Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

РНК Очистка от внутриклеточно Grown

9.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54044

⸱

4 июня 2016 г.

 ,  , 
1The Department of Molecular Microbiology and Biotechnology, The George S. Wise Faculty of Life Sciences, Tel Aviv University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы описываем метод выделения бактериальной РНК из бактерий Listeria monocytogenes, растущих внутри мышиных макрофагов. Этот метод может быть использован с другими внутриклеточными патогенами и клетками-хозяевами млекопитающих.

Аннотация

Анализ транскриптома бактериальных патогенов во время инфекции млекопитающих является ценным инструментом для изучения генов и факторов, которые опосредуют инфекцию. Тем не менее, выделение бактериальной РНК из инфицированных клеток или тканей является сложной задачей, поскольку РНК млекопитающих в основном доминирует в лизатах инфицированных клеток. В данной работе мы описываем оптимизированный метод выделения РНК бактерий Listeria monocytogenes, растущих в макрофагальных клетках костного мозга. После заражения клетки слегка лизируются и быстро фильтруются, чтобы отбросить большую часть белков и РНК хозяина, сохраняя при этом неповрежденные бактерии. Затем бактериальная РНК выделяется с помощью экстракции горячим фенолом-SDS с последующей обработкой ДНКазой. Выделенная РНК пригодна для анализа транскрипции генов с помощью нескольких методов. Этот метод успешно используется в наших исследованиях регуляции гена Listeria monocytogenes при инфицировании клеток макрофагов 1-4. Протокол может быть легко модифицирован для изучения других бактериальных патогенов и типов клеток.

Введение

Внутриклеточные бактериальные патогены ─ бактерии , вызывающие инфекционные заболевания и способны расти и воспроизводить внутри клеток человека хозяев ─ являются серьезной проблемой здравоохранения во всем мире 5. Для того, чтобы вторгнуться и размножаться внутри клетки млекопитающих, внутриклеточные патогены приобрели сложные механизмы вирулентности и факторы. В то время как эти механизмы имеют основополагающее значение для способности вызывать заболевание, мы мало знаем о их регуляции и динамики знают. Так как профили экспрессии генов бактерий, выращенных в жидких средах, не отражают реальную среду внутри клеток-хозяев, существует растущая потребность в транскриптома анализа бактерий, выращенных в их внутриклеточных ниш. Такой анализ позволит расшифровку специфических бактериальных адаптаций сработавших хозяином и поможет определить новые цели для терапевтического дизайна. Транскриптом анализ внутриклеточно выращенных бактерий является весьма сложной задачей, поскольку РНК млекопитающих превышает число бактерий РНК вкак минимум в десять раз. В этой рукописи мы опишем экспериментальный метод для выделения бактериальной РНК из листерий бактерий , растущих внутри мышиных клеток макрофагов. Извлеченный РНК может быть использован для изучения внутриклеточных адаптации и вирулентность механизмов патогенных бактерий с помощью различных методик анализа транскрипции, таких как RT-PCR, РНК-Seq, микрочипов и других гибридизацией на основе технологий.

L. моноцитогенес является возбудителем листериоза у людей, заболевание с клиническими проявлениями , ориентированных в первую очередь лица с ослабленным иммунитетом, пожилых людей и беременных женщин 6. Это является грамположительных факультативным внутриклеточным патогеном , который вторгается широкий спектр клеток млекопитающих , которые были использованы на протяжении десятилетий в качестве модели в хозяин-патоген взаимодействий изучает 7. После вторжения, он находится первоначально в вакуоли или фагосому (в случае фагоцитирующих клеток), из которых он должен уйти в тон пройдет цитозоль клетки для репликации. Несколько факторов вирулентности было показано, опосредует процесс утечки, в первую очередь в качестве порообразующего гемолизин, Listeriolysin O (ДСО) и два дополнительных фосфолипаз 8. В цитоплазме бактерии используют хозяина машины полимеризации актина , чтобы продвинуть себя на актиновых филаментов внутри клетки и передается от клетки к клетке (Рисунок 1). Все основные факторы вирулентности L. моноцитогенес , участвующие в инвазии, внутриклеточного выживания и репликации, активируются с помощью регулятора транскрипции мастер вирулентности, PrfA. 8-10.

