +), клуб (SCGB1A1 +) и базальных (TRP63 +, KRT5 +) клеток с морфологической и функциональной схожести с носителями дыхательных путей мыши. Этот протокол демонстрирует важность 3D-матрицы микросреды для достижения надежной дифференциации для эпителиальных клеток дыхательных путей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами для животных комитета по охране госпиталя для больных детей Научно-исследовательского института.

1. Подготовка Эшафот

  1. Decellularization легких
    1. Эвтаназии взрослых крыс линии Вистар с использованием СО 2 камеры. Поместите животное в камеру и начать воздействия 100% СО 2 при скорости заполнения 10-30% от объема камеры в минуту.
      1. Заметим, животное для бессознательности; это произойдет после того, как приблизительно 2-3 мин. Если потеря сознания не происходит в этот период времени, проверьте скорость и камеры уплотнения заполнения. После потери сознания, наблюдать за животное выцветшие глаза и отсутствие дыхания. Если оба наблюдаются, поддерживать наполнение СО 2 в течение 1-2 мин , а затем удалить животное из камеры для процедуры.
    2. Закрепить животное рассекает поверхность, фиксируя передними лапами и задними ногами, и брызги вниз грудь и область живота с 70% этанола. Доступ к сердцу и луNGS путем открытия грудной полости с использованием вертикальный разрез вдоль грудины.
    3. Сделать небольшие надрезы через диафрагму сначала вызвать легкие втягиваться, уменьшая вероятность прокола легких. Лигирования нижней полой вены с швом и поместите небольшой разрез в левом предсердии с небольшими рассекающих ножницами.
    4. Используя приготовленный шприц объемом 10 мл с 25 G иглой, заполненную сбалансированным солевым раствором гепаринизированной Хэнкса (HBSS) (10 ед / мл гепарина в HBSS), начинают перфузию легких, вставив иглу в правый желудочек, чтобы толкать буфер через легочный кровоток (скорость 2 мл / мин). Продолжайте эту процедуру, пока легкие не белеют и жидкость течет из левого предсердия чистой.
    5. После перфузии, разоблачить трахеи и иглу с пластиковым катетером возле щитовидного хряща и зафиксировать на месте с помощью шовного материала.
    6. Настройка силы тяжести системы перфузии с помощью фиксации 10 мл шприц к штативу и зажимом. Удалить и discard поршень шприца. Закрепите точку максимума наполнения на цилиндра шприца на 20 см выше легких. Приложить двусторонний запорный кран к концу шприца и длинной пластиковой трубки к другому концу запорного крана для подачи decellularization раствора в канюлированного трахеи. Налейте раствор в шприц и дайте раствор для заполнения комплектных пластиковых трубок и катетера.
      1. Лаважа легкие, заполняя к общей емкости легких (приблизительно 12 мл) в течение 1 мин и снять пластиковый катетер из трахеи, чтобы позволить жидкости вытекать из легких. Не заполняйте шприц более 10 мл , когда lavaging легкие , чтобы держать давление ниже 20 см H 2 O.
    7. Повторите промывание легких восемь раз с decellularization раствором, а затем 10 промывок фосфатно-солевым буферным раствором (PBS).
    8. Рассеките трахею и легкие, свободной от полости шеи и груди и удалить из животного. Держите ткань в холодной PBS при 4 ° С до подготовки к vibratome SEctioning.
  2. поколение толстый раздел
    1. Приготовьте приблизительно 15 мл 2% и 4% (вес / объем) агарозном, и достаточно 6% (вес / объем) агарозном для встраивания всех лепестка в небольшие прямоугольные блоки. Растворите с низкой температурой плавления порошка агарозы в PBS микроволновке. Передача агарозы в 50 мл пробирки на тепловом блоке и поддерживать температуру выше 40 ° C, чтобы избежать гелеобразования.
    2. Рассеките decellularized легких в конце каждого долевой бронх, чтобы отделить каждую лопасть (черепную, средний, аксессуар и каудальной правой долей и левой доли), используя маленькие ножницы. Пат сухой каждый лепесток с помощью абсорбирующими прокладками, чтобы удалить избыток PBS и поместить внутрь 2% (вес / объем) агарозы в то время как на нагревательном блоке.
    3. Удалите каждую лопасть через 5 мин покрытия в агарозе, поместить в чашку Петри и дайте поверхности геля в течение 1 мин на холодную пластину.
    4. Аккуратно мочки обратно в 4% (вес / объем) агарозном, остудить через 5 мин, и повторить покрытие еще раз с 6% (вес / объем) агарозы.
    5. После последовательного сотрудничестватем создания каждого лепестка, встраивать каждую лопасть по отдельности в 6% (вес / объем) агарозном геле с использованием Металлическое основание пресс-формы, по меньшей мере, 3 мм, агарозы, окружающей ткани от краев. Orient каждая лопасть с помощью щипцов, расположив большой плоский край лепестка в на поверхности металлической формы, обращенной к экспериментатору. Этот край будет стороной крепится к пластине образца для vibratome секционирования.
    6. Разрешить блоки гель на холодной плите в течение по крайней мере за 30 мин до секционирования с vibratome. Хранить блоки в увлажненной камере в течение 12 ч при температуре 4 ° С до vibratome секционирования.
    7. Настройте vibratome путем заполнения секционирования камеру с холодным PBS 12. Поддержание холодной температуры во секционирования с ванной окружающего льда. Удалить блоки из металлических пресс-форм и использовать лезвие бритвы, чтобы урезать избыток агарозы окружающих лепестка, сохраняя при этом приблизительно 3 мм от края ткани.
    8. Закрепить ткань к центру образца пластины с помощью клея и погрузить пластины в тон PBS заполненные секционирования камеру. Настройка секционирования границ на vibratome, выбрав следующие значения скорости, амплитуды и толщины соответственно: 0,2 мм / сек, 1,85 мм, и 350 мкм.
      Примечание: Обе продольные и поперечные сечения ориентации лепестка являются приемлемыми.
    9. Раздел каждая лопасть полностью. Вручную срезанные участки бесплатно с помощью небольших ножниц, если участок не полностью отделены друг от лопатки в конце последовательности секции. Сбор секций строительных лесов осторожно и не держать в PBS на льду до следующего шага.
      Примечание: Секции, сгенерированные будет включать как проксимальных и дистальных легких областей и могут быть использованы для recellularization обоих источников; Тем не менее, большая часть поверхности будет включать в себя дистальный легких.
  3. Обеззараживание секций строительных лесов
    1. Передачи, в 350 микрон толстые секции строительных лесов от PBS для микропробирок (до 30 секций / трубки) и обрабатывают нуклеазой (90 ед / мл в PBS) (см перечень материалов) в течение 12 - 24 ч при комнатной температуре, наротатор.
    2. После нуклеазная обработки, секции передачи с помощью щипцов для новых микропробирок и обрабатывают противомикробным раствором (200 ед / мл пенициллина и стрептомицина 25 мкг / мл амфотерицина В в PBS) в стерильных условиях в течение 6 ч при комнатной температуре, на ротатора.
      Примечание: Каркасы могут быть сохранены в антимикробным раствором в течение одной недели при температуре 4 ° С перед использованием.
    3. После стадии дезактивации с антимикробным раствором, полоскать подмости дважды PBS в стерильных условиях и переносят в свободной от сыворотки среде для дифференцировки (SFDM) перед посевом клеток.

2. энтодермальная Cell Подготовка

  1. Definitive энтодермы Индукционная
    1. Поддержание мыши ESC линии под фидера свободной, свободной от сыворотки культуры с использованием 2i условий 13. Начало индукции энтодермы путем удаления клеток из клейкого плюрипотентных культуры трипсинизацией.
    2. Ресуспендируют клетки в SFDM и семян при плотности 20000клеток / мл в низких прилипших планшетах в течение трех дней без замены среды, чтобы обеспечить формирование EB.
    3. Через три дня аккуратно перенести ЭТ в 50 мл конические пробирки с помощью 10 мл пипетки и дать им возможность собирать на дне в течение 3 мин при комнатной температуре.
    4. Тщательно аспирата средств массовой информации и добавить свежие SFDM, дополненной 50 нг / мл активина A.
    5. Семенной клетки обратно на низких прилипших планшеты при 1: 2 плотности и культуры в течение трех дополнительных дней для достижения окончательной дифференциации энтодермы.
  2. Окончательное обогащение эндодермы
    1. Собирают день 6 ЭТ, диссоциируют с трипсином и маркировать для с-KIT и экспрессии CXCR4 с использованием конъюгированных флуоресцентных антител 14.
    2. Сортировка меченые клетки с помощью флуоресцентной активированного сортировки клеток (FACS) для экспрессии обоих маркеров , чтобы получить обогащенную окончательное энтодермы население 15.