В последнее десятилетие было проведено несколько исследований , проведенных нами и другие успешно применяются методы транскриптом анализа внутриклеточно выращенных бактерий внутри клеток хозяина 2,11-15. Два основных подхода используются для разделения бактериальной РНК из хозяина-РНК, которые основаны на: 1) селективное обогащение бактериальной РНК и 2) выделения РНК по сиситемахrential лизис клеток. Первый подход основан на субтрактивном гибридизации общих экстрактов РНК молекулы РНК млекопитающих (например , с использованием коммерчески доступных наборов) или селективного захвата бактериальных последовательностей транскрибируемых (шотландцы) 11. Второй подход основан на дифференциальном лизис бактерий и клеток-хозяев, в котором клетки-хозяева лизируют в то время как бактериальные клетки остаются нетронутыми. Бактериальные клетки затем отделяют от клетки-хозяина лизата, как правило, путем центрифугирования, и РНК экстрагируют с использованием стандартных методик. Основная проблема с использованием этого подхода является то, что вместе с интактной бактерии, клетки-хозяева ядра также изолированы, таким образом, препараты РНК по-прежнему содержат РНК млекопитающих. Один из способов решения этой проблемы заключается в разделении неповрежденные бактерии из клеток хозяина, ядер с использованием дифференциального центрифугирования, хотя эта процедура обычно занимает много времени поднимая беспокойство изменений в гене профиля экспрессии в процессе экстракции. В этой статье мы представляем улучшенный и быстрый баПротокол экстракции cteria РНК, которая основана на клеточной дифференциального лизиса подхода. Во- первых, Л. моноцитогенес инфицированные макрофаги клетки лизируют с холодной водой. Затем макрофаг ядра удалены кратковременным центрифугированием и неповрежденные бактерии быстро собирают на фильтрах, из которых РНК выделяют с помощью горячей экстракции фенолом-SDS бактериальных нуклеиновых кислот.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: В течение всего эксперимента, макрофаг клетки инкубируют при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 приточно-инкубаторе и вынимали из инкубатора только для экспериментальных манипуляций, которые выполняются в кабинете биологической безопасности класса II. Работа с L. моноцитогенес бактерии в соответствии с биологическим уровнем безопасности 2 правил.

1. Сотовый Подготовка и бактериальные инфекции (день 1 и 2)