3. Установка Recellularization

  1. Воздух-жидкость интерфейснастройка культуры
    1. Передача каждого decellularized раздел эшафот (этап 1.2.9) из SFDM на гидрофобной плавающей мембраной (размер пор 8 мкм) с использованием стерильного пинцета. Обеспечение строительных лесов участки распределены равномерно по мембране.
    2. Подготовка 6- или 12-луночные планшеты с заполнением лунки с 1 или 0,5 мл SFDM соответственно. Аккуратно поместите мембраны в лунки, позволяя мембране плавать на поверхности носителя, создавая установки культуры воздух-жидкость.
  2. Посев 3D подмостей
    1. После FACS для окончательных маркеров энтодермы (этап 2.2.2) подсчет отсортированных клеток с использованием гемоцитометра, спином вниз при 400 мкг в течение 5 мин и ресуспендируют в SFDM. Ресуспендируют клетки, чтобы получить объем, содержащий приблизительно 100000 клеток / 10 мкл / эшафот.
    2. Для recellularize каркасы, пипетка 10 мкл клеток непосредственно на каждую подготовленную секцию со стадии 3.1.2.
    3. Заменить SFDM СМИ в культурах каждые 48 ч. Аспирируйте старые средства массовой информации, держа пластину под небольшим наклономчтобы избежать нарушения культуры. Медленно добавить свежий SFDM к культуре вдоль боковой стороны скважины с целью предотвращения затопления плавучего мембраны.
    4. Поддерживать воздух-жидкость культур до 21 дней, чтобы достичь дифференциации посеянных клеток для зрелой воздушной трассы эпителии.
      Примечание: Recellularized секции могут быть обработаны для окрашивания тканей и иммунофлюоресценции (IF) микроскопии в любой момент времени , в течение культивирования клеток 16.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Как указано в этом протоколе, надежная дифференциация окончательного энтодермы созревать дыхательные пути эпителиальные клетки могут быть достигнуты с использованием расширенной культуры посеяны клеток на decellularized секций строительных лесов легких. Рекомендуется, чтобы decellularized подмости быть охарактеризован для обеспечения (1) клетки-хозяева полностью удалены, и (2) белки внеклеточного матрикса сохраняются до использования Каркасы для дифференцировки. Decellularization может б...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол, описанный здесь, генерирует зрелый эпителий ESC полученные в дыхательных путях, используя только каркасы природного легкого направлять дифференцировку без других добавок. Эта установка культура определяется, не содержащей сыворотки, недорогой и воспроизводимым. Ни один фактор роста добавок базовой дифференцировки не требуется. Ранее опубликованные способы получения клеток , полученных эпителиальные клетки легких стволовых использовали 2-мерных стратегий с фактором роста добавок для содействия ограничению клоно...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Там нет конкурирующих финансовых интересов в таможенной декларации.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить д - ра Rossant и доктора Bilodeau для mcherry ESC Nkx2-1 , используемых в экспериментах , изображенных на рисунках 1-3. FACS проводили в SickKids-UHN проточной цитометрии фонда. Эта работа была поддержана операционной гранты от Канадского института исследований в области здравоохранения и грант инфраструктуры (CSCCD) из Канадского фонда инноваций.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>Реагенты
перфузионный растворSigmaH077710 Ед/мл гепарин
Перфузионный растворGibco14170112растворенный в сбалансированном солевом растворе Хэнка (HBSS-)
Децеллюляризация растворBioShopCHA0038  Решение для
децеллюляризацииSigmaE988425  Решение для
децеллюляризацииBioShopSOD0021  Раствор
для децеллюляризацииGibco14190-144растворенный в нуклеазе
бензоназыPBS Novagen70664-390  U/ml Нуклеаза бензоназы 
Бензоназа нуклеазаGibco14190-144разведенная в PBS
Антимикробном растворе Gibco15140200  U/ml пенициллин стрептомицин
Антимикробный раствор Gibco1529025  μ г/мл амфотерицин B
Антимикробный раствор Gibco14190-144разведенный в PBS
Trypsinization Gibco12605-028TrypLE
Сыворотка Среда для свободной дифференцировки (SFDM)GibcoIMDM 2440-053, F12 11765-054Соотношение IMDM и ветчины 3:1 Модифицированная среда F12
Безсывороточная среда для дифференцировки (SFDM)Gibco12587-010Добавка B27 (50-кратное разведение)
Бессывороточная дифференцировочная среда (SFDM)Gibco17502-048Добавка N2 (100-кратное разведение)
Бессывороточная дифференцировочная среда (SFDM)Gibco15260-0370,05% (Фракция V) Бычий сывороточный альбумин
Сывороточная среда для свободной дифференцировки (SFDM)Gibco35050-061200  mM Глутамакс
Сыворотка для свободной дифференцировки (SFDM)SigmaM61454  μ M монотиоглицерин
Сыворотка для свободной дифференцировки (SFDM)SigmaA4403 0.05  мг/мл аскобиновая кислота
индукция энтодермыR& D338-AC/CFActivin A
Антитела
CDH1BD Biosciences610181мыши, неконъюгированный, 1:100
C-KITBD Biosciences558163крыса, PE-Cy7, 1:100
CXCR4BD Biosciences558644крыса, APC, 1:100
KRT5Abcamab24647Кролик, неконъюгированный, 1:1,000
NKX2-1Abcamab76013Кролик, неконъюгированный, 1:200
LamininNovus BiologicalsNB300-144Кролик, неконъюгированный, 1:200
SCGB1A1Santa Cruzsc-9772 Коза, неконъюгированный, 1:1,000
SOX2R& D SystemsAF2018 Козлятник, неконъюгированный, 1:400
TRP63Santa Cruzsc-8431Мышь, неконъюгированная, 1:200
TUBB4ABioGenexMU178-UCМышь, неконъюгированная, 1:500
Козья IgG InvitrogenA-11055Осел, Alexa Fluor 488, 1:200
Мышь IgG InvitrogenA-21202Осел, Alexa Fluor 488, 1:200
Мышь IgG InvitrogenA-31571Осел, Alexa Fluor 647, 1:200
Кролик IgGInvitrogenA-21206Осел, Alexa Fluor 488, 1:200
Кролик IgG InvitrogenA-31573Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200
Other Materials
Low adherent platesNuncZ721050 Пластины с низким содержанием связывания,  6 лунок   
Мембраны воздушно-жидкостного интерфейса Ватман110614гидрофобная нуклеопорная мембрана, 8  μ m размер пор
VibratomeLeicaVT1200S Leica Vibratome
Тканевый клейTed Pella10033Pelco тканевый клей
mM CHAPS mM EDTA M NaCl , ,