  1. 1 день
    1. Семенной 2,0 х 10 7 из костного мозга макрофаги (клетки BMDM) на 145 мм чашку в 30 мл BMDM + Pen-Strep средах (таблица 2). Семенной 3 пластины для каждого бактериального штамма, чтобы быть проанализированы. Инкубируют в течение ночи при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 приточно-инкубаторе.
    2. Начало ночной бактериальной культуры дикого типа (WT) L. моноцитогенес штамм 10403S в 10 мл мозга и сердца вливание (BHI) среды, при температуре 30 ° C в стандартном инкубаторе. Место культуры трубки наклонены без встряхивания. Заметка:Эти условия роста вверх-регулируют экспрессию генов жгутиков, что способствует эффективной инфекции.
  2. День 2
    1. Предварительно теплая BMDM среда (без Пен-Strep антибиотиков) (Таблица 2) и забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) , при 37 ° С.
    2. Вымойте макрофагами монослой дважды 25 мл подогретого PBS для удаления антибиотики. Добавьте 30 мл свежей BMDM среды.
    3. Промыть 1,5 мл ночной бактериальной культуры с PBS при центрифугировании бактерии при> 14.000 х г в течение 1 мин, отбрасывая супернатант и ресуспендирования бактерий осторожно в 1,5 мл PBS с помощью пипетки. Повторите дважды.
    4. Infect каждую макрофага пластину с 0,5 мл промытого ночной культуры дикого типа L. моноцитогенес. При использовании нескольких пластин, заражает каждую пластину 15 минут друг от друга. Этот временной интервал позволит заготовки каждой пластины индивидуально в конце инфекции.
      Примечание: множественность инфекции (MOI) анализируют при посеве серийным разведениемс бактериальной культуры использовали для инфицирования на чашках с BHI и подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ) после 24 ч инкубации планшетов при 37 ° С. С использованием 0,5 мл WT L. моноцитогенес напрягать 10403S результаты в УМВД ~ 100 (100 бактерий КОЕ на макрофагальной клетки). При анализе бактериальных мутантов дефектные в внутриклеточного роста, выше MOI следует рассмотреть.
    5. После 0,5 ч инкубации при температуре 37 ° С, промыть инфицированные клетки дважды с PBS, чтобы удалить неприкрепленные бактерии, и добавляют 30 мл подогретого BMDM среды. Прикрепленные бактерии будут усваивать в течение следующего 0,5 ч.
    6. Через 1 ч после инфицирования, добавить 30 мкл гентамицина (1: 1000 до конечной концентрации 50 мкг / мл), чтобы убить внеклеточные бактерии.
    7. Сборка устройства фильтра путем размещения головки фильтра на накопительную колбу жидкости с вакуумным выпускным отверстием. Затем поместите фильтр (0,45 мкм) на головке фильтра, а затем с помощью цилиндра воронки и креплению различных частей с металлической Cлампа. Подготовьте ледяную РНКазы воду.
    8. Через 6 ч после инфицирования, урожай бактерий из инфицированных клеток следующим образом. Рассматривать каждую тарелку по отдельности.
      Примечание: Как правило, L. моноцитогенес завершает 1-журнал роста в течение 6 ч инфекции в клетках макрофагов. Более длинные инкубирование может привести к бактериальному росту и гибели клеток макрофагов, в то время как более короткие периоды инкубации может привести к значительно более низкие бактериальной нагрузки. MOI и время инфицирования могут быть изменены, чтобы достичь оптимальных условий.
      1. Промыть инфицированные клетки с PBS один раз. Добавьте 20 мл охлажденного на льду не содержащей РНКазы воды, чтобы лизировать клетки макрофагов. Использование сотового скребок, скрести клетки от пластины быстро, но осторожно.
      2. Сбор лизированных клеток в коническую пробирку на 50 мл. Vortex в течение 30 сек. Центрифуга при 800 х г в течение 3 мин при температуре 4 ° С.
      3. Пропускают супернатант через устройство фильтра с использованием вакуумной системы. С помощью пинцета, катить фильтр и быстро перенести его на 15 мл Coniкал трубки. Оснастка замерзают трубы с фильтрами в жидком азоте.
      4. Собирают устройство с фильтрующей новым фильтром для следующего образца, как описано в разделе 1.2.7.
      5. Хранить замороженные фильтры при температуре -80 ° С в течение следующего дня. В качестве альтернативы, перейдем непосредственно к экстракции нуклеиновой кислоты.

2. нуклеиновые кислоты экстракции (3-й день)

Примечание: Выполнить все манипуляции с фенолом и хлороформом растворов в вытяжном шкафу.

  1. Готовят смесь 1: 1 подкисленного фенол: хлороформ, 400 мкл каждого образца. Смешайте в отдельные пробирки, а затем вывести полученный водный слой с помощью аспирации. Добавьте 40 мкл 10% SDS.
  2. Растаяйте фильтров, содержащих пробирки на лед, чтобы держать их холодно. Для каждого фильтра , содержащего пробирку добавляют 650 мкл ацетатного-ЭДТА (АЭ) буфера (таблица 2).
  3. Выполните следующие шаги как можно быстрее.
    1. Энергично вихрь трубки, содержащей фильтр таким образом,что фильтр венчиков к периферии трубы и буфер полностью промывает фильтр. Всегда держите трубки с холодным, поместив его на льду. Примечание: Может возникнуть необходимость дополнительно вихревой трубки в то время как перевернутая, чтобы полностью вымыть бактерии из фильтра.
    2. Повторите эти действия для всех труб. Может быть полезным, чтобы спин-вниз подвеску коротко (1 мин при 120 х г) в конце процесса.
  4. Перенести бактерии-содержащий буфер в 1,5 мл микроцентрифужных пробирку, содержащую ДДС и фенол / хлороформ смеси (полученного в 2.1). Повторите эти действия для всех труб. Это может быть необходимо, чтобы закрутить фильтр, содержащий трубы (1 мин при 120 х г) еще раз, чтобы получить остаточный буфер из фильтра.
  5. Поместите все в 1,5 мл трубки в вихревом устройстве с несколькими трубками и завихрение на полной скорости в течение 10 мин.
  6. Инкубировать пробирки в тепловой блок 65 ° C в течение 10 мин. Центрифуга на максимальной скорости (> 14 000 XG) в течение 5 мин.
  7. Перенести водный слой (около 400 мкл) из каждого тUbe к новой 1,5 мл пробирку, содержащую 40 мкл 3 М ацетата натрия (рН 5,2) и 1,0 мл 100% этанола. Vortex каждую пробирку тщательно.
    Примечание: Гликоген могут быть добавлены на данном этапе, чтобы улучшить визуализацию осажденного гранул.
  8. Инкубируйте образцы при -80 ° С в течение 1 часа. В качестве альтернативы, инкубировать образцов при -20 ° С в течение ночи. Затем, Центрифуга образцов при 4 ° С в течение 20 мин при максимальной скорости (> 14 000 XG).
  9. Тщательно аспирата от этанола (верхний слой) из каждой пробирки. Добавить 500 мкл холодного 70% этанола к каждому образцу и вихре тщательно. Центрифуга при 4 ° С в течение 20 мин при максимальной скорости (> 1 4000 XG).
  10. Тщательно аспирата от этанола из каждой пробирки. Сухие образцы в течение примерно 2 мин с использованием вакуумного испарителя без отопления. Не пересушивайте образцы.
  11. Добавьте 25 мкл РНКазы без воды к каждому образцу. Инкубируют при комнатной температуре в течение 20 мин. Аккуратно вихря и спин-вниз.
  12. Измерение концентрации РНК в тон пробует, используя микрообъем UV-Vis спектрофотометр. Ожидать добывать около 0,5 - 1 мкг нуклеиновых кислот на чашку.
    Примечание: Технические повторностях могут быть объединены на данном этапе.

3. ДНКазы Лечение

  1. Настройка реакции в соответствии с таблицей 1 , в пробирке. Инкубируют при 37 ° С в течение 45 мин. Добавить 450 мкл РНКазы воды и 500 мкл фенолхлороформом-МАА смеси (таблица 2), отдельные фазы центрифугированием в течение 2 мин при максимальной скорости (> 14 000 XG).
  2. Передача водного слоя в новую пробирку и добавляют 500 мкл хлороформа-МАА смеси (таблица 2), вихревые и отдельные фазы 2 мин центрифугированием при максимальной скорости (> 14 000 XG).
  3. Передача водного слоя в новую пробирку и добавляют 1 мл этанола и 50 мкл 3 М ацетата натрия (рН 5,2). Vortex.
    Примечание: Гликоген могут быть добавлены на данном этапе, чтобы улучшить визуализацию осажденного гранул.
  4. Выдержите в течение 1 ч при -80 ° С. В качестве альтернативы, инкубировать образцов при -20 ° С в течение ночи. Центрифуга при 4 ° С в течение 20 мин при максимальной скорости.
  5. Тщательно аспирата от этанола из каждой пробирки. Добавить 500 мкл холодного 70% этанола к каждому образцу и вихре тщательно. Центрифуга при 4 ° С в течение 20 мин при максимальной скорости. Тщательно аспирата от этанола из каждой пробирки.
  6. Сухие образцы в течение примерно 2 мин с использованием вакуумного испарителя без отопления. Не пересушивайте образцы.
  7. Добавьте 12 мкл РНКазы воды, инкубировать в течение 2 мин при комнатной температуре, вихревые и спин-вниз. Образцы содержат очищенный РНК, держать их на льду. В качестве альтернативы, растворить РНК в РНКазы H 2 O с 0,1 мМ ЭДТА или ТЕ - буфере (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА).
  8. Измерение концентрации РНК с использованием микрообъем UV-Vis спектрофотометр. Ожидать ~ 100 нг РНК на образец (если технические повторности объединены).
    Примечание: РНК экстрагировали в соответствии с этим протоколом подходит FOг анализ транскрипцию генов несколькими способами. Как правило , мы используем анализ RT-КПЦР для изучения L. моноцитогенес транскрипцию генов при заражении клеток макрофагов 1-4.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Система модель показана на фиг.1 , и включает в себя клетки макрофагов инфицированных L. моноцитогенес бактерии, которые копируют в цитоплазме макрофага. Рисунок 2 представляет собой схему эксперимента. На рисунке 3 представлены типичные результаты такого анализа RT-КПЦР генов вирулентности во время WT L. моноцитогенес рост макрофагов по сравнению с ростом в богатых лабораторной среде BHI. Результаты показывают уровни т...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Протокол , описанный здесь , представляет собой оптимизированный способ выделения бактериальной РНК из L. моноцитогенес бактерии растущих внутриклеточно в клетках макрофагов. Этот протокол основан на лизисе клеток дифференциального и включает в себя два основных шага для обогащения бактериальной РНК: макрофагальной ядер седиментации центрифугированием и быстрое скопление бактерий путем фильтрации. Эти шаги выполняются с помощью стандартной процедуры экстракции РНК. В то время как этот протокол описывает очистку...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Исследования в лаборатории Херсковица поддерживаются грантами 335400 ERC и R01A/109048 NIH.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Listeria monocytogenes 10403S20
Макрофаги, полученные из костного мозга, полученные из C57B/6 самок мышей21
H2O, без РНКазыThermo Scientific10977-015Можно использовать воду, обработанную DEPC
DMEMGibco41965039
глютаминGibco25030081
пируват натрияGibco11360-088
β-меркаптоэтанолGibco31350010
Pen/StrepGibco15140-122
Гентамицинсигма-ОлдричG1397
FBSGibco10270106
Dulbecco' s Фосфатно-солевой буфер-PBSSigma-AldrichD8537
Мозговая инфузия сердца (BHI)Merckmillipore1104930500
Фенол насыщенный pH 4,3FisherBP1751I-400
ХлороформFisherBP1145-1
Изоамиловый спиртSigma-AldrichW205702
Ацетат натрияSigma-Aldrich
EDTASigma-AldrichEDS
DNaseIFermentasEN0521
SDS 10%Sigma-AldrichL4522
Абсолютный этанолMerck Millipore1070174000
37 ° C, 5% CO2 инкубатор с принудительной подачей воздухаThermo ScientificModel 3111
Скребки для ячеекNunc179693
Kontes держатель стекла для фильтров 45 ммFisherK953755-0045
MF-Millipore фильтры 45  мм, 0.45  &микро; mMerck MilliporeHAWP04700
система SpeedVacThermo ScientificSPD131DDA
Vortex-Genie 2Scientific IndustriesModel G560E
NanoDropThermo Scientific
145 мм чашки для клеточных культурGreiner639 160
пробирки 1,7 мл, без РНКазыAxygenMCT-175-C
30 ° C инкубаторThermo Scientific
65 ° C нагревательный блокThermo Scientific
4 ° C столовая центрифугаEppendorf5417R
Стерильные пипетки, пробиркиGreiner
мл, жидкий
, W302406Falcon 25 азот Greiner 50 мл

Ссылки

  1. Lobel, L., et al. The metabolic regulator CodY links Listeria monocytogenes metabolism to virulence by directly activating the virulence regulatory gene prfA. Mol Microbiol. , (2014).
  2. Lobel, L., Sigal, N., Borovok, I., Ruppin, E., Herskovits, A. A. Integrative genomic analysis identifies isoleucine and CodY as regulators of Listeria monocytogenes virulence. PLoS Genet. 8 , e1002887(2012).
  3. Kaplan Zeevi, M., et al. Listeria monocytogenes multidrug resistance transporters and cyclic di-AMP, which contribute to type I interferon induction, play a role in cell wall stress. J Bacteriol. 195, 5250-5261 (2013).
  4. Rabinovich, L., Sigal, N., Borovok, I., Nir-Paz, R., Herskovits, A. A. Prophage excision activates Listeria competence genes that promote phagosomal escape and virulence. Cell. 150, 792-802 (2012).
  5. World Health Organization WHO. , http://www.who.int/en/ (2005).
  6. Swaminathan, B., Gerner-Smidt, P. The epidemiology of human listeriosis. Microbes Infect. 9, 1236-1243 (2007).
  7. Hamon, M., Bierne, H., Cossart, P. Listeria monocytogenes: a multifaceted model. Nat Rev Microbiol. 4, 423-434 (2006).
  8. Dussurget, O., Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Molecular determinants of listeria monocytogenes virulence. Ann Rev Microbiol. 58, 587-610 (2004).
  9. Portnoy, D. A., Auerbuch, V., Glomski, I. J. The cell biology of Listeria monocytogenes infection: the intersection of bacterial pathogenesis and cell-mediated immunity. J Cell Biol. 158, 409-414 (2002).
  10. Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen. Nat Rev Microbiol. 7, 623-628 (2009).
  11. Graham, J. E., Clark-Curtiss, J. E. Identification of Mycobacterium tuberculosis RNAs synthesized in response to phagocytosis by human macrophages by selective capture of transcribed sequences (SCOTS). Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 11554-11559 (1999).
  12. Toledo-Arana, A., et al. The Listeria transcriptional landscape from saprophytism to virulence. Nature. 459, 950-956 (2009).
  13. Schnappinger, D., et al. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment. J Exp Med. 198, 693-704 (2003).
  14. Albrecht, M., Sharma, C. M., Reinhardt, R., Vogel, J., Rudel, T. Deep sequencing-based discovery of the Chlamydia trachomatis transcriptome. Nucleic Acids Res. 38, 868-877 (2010).
  15. La, M. V., Raoult, D., Renesto, P. Regulation of whole bacterial pathogen transcription within infected hosts. FEMS Microbiol Rev. 32, 440-460 (2008).
  16. Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nat Rev Microbiol. 10, 618-630 (2012).
  17. Rienksma, R. A., et al. Comprehensive insights into transcriptional adaptation of intracellular mycobacteria by microbe-enriched dual RNA sequencing. BMC Genomics. 16, 34(2015).
  18. Afonso-Grunz, F., et al. Dual 3'Seq using deepSuperSAGE uncovers transcriptomes of interacting Salmonella enterica Typhimurium and human host cells. BMC Genomics. 16, 323(2015).
  19. Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells. J Immunol Methods. 184, 281-283 (1995).
  20. Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5, e00969-e900914 (2014).
  21. Celada, A., Gray, P. W., Rinderknecht, E., Schreiber, R. D. Evidence for a gamma-interferon receptor that regulates macrophage tumoricidal activity. J Exp Med. 160, 55-74 (1984).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Внутриклеточные бактерииэкстракция горячим фенолом и SDSобработка ДНКазойвыделение бактериальной РНКудаление нуклеиновых кислот хозяинасбор на фильтраханализ транскриптома
РНК Очистка от внутриклеточно Grown
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.