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
  2. Daley, W. P., Peters, S. B., Larsen, M. Extracellular matrix dynamics in development and regenerative medicine. J. Cell Sci. 121 (3), 255-264 (2008).
  3. Ghaedi, M., et al. Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix. J. Clin. Invest. 123 (11), 4950-4962 (2013).
  4. Huang, S. X. L., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).
  5. Jensen, T., et al. A rapid lung de-cellularization protocol supports embryonic stem cell differentiation in vitro and following implantation. Tissue Eng. Part C: Methods. 18 (8), 632-646 (2012).
  6. Longmire, T. A., et al. Efficient derivation of purified lung and thyroid progenitors from embryonic stem cells. Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).
  7. Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nat. Biotechnol. 30 (9), 876-882 (2012).
  8. Gilpin, S. E., et al. Enhanced Lung Epithelial Specification of Human Induced Pluripotent Stem Cells on Decellularized Lung Matrix. Annal. Thorac. Surg. 98, 1721-1729 (2014).
  9. Cortiella, J., et al. Influence of Acellular Natural Lung Matrix on Murine Embryonic Stem Cell Differentiation and Tissue Formation. Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2565-2580 (2010).
  10. Princivalle, M., De Agostini, A. Developmental roles of heparan sulfate proteoglycans: a comparative review in Drosophila, mouse and human. Int. J. Dev. Biol. 46, 267-278 (2002).
  11. Thompson, S. M., Jesudason, E. C., Turnbull, J. E., Fernig, D. G. Heparan sulfate in lung morphogenesis: The elephant in the room. Birth Defects Res. Part C, Embryo Today. 90 (1), 32-44 (2010).
  12. Zimmermann, M., et al. Improved reproducibility in preparing precision-cut liver tissue slices. Cytotechnology. 61 (3), 145-152 (2009).
  13. Ying, Q. -L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  14. Fox, E., et al. Three-Dimensional Culture and FGF Signaling Drive Differentiation of Murine Pluripotent Cells to Distal Lung Epithelial Cells. Stem Cells Dev. 24 (1), 21-35 (2014).
  15. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546(2010).
  16. Shojaie, S., et al. Acellular lung scaffolds direct differentiation of endoderm to functional airway epithelial cells: requirement of matrix-bound HS proteoglycans. Stem Cell Reports. 4, 1-12 (2015).
  17. Kubo, A., et al. Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture. Development. 131 (7), 1651-1662 (2004).
  18. Longmire, T. A., et al. Efficient Derivation of Purified Lung and Thyroid Progenitors from Embryonic Stem Cells. Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).
  19. Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи