Методическая статья

Стволовых клеток На основе Engineered иммунитет против ВИЧ-инфекции в модели Гуманизированные мыши

DOI:

10.3791/54048

⸱

2 июля 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает методы построения гуманизированной модели мышей костного мозга/печени/тимуса с помощью искусственного иммунитета против ВИЧ-инфекции, основанного на стволовых клетках.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С быстрым развитием генной терапии на основе стволовых клеток против ВИЧ, существует требование для прессования животной модели для изучения дифференцировки гемопоэтических и иммунной функции генетически модифицированных клеток. Гуманизированное костного мозга / печени / Тимус (BLT) Мышиная модель позволяет полное воссоздание человеческой иммунной системы на периферии, которая включает в себя Т-лимфоциты, В-лимфоциты, клетки NK и моноцитов. Тимуса имплантат человека также позволяет тимуса селекции Т-клеток в аутогенной тимуса ткани. В дополнение к изучению ВИЧ-инфекции, модель выступает в качестве мощного инструмента для изучения дифференциации, развитие и функциональные возможности клеток, полученных из гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). Здесь мы наметим строительство гуманизированного не страдающих ожирением диабетической (NOD) -severe комбинированным иммунодефицитом (SCID) -Общие гамма - цепи нокаута (с = Г - / -) мышей -Bone мозга / печени / тимус (NSG-BLT) с ГСК трансдуцированных с CD4 химерного рецептора антигена (CD4CAR)лентивирусов вектор. Покажем, что CD4CAR ГСК могут успешно дифференцироваться в множественные клоны и обладают активностью против ВИЧ. Цель исследования состоит в том, чтобы продемонстрировать использование NSG-BLT модели мыши в качестве модели в естественных условиях для сконструированного иммунитета против ВИЧ. Стоит отметить, что, так как лентивирусов и ткани человека используется, эксперименты и операции должны быть выполнены в шкафу II класса биологической безопасности в биологической безопасности 2-го уровня (BSL2) с соблюдением специальных мер предосторожности (BSL2 +) объекта.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Несмотря на успех комбинированной антиретровирусной терапии, ВИЧ-инфекция по-прежнему является пожизненное заболевание. Клеточный иммунный ответ против ВИЧ-инфекции играет чрезвычайно важную роль в борьбе с ВИЧ-репликации. Последние достижения в области манипулирования стволовых клеток позволило для быстрого развития генной терапии подходы к лечению ВИЧ - 1-3. В результате, важно иметь надлежащую животную модель , которая позволяет в естественных условиях исследования эффективности клеточной терапии против ВИЧ.

Работа с ВИЧ, в моделях на животных осложняется тем фактом, что вирус заражает только клетки человека. Чтобы обойти это ограничение, ученые прибегают к использованию модели заболеваний , как вирусом иммунодефицита обезьян (SIV) в макак - резусов 4,5. К сожалению, существуют серьезные ограничения в этой модели из-за присущей различий между видами и различия между SIV и ВИЧ. Кроме того, только узкоспециализированные объекты являются сapable поддерживать работу с приматами нечеловеческих и каждого макаки требует больших инвестиций. Таким образом, существует настоятельная потребность в модели, которая использует иммунную систему человека, которая восприимчивы к ВИЧ-инфекции / патогенеза, и менее финансово непомерно высокой.

Без ожирения диабетические (NOD) -severe комбинированным иммунодефицитом (SCID) -Общие гамма - цепи нокаута (с γ - / -) (или NSG) Кровь / Печень / тимус (BLT) модель гуманизированное мышь все более доказал, что является важным инструментом для изучения ВИЧ-инфекции. Имплантацией гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и фетальной вилочковой железы мышей способны развиваться и резюмировать человека иммунную систему 1-3. Один тип генной терапии, основанной стволовых клеток включает в себя «перенаправлять» периферических Т-клеток целевой ВИЧ путем перепрограммирования гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) к дифференцировке в антиген-специфических Т-клеток. Ранее мы показали, что инженерные ГСК с молекулярным клонированного анти-ВИЧ-специфических Т-клеток ререцептор (TCR) по отношению к эпитопу SL9 (аминокислоты 77-85; SLYNTVATL) ВИЧ-1 Gag может переадресовать стволовых клеток в формировании зрелых Т - клеток , которые подавляют репликацию ВИЧ в гуманизированного NSG-BLT модели мыши 6. Оговоркой использования молекулярного клонированный TCR, что оно ограничено конкретным человеческого лейкоцитарного антигена (HLA) подтипа, которые ограничивают применение этой терапии. Химерный антиген рецепторов (CAR), с другой стороны, может быть универсально применен ко всем подтипам HLA. Первоначальные исследования были проведены с использованием CAR, построенную с внеклеточных и трансмембранных доменов человеческого CD4, слитого с внутриклеточным z, домен CD3 сигнализации (называется CD4ζCAR). CD4ζCAR экспрессируются на клетках CD8 Т - могут распознавать оболочку ВИЧ и вызывают цитотоксических Т - клеточный ответ , который похож на что опосредовано Т - клеточного рецептора 7. Недавно мы показали, что человеческие гемопоэтические стволовые клетки могут быть модифицированы с CD4ζCAR, которые затем могут дифференцироваться во множественные кроветворной Lineages, в том числе функциональные Т - клетки способны подавлять репликацию ВИЧ в гуманизированные модели мыши 8. В связи с быстрым продвижением в химерных терапии рецептора антигена рака 9, и продолжающейся характеризации мощных широких нейтрализующих антител 10-12 против ВИЧ , которые позволяют строительство CARs антител одноцепочечных, то воспринимаемое , что многие новые кандидаты конструкции, в дополнение к CD4ζCAR , будет сгенерирован и испытаны для стволовых клеток генной терапии заболеваний ВИЧ и других заболеваний на основе. Кроме того, гуманизированное мышиная модель NSG-BLT , содержащие эти антиген-специфические КДК может также служить полезным инструментом внимательно изучить Т - клеточные ответы человека в естественных условиях. Важно отметить, что наш протокол отличается от предыдущих описанных методов построения гуманизированным из BLT мышей в 13-15 , что гемопоэтические стволовые клетки в желатиновой белковой смеси используют вместо эмбриональных стволах 16 с печенью. Этот протокол описывает: 1) построение HumaniZed BLT мышей сконструированные с CD4ζCAR; и 2) характеристика дифференциации генетически модифицированных клеток; и 3) характеристика функциональности генетически модифицированных клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этический Заявление: Человек ткань плода была получена из Advanced Biosciences ресурсов или из Novogenix и был получен без идентификации информации и не требует IRB разрешения на ее использование. Исследования на животных описано в этой рукописи был выполнен в соответствии с письменного согласия Университета Калифорнии, Лос-Анджелес и научно-исследовательского комитета (UCLA) животных (ARC) в соответствии со всеми федеральными, государственными и местными нормативами. В частности, эти исследования проводились в строгом соответствии с руководящими принципами в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национального исследовательского совета и аккредитации и руководящих принципов Ассоциации по оценке и аккредитации содержания лабораторных животных (AALAC) Международный под UCLA АРК Номер протокола 2010-038-02B. Все операции проводились под кетамином / ксилазином и изофлуран анестезии и все усилия были сделаны, чтобы свести к минимуму животных боль и дискомфорт.

1. Конструирование гуманизированного мышах с CD4 химерного антигена рецептора

  1. Обработка фетальный тимуса и разделительный CD34 + ГСК из фетальной печени
    1. Тимус Processing
      1. Осторожно промыть тимус в фосфатно-буферном солевом растворе (PBS), рН 7,4, в 15 мл коническую пробирку. Повторите шаг стирки 3 - 4 раза.
      2. Добавить 7 мл RPMI СМИ + 10% FBS + ручка / стрептококк. Слейте все в стерильный 100 мм чашки Петри.
      3. Используйте скальпель , чтобы разрезать тимус на мелкие кусочки около 1 мм 2. Поместите каждый из тимуса кусок в одной скважине на 96-луночный планшет. Используйте изогнутый тупой пинцет при передаче тимуса части в 96-луночный планшет.
        1. Добавьте небольшое количество средств массовой информации (100 - 200 мкл), чтобы все лунки так, чтобы ткань не высохнет. Визуализируйте под микроскопом (thymi есть лепестки и должны выглядеть мешками клеток).
          Примечание: Отменить любые куски, которые выглядят сомнительными в любом случае;часто есть соединительная ткань, и это не должно быть имплантировано.
      4. Удалить части подтвердили-тимуса и поместить их в T25 колбу для культивирования клеток. Добавить 7 мл RPMI, дополненной 10% FBS и 450 мкг / мл пиперациллина / тазобактама и амфотерицин B. Осторожно покачайте колбу перемешать. Культура колбу в течение ночи при 37 ° С / 5% CO 2.
        Примечание: Этот шаг необходим для предотвращения бактериального загрязнения ткани.
      5. (Необязательный шаг) Замораживание тимус для использования в будущем. Равновесие ломти в 90% сыворотки АВ человека с 10% диметилсульфоксида (ДМСО) в течение 10 мин. Замораживать их со скоростью 1 ° C / мин до -50 ° С, затем быстрое охлаждение до -150 ° С. Когда все будет готово к оттепели, быстро оттаивают в водяной бане при 37 ° С и осторожно промойте 3 раза в RPMI полной среде без ДМСО.
    2. Обработка печени
      1. Осторожно промыть печень в PBS в коническую пробирку на 50 мл. Повторите шаг стирки 3 - 4 раза.
      2. Добавьте 10 мл (измененная Дульбекко Медиа Исков) IMDM СМИ в 50 мл коническую трубку. Слейте все в 100 мм стерильную чашку Петри.
      3. Однородный ткани печени с помощью двух скальпели. Вырезать печень на мелкие кусочки около 3 мм 2. Вырежьте и выбросьте любую белую соединительную ткань.
      4. Используйте шприц объемом 10 мл, снабженный 16 калибра тупой иглой взять куски печени и средств массовой информации. Затем перенесите в коническую пробирку на 50 мл.
      5. Аккуратно ресуспендируют СМИ и ткани суспензии и выслать более 5-7 раз, чтобы полностью гомогенизировать ткани.
      6. Приготовьте 10 мл IMDM, дополненной ферментами: 500 ед / мл коллагеназы, 2400 Ед / мл гиалуронидаза, и 300 ед / мл ДНКазы, а также 450 мкг / мл пиперациллина / тазобактама и амфотерицин В. Фильтр носителя через фильтр 0,22 мкм, то добавить СМИ к суспензии печени.
      7. Закрывают 50 мл коническую пробирку, содержащую суспензию печени и плотно прилегают с самоклеящимся пленки, такие как Parafilm то предотвращения утечек. Поворот в ротатор трубки в инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 90 мин.
      8. Фильтр Гидролизованный суспензии клеток через клеточный фильтр 100 мкм в свежий 50 мл пробирку.
        Примечание: Добавить PBS к суспензии, чтобы довести общий объем до 50 мл. Разделить это на две пробирки по 50 мл пробирки, каждая из которых содержала 25 мл суспензии клеток.
      9. Медленно и аккуратно легли в основу клеток в каждую пробирку с 10 мл плотности центрифугирования сред (например, Ficoll). Спин при 1200 мкг в течение 20 мин без тормоза. Примечание: все центрифугирование упомянутые в настоящем протоколе делается при комнатной температуре (25 ° C).
      10. Осторожно снимите интерфейс (то есть., Охристые пальто) из каждой пробирки и передачи на два отдельных 50 мл пробирки. Довести объем каждой трубки интерфейса до 50 мл с помощью PBS. Спин при 300 мкг в течение 7 - 10 мин. тщательно Аспирируйте супернатант.
      11. Объедините две гранулы. Промыть еще три раза с 50 мл PBS, содержащем 2% FBS. Отжима при 300 мкг в течение 7 - 10 мв каждый раз, в то время как тщательно аспирационных супернатант.
      12. Ресуспендируют осадок в 50 мл RPMI СМИ + 10% FBS. Граф клеток с использованием гемоцитометра в это время, прежде чем приступить к сортировке клеток.
      13. Сортировка клеток CD34 + CD34 сразу с помощью сортировки Kit (например., CD34 микро-гранулы), в соответствии с протоколом производителя.
        Примечание: В качестве альтернативы, клетки можно культивировать в среде RPMI СМИ + 10% FBS в 1 млн / мл в течение ночи.
      14. Сохранить как CD34 + и CD34- фракции.
        ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе, CD34 + и CD34- клетки могут быть заморожены с помощью Bambanker замораживания средств массовой информации или других замерзающих носители. Замораживание 1 мл 4 - 6 × 10 6 CD34 + клеток на пробирку и заморозить 1 мл 40 - 60 х 10 6 CD34- клеток на пробирку.
  2. Трансдукция клеток CD34 +
    1. Подсчитать количество трансдукции скважин, требуемых от 6 хорошо тканевого культурального планшета. 1 также может быть использован для трансдукции до 8 × 10 6 клеток. Длякаждая BLT мышь, 0,5 х 10 6 CD34 + будет имплантирован вместе с клетками CD34- и тимуса под капсулу почки и 0,5 × 10 6 CD34 + клеток будет вводиться внутривенно. Число клеток CD34 + для использования определяется числом мышей (1 млн клеток на мышь).
    2. Покрыть необходимое количество лунок культуры без ткани обрабатывают 6-луночный планшет с 1,25 мл раствора рекомбинантного фибронектина человека (например., Retronectin) (20 мкг / мл в PBS) в каждую лунку. Закройте планшет и дайте ему постоять в течение 2 ч при комнатной температуре в шкафу чистой биологической безопасности.
    3. Отберите раствор фибронектина из скважин и добавляют 1,25 мл FACS буфера (PBS с 4% FBS) в каждую лунку для блокирования. Разрешить планшет выдерживали при комнатной температуре (25 ° C) в течение 30 мин.
    4. Отберите FACS буфера и промывки скважин один раз PBS.
    5. Хранить PBS в покрытые лунки, пока пластина не будет готов к использованию. Храните планшет при 4 ° С в течение ночи, если он не используется сразу.
    6. Пластинчатые CD34 + клеток в среде (Infection 2% сывороточный альбумин человека в Yssel в свободной от сыворотки Т-клеточной среде) в растворе фибронектина покрытием лунок (~ 2 х 10 6 клеток / мл) и инкубируют при 37 ° С в течение 1 ч.
    7. С помощью пипетки для добавления лентивирусов вектора в лунки при множественности инфекции (MOI) между 2 - 10. Аккуратно перемешать и инкубировать в течение ночи при 37 ° С.
      Примечание: Титр лентивирусов вектора, используемого должно быть определено заранее.
    8. Урожай клеток на следующее утро, аккуратно очищая дно лунок с клеточным скребком. Собирают клетки и считаться с гемоцитометра в это время.
    9. Для подготовки клеток для имплантата, смешайте 0,5 х 10 6 трансдуцированных клеток CD34 + с 4,5 × 10 6 CD34- клеток на мышь, аликвоты в стерильные 1,5 мл завинчивающейся крышкой трубки. Спин клетки вниз на 300 мкг, чтобы осадить их, аспирация супернатант. Спин их снова при 300 мкг и аспирация любой остающийся супернатант с использованием P10 пипетки и аспирационных очень чаrefully. Хранить сухие гранулы на льду в течение всего исследования. Примечание: Для того, чтобы убедиться, что клетки жизнеспособны, используют осажденные клетки и выполнять операции в течение 2-3 часов.
    10. Для подготовки клеток для инъекций, спина 0,5 х 10 6 трансдуцированных CD34 + клеток на мышь , чтобы осадить их, аспирация супернатант. Ресуспендируют клеток в 100 мкл RPMI сред на мышь и держать на льду.
    11. Для того, чтобы проверить эффективность трансдукции, аликвоты ~ 1 х 10 5 не-трансдуцированных и трансдуцированных клеток CD34 + из каждого состояния и культуры в 200 мкл цитокиновой среды (RPMI среде с 10% FBS, с добавлением 100 нг / мл человеческого IL-3, IL-6 , SCF) в 96-луночный планшет в течение 5 - 7 дней при 37 ° с.
      Примечание: Клетки, используемые на этой стадии, не используется для операции, но, чтобы гарантировать, что трансдукция является успешным, а вектор не является токсичным для выживания и обновления стволовых клеток. Эффективность трансдукции может быть проверена путем поиска экспрессии гена вектора (например., GFP и CD4) , и анализируют с помощью проточной цитометрии.
  3. Тканевые трансплантаты Построить Генетически преобразованных мышей
    1. В тот же день до операции выполняют общее облучение тела с ослабленным иммунитетом мышей NOD.Cg- Prkdc SCID Il2rg т m1Wjl / SZJ (NSG) с цезием-137 Облучатель и дозе 2,7 Гр (270Rad).
      ПРИМЕЧАНИЕ: NSG мышей сильно ослабленным иммунитетом. Поэтому их жилье и техническое обслуживание должно соответствовать самым высоким стандартам здравоохранения и обрабатываются высококвалифицированным персоналом.
    2. Налейте тимуса кусочки и среду из колбы в 60 мм чашку. Налейте PBS в другой 60 мм блюдо, которое будет использоваться для очистки троакар и сохранить почки мокрые.
    3. Охладить положительные советы смещения пипеток, помещая их в открытые 1,5 мл стерильного завинчивающейся крышкой пробирки на льду. Держите на льду с высушенными клеточными гранул и желатиновой смеси белков, таких как Матригель.
      Примечание: Важно, чтобы сохранить желеобразную смесь белка и любые трубы или советы, которыебудет прикоснуться к ней холодно во все времена, пока не будет загружена игла имплантата.
    4. Обезболить мышей: Взвесьте мышей по отдельности и записывать веса; уха пробивать мышей сосчитать их. Вводят их внутрибрюшинно с 15 мкл кетамина (2,6 мг / мл в физиологическом растворе) / ксилазином (100 мг / мл в физиологическом растворе) на грамм массы тела). Положите мышей обратно в клетку и ждать его, чтобы быть полностью под наркозом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте уровень анестезии мыши, сжав лапу. Если мышь рефлекторно вздрагивает, управлять 25-50% от первоначальной суммы кетамина / ксилазина для дальнейшего анестезию мыши. Подождите, пока он не рефлекторно дрогнул выполнить операцию.
    5. С помощью машинки для стрижки Oster (электробритвы), брить левую сторону каждой мыши от бедра к плечу между центром спины и живота. Подкожно вводят 0,3 мл разведенной Carprofen (6 мг / кг) в плечо животного или паховой треугольника (нога ямы). Используя ватный тампон, положить небольшую каплю искусственной слезына каждый глаз и положите мышь на его стороне обратно в клетку.
      Примечание: Предел операции Prep к одной клетке (приблизительно 4 - 5 мышей) одновременно.
    6. Промойте канюлю имплантата рака иглой 16 калибра (троакара) с PBS. Используя пару тупых изогнутых щипцов, место кусок тимуса от 60 мм блюдо в отверстие канюли с троакаром только внутри отверстия, а затем потянуть назад на троакар аспирацию ткани в канюлю.
    7. Используйте положительное пипетку смещение и охлажденный наконечник поставить 5 мкл холодной желатиновой белковой смеси в пробирку с высушенного осадка клеток (CD34 + и CD34- смеси для имплантированных клеток) и осторожно перемешать, чтобы генерировать клеточной суспензии. Не пипеткой вверх и вниз. Пипетировать студенистой белковой суспензии смесь / клеток в отверстие полой иглы и медленно потяните на троакар, чтобы загрузить иглу.
      Примечание: Рекомендуется иметь помощника, чтобы загрузить пипетку в то время как один манипулирует иглу имплантата.
    8. Тампон выбритый участок мыши с повидон-йодом, а затем вытрите область со спиртом салфетку три раза. Определите самые темные пятна под кожей. Это указывает местоположение селезенки. Почек составляет приблизительно 5 мм спинные селезенки. Поднимите кожу с изогнутыми щипцами и сделать 15 мм разрез с хирургическими ножницами в коже параллельно селезенки. Затем сделайте аналогичный разрез в брюшине слое ниже. У мужчин, почки должны быть хорошо видны, и можно выдавливать просто нажав на животе. Вы можете поддержать почку с кровоостанавливающего или парой изогнутых тупыми щипцами. У самок, яичники, как правило, блокируют почки от легкой добычи. Использование кровоостанавливающего, поднимите яичник и осторожно выставить из почки.
    9. Используйте игольчатым наконечником пинцет, чтобы срывать крошечное отверстие на заднем конце капсулы почки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте эти иглы наконечником щипцов для обработки биологически опасных материалов.
    10. Вставьте имплантатигла в это отверстие и вдоль почки, пока отверстие канюли не полностью покрыта почечную капсулу.
    11. Осторожно выдавите ткани под почечную капсулу, и вытащить иглу обратно. Части тимуса может быть липким, так что используйте изогнутым пинцетом, чтобы убедиться, что тимус часть не выходит с иглой.
    12. Поднимите брюшины с пинцетом и аккуратно использовать кровоостанавливающего, чтобы подтолкнуть почку на место. Привяжите один двойной завязанный стежок в брюшине, используя 4-0 викрил рассасывающиеся шовные материалы. Используйте два Autoclips раны клипы, чтобы закрыть кожу.
    13. Смешайте трансдуцированных CD34 + клетки , которые были установлены в сторону для инъекций и поглощение 100 мкл (0.5x10 6 клеток) в шприц инсулина. Внедрить эти клетки в мышь через заглазничными инъекции вены или других способов внутривенного введения. Используя ватный тампон, положить небольшую каплю искусственных слез на каждый глаз и положить мышь на его стороне обратно в клетку.
    14. После того, как все мыши были бееп имплантированы, подтверждают, что животные приходя в сознание и ambulating обычно, прежде чем покинуть их.
    15. Послеоперационный уход: На следующий день после операции, подкожно вводят 0,3 мл разведенной Carprofen (6 мг / кг) и 1,2 мл стерильного физиологического раствора в каждую мышь. 2 и 3 дня после операции, подкожно вводят 1,5 мл стерильного физиологического раствора в каждую мышь. Монитор мышей и надрезы в течение 10-14 дней после операции. Удалите Autoclips и взвешивают мышей через 10-14 дней. ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши вялым после лучевой терапии и инъекции физиологического раствора предотвращает животных от обезвоживания организма.
    16. Через 8 - 10 недель, проверьте приживление кровотечением мышей и проведение анализа FACS на периферической крови, окрашивая для маркеров, таких как CD45, CD3, CD4, CD8, а также любые гены, вектор должен выразить.

2. Характеристика дифференцировки и развития генно модифицированных клеток

  1. ХарактеристикаГенные модифицированные клетки из периферической крови
    1. 8 - 10 недель после трансплантации, получают 50 - 100 мкл крови мышей из ретро-орбитальное обрез. Место в микроцентрифужных пробирки, содержащие 10 мкл ЭДТА. Центрифуга клетки при 350 мкг в течение 3 мин. Собирают плазму. Замораживание при -80 для анализа ELISA или плазмы анализа вирусной нагрузки, если мышь инфицирован ВИЧ.
    2. Добавить раствор 2 мл раствором NH4Cl (83%) , чтобы лизировать красные кровяные клетки. Инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре (25 ° C). После инкубации добавляют 10 мл RPMI 10% FBS, чтобы заполнить трубу. Спин при 300 мкг в течение 5 мин. тщательно Аспирируйте супернатант. Клетки готовы к иммунологического окрашивания и проточной цитометрии анализа и других анализов.
      Примечание: Маркеры для различных гематопоэтических клеточных клонов, активации и фенотипических маркеров для наивных или памяти клеток могут быть измерены через каждые 2 недели до и после того, как ВИЧ-инфекции с помощью проточной цитометрии. Вентили создаются путем окрашивания клеток с контролем изотипа. Рекомендуется для окрашивания Healtхй человека МНПК и использовать его в качестве положительного контроля. В качестве альтернативы, мышь может быть умерщвлены и до 1 мл периферической крови могут быть получены из пункции сердца , который обеспечит достаточное количество клеток для нескольких панелей анализа потока 17.
  2. Характеристика гена модифицированных клеток из селезенки, вилочковой железы и костного мозга
    1. Урожай селезенка, тимус и костный мозг от мышей Гуманизированные BLT
      1. Эвтаназии мышей с помощью передозировки изофлуран. Подтвердите эвтаназию с вторичным смещением шейных позвонков. Spray поверхность каркаса с 70% -ным этанолом, чтобы держать мех от прилипания к тканям. Придавить конечности на восковую рассечение лоток.
      2. Используйте хирургические ножницы, разрезать кожу, а затем разрезают через брюшную слой, чтобы обнажить полость тела.
      3. Удалить селезенку с помощью щипцов. Удалите тимуса имплантат на почки с помощью щипцов и ножниц. Поместите тимуса имплантат и селезенку в промаркированные пробирки Контаоцен- ками в 5 мл PBS.
      4. С середины живота вырезать и удалить кожу от дистальной части мыши, покрывающей нижние конечности.
      5. Отрезать мышцы от нижних конечностей с помощью ножниц и тщательно вывихнуть от вертлужной впадины тазобедренного сустава. Удалить бедренной и большеберцовой костей и поместить их в пробирку, содержащую 5 мл PBS.
    2. Выделение спленоцитов
      1. Поместите сетчатый фильтр 100 мкм клеток на коническую трубку емкостью 50 мл. Влажный фильтр с 3 мл RPMI среде с добавлением 10% FBS и пен / стреп (RPMI полной среды).
      2. Поместите селезенку на клеточный фильтр. С помощью резиновой поршень 10 мл шприц, разомните селезенку, чтобы расщепить ее через сито в 50 мл пробирку.
      3. Промыть фильтр грубой очистки клеток с 5 мл RPMI полной среды от 4 до 5 раз.
      4. Спин клетки при 300 мкг в течение 10 мин.
      5. Отберите супернатант и ресуспендируют осадок в 5 мл красных кровяных клеток лизис буфера. Выдержите при комнатной темпераTURE в течение 10 мин. Добавьте 20 мл RPMI полной среды и спина при 300 мкг в течение 7 мин.
      6. Отберите супернатант и ресуспендируют осадок в 10 мл RPMI полной среды и фильтр снова через 100 мкм клеточный фильтр с. Граф клеток с использованием гемоцитометра.
        Примечание: Клетки могут быть использованы для естественных условиях анализов ех, анализ потока и может быть жизнеспособно заморожены для дальнейшего использования. Перед подсчетом клеток, трипанового синего может быть использован для определения количества жизнеспособных клеток.
    3. Выделение человека из тимоцитов Implant
      1. Поместите тимус в 5 мл PBS в лунку 6-луночного планшета с. Использование чистых тупыми щипцами и ножницами вырезать тимус на мелкие кусочки.
      2. Поместите стерилизованного сетка из нержавеющей стали квадрат в скважину. С помощью резиновой поршень 10 мл шприца, разотрите тимуса штук на сетке из нержавеющей стали распадаться тимус.
      3. Ресуспендируют клетки хорошо и процедить через 100 мкм клеточный фильтр с. Спин клетки при 300 мкг в течение 10 мин.Приостановка клеток в 10 мл RPMI полной среды. Если комки видны, проходят ресуспензированной-клетки через клеточный фильтр снова.
      4. Граф клеток с использованием гемоцитометра.
        Примечание: клетки могут быть использованы для анализа потока и жизнеспособно замораживают для последующего использования.
    4. Выделение клеток из костного мозга
      1. Чистый и стерилизовать ступку и пестик с 70% -ным этанолом. Поместите бедренной и большеберцовой костей в ступке. Добавьте 5 мл холодного PBS. Используйте пестик, чтобы сокрушить кости, пока PBS не станет светло-розовый и облачно.
      2. Пипетировать вверх жидкость из раствора и фильтруют через сетчатый фильтр 50 клеток мкМ помещают на 50 мл коническую трубку. Вымойте раствор с 5 мл PBS и повторить пять раз, пока PBS не станет ясно.
      3. Спин клетки вниз на 300 мкг в течение 7 мин. Отберите супернатант и ресуспендируют в 10 мл RPMI полной среды.
      4. Граф клеток с использованием гемоцитометра.
        Примечание: клетки могут быть использованы для анализов бывших естественных условиях, и анализ потока может быть жизнеспособно замороженный Fили последующего использования.

3. Функциональная характеристика генных модифицированных клеток

  1. Инфекция и мониторинг вирусной репликации ВИЧ в течение долгого времени
    1. После подтверждения системы восстановления иммунной человека, вводить желаемое количество вируса ВИЧ с помощью инъекции вену ретроорбитальной использованием инсулиновый шприц. После того, как ВИЧ-инфекции, собирают 100 мкл периферической крови через ретро-орбитальное кровотечение каждые 2 недели.
    2. Урожай плазмы, выполнив действия, описанные в части 2.1.1 - 2.1.2. Для анализа вирусной нагрузки ВИЧ, экстракт вирусной РНК с использованием набора для экстракции РНК в соответствии с инструкцией изготовителя и измерять вирусную нагрузку в реальном масштабе времени RT-PCR с соответствующими праймеров и зондов наборов для вируса ВИЧ используется 4,8,18,19.
    3. Для измерения клеток связаны РНК ВИЧ и идентифицировать клетки, которые активно заражены ВИЧ, сначала выполнить RBC лизис следующие шаги 2.1.2
    4. Ресуспендируют суспензии клеток в 1; Мл PBS, делят равномерно на две трубки. Спин при 300 мкг в течение 5 мин. Отберите супернатант.
    5. Для измерения соты, ассоциированной РНК, экстракт РНК с использованием набора для экстракции РНК в соответствии с инструкцией изготовителя и выполнять в режиме реального времени RT-PCR с использованием соответствующих праймеров и зондов наборов.
      Примечание: Важно, чтобы грунтовка / зонд не распознает лентивирусов, используемый для модифицированных стволовых клеток
    6. Для измерения ВИЧ-инфицированных клеток с помощью проточной, ресуспендирования клеток в другой трубке в 50 мкл FACS буфера и выполнить поверхностную окраску с желаемого антитела, такие как анти-CD45, анти-CD4 и анти-CD3. После того, как поверхность пятна, исправить и проницаемыми клетки и пятно внутриклеточно для экспрессии затычки с использованием анти-Gag антитела (клон KC57). Выполните проточной цитометрии.
  2. Ex Vivo цитокин Анализ Гена модифицированных клеток из спленоцитах
    1. Урожай спленоциты от мышей, как описано в разделе 2.2.2.
    2. Подготовка клеток-мишеней. Для тестирования функционаланость CD4 химерный рецептор антигена модифицированных Т-клеток, используют клетки, инфицированные ВИЧ-T1 в качестве клеток-мишеней. Инфицировать клетки T1 с ВИЧ 3 дней до анализа цитокина, подтверждают ВИЧ-инфекции путем окрашивания клеток внутриклеточно с анти-ВИЧ рвотным-антителом (клон KC57). Используйте неинфицированных клеток T1 в качестве целевых контрольных клеток.
    3. Co-инкубировать спленоцитов с целевыми или контрольными клетками в соотношении 1: 1 в течение ночи. Для достижения наилучшего результата, проводить титрование (1: 1, 1: 3, 1: 9) эффекторных (спленоциты) против клеток-мишеней (инфицированные T1s). Например, ресуспендируют 0,9 млн спленоцитов в 0,25 мл RPMI полной среды, добавить 0,9, 0,3 или 0,1 миллиона инфицированных T1 или неинфицированных T1s ресуспендировали в 0,25 мл RPMI полной среды.
    4. На следующее утро, добавить ингибитор белка транспорта в течение 6 часов , чтобы ингибировать транспорт белков и выполнять окрашивание внеклеточных маркеров и внутриклеточной экспрессии цитокинов , как описано выше в 8.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На рисунке 1 показан контур построения гуманизированные мышей BLT с модифицированной стволовой клетки. 10 недель после имплантации, мышей умерщвляли для оценки дифференцировки и развития генных модифицированных клеток. Как показано на рисунке 2, множественные лимфоидные ткани (кровь, селезенка, тимус и костный мозг) собирали из мышей , который был изменен с CD4ζCAR. CD4ζCAR используется в данном протоколе содержит CD4 химерный рецептор антигена и GFP , к...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С CAR и HSC на основе инженерии иммунитета набирает обороты в направлении клинических исследований, важно иметь подходящую модель животного, чтобы внимательно изучить дифференцировку и функции этих сконструированных клетках. В этом протоколе мы описали методы построения и тестирования гуманизированные мышей с генетически модифицированных стволовых клеток инженерии против ВИЧ. Важно, чтобы иметь эффективную трансдукции стволовых клеток перед трансплантацией. Тем не менее, из - за способности Т - клеток к пролиферации пос...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить мисс Джессику Селандер за предоставление художественного помощника в создании наших фигурок. Эта работа финансировалась за счет грантов NIAID/NIH, грант No. RO1AI078806, Центр исследований ВИЧ/СПИДа Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе (CFAR), грант No. P30AI28697, Калифорнийский институт регенеративной медицины, грант No. TR4-06845, Американская федерация исследований в области СПИДа (amfAR), грант No. #108929-54-RGRL, а также Многокампусная исследовательская программа и инициативы Калифорнийского университета, Калифорнийский центр по открытию противовирусных препаратов (CCADD)

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
CD34 набор микрогранулMiltenyi130-046-702Для сортировки клеток-предшественников CD34+ человека
BambankerWako302-14681Для замораживания клеток
QIAamp Viral RNA kit Qiagen52904Для измерения вирусной нагрузки в сыворотке крови
MACSQuant Проточный цитометрMiltenyiДля анализа потока
BD LSRFortessa™BD biosciencesДля анализа потока
ГиалуронидазаSigmaH6254-500MG Для переваривания тканей
Дезоксирибонуклеаза I           УортингтонLS002006 для переваривания тканей
КоллагеназаЛайф технология17104-019 для переваривания тканей
CFX Система обнаружения ПЦР в реальном времениBioradДля измерения вирусной нагрузки и экспрессии генов
мышей, штамма NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJЛаборатория Джексона5557Для конструирования гуманизированных мышей
Пенициллин стрептомицин (Pen Strep)Thermo Fisher Scientific10378016Для культивирования клеток
Пиперациллин/тазобактамPfizerZosynПротивогрибковый
амфотерицин B (Фунгизоновый антимикотический)Thermo Fisher Scientific15290-018Противогрибковый
Зажимы для ран Autoclip, 9 мм - 1 000 единицBecton Dickinson427631 Для хирургии
Стерильные полиармированные хирургические халаты Aurora, 30 в кейсе           МедлайнDYNJP2707 Для хирургии
Швы, 4-0, vicryl                   Оуэнс и Майнор23000J304H   Для хирургии
Салфетки для приготовления алкоголя                   Оуэнс и малые3583006818для хирургии
Перчатки хирургические, 6 1/2Оуэнса и малые4075711102для хирургии
Иссел s Бессывороточная Т-клеточная средаGemini Bio-products400-102Для трансдукции CD34+ клеток
Сыворотка крови человека Альбумин  Sigma-AldrichA9511Для клеточной трансдукции CD34+

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Karpel, M. E., Boutwell, C. L., Allen, T. M. BLT humanized mice as a small animal model of HIV infection. Current opinion in virology. 13, 75-80 (2015).
  2. Zhen, A., Kitchen, S. Stem-cell-based gene therapy for HIV infection. Viruses. 6 (1), 1-12 (2014).
  3. Goulder, P. J. R., Watkins, D. I. HIV and SIV CTL escape: implications for vaccine design. Nature Reviews: Immunology. 4 (8), 630-640 (2004).
  4. Kitchen, S. G., Bennett, M., et al. Engineering Antigen-Specific T Cells from Genetically Modified Human Hematopoietic Stem Cells in Immunodeficient Mice. PloS one. 4 (12), e8208(2009).
  5. Goulder, P. J. R., Watkins, D. I. HIV and SIV CTL escape: implications for vaccine design. Nature Reviews: Immunology. 4 (8), 630-640 (2004).
  6. Kitchen, S. G. S., Levin, B. R. B., et al. In vivo suppression of HIV by antigen specific T cells derived from engineered hematopoietic stem cells. PLoS Pathogens. 8 (4), e1002649(2012).
  7. Yang, O. O., Tran, A. C., Kalams, S. A., Johnson, R. P., Roberts, M. R., Walker, B. D. Lysis of HIV-1-infected cells and inhibition of viral replication by universal receptor T cells. PNAS. 94 (21), 11478-11483 (1997).
  8. Zhen, A., Kamata, M., et al. HIV-specific Immunity Derived From Chimeric Antigen Receptor-engineered Stem Cells. Molecular Therapy. 23 (8), 1358-1367 (2015).
  9. Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer. Annual Review of Medicine. 65 (1), 333-347 (2014).
  10. Pejchal, R., Doores, K. J., et al. A Potent and Broad Neutralizing Antibody Recognizes and Penetrates the HIV Glycan Shield. Science. 334 (6059), 1097-1103 (2011).
  11. Caskey, M., Klein, F., et al. Viraemia suppressed in HIV-1-infected humans by broadly neutralizing antibody 3BNC117. Nature. 522 (7557), 487-491 (2015).
  12. West, A. P., Scharf, L., Scheid, J. F., Klein, F., Bjorkman, P. J., Nussenzweig, M. C. Structural insights on the role of antibodies in HIV-1 vaccine and therapy. Cell. 156 (4), 633-648 (2014).
  13. Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. -G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
  14. Melkus, M. W., Estes, J. D., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nature medicine. 12 (11), 1316-1322 (2006).
  15. Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nature Reviews: Immunology. 12 (11), 786-798 (2012).
  16. Vatakis, D. N., Bristol, G. C., et al. Using the BLT humanized mouse as a stem cell based gene therapy tumor model. Journal of visualized experiments : JoVE. (70), e4181(2012).
  17. De Rosa, S. C., Brenchley, J. M., Roederer, M. Beyond six colors: a new era in flow cytometry. Nature medicine. 9 (1), 112-117 (2003).
  18. Shimizu, S., Hong, P., et al. A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model. Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).
  19. Denton, P. W., Olesen, R., et al. Generation of HIV latency in humanized BLT mice. Journal of virology. 86 (1), 630-634 (2012).
  20. Zhou, J., Zhang, Y., et al. Embryoid bodies formation and differentiation from mouse embryonic stem cells in collagen/Matrigel scaffolds. Journal of Genetics and Genomics. 37 (7), 451-460 (2010).
  21. Vatakis, D. N., Arumugam, B., Kim, S. G., Bristol, G., Yang, O., Zack, J. A. Introduction of Exogenous T-cell Receptors Into Human Hematopoietic Progenitors Results in Exclusion of Endogenous T-cell Receptor Expression. Molecular Therapy. 21 (5), 1055-1063 (2013).
  22. Ito, R., Takahashi, T., Katano, I., Ito, M. Current advances in humanized mouse models. Cellular & Molecular Immunology. 9 (3), 208-214 (2012).
  23. Martinez-Torres, F., Nochi, T., Wahl, A., Garcia, J. V., Denton, P. W. Hypogammaglobulinemia in BLT humanized mice--an animal model of primary antibody deficiency. PloS one. 9 (10), e108663(2014).
  24. McCune, J. M. Development and applications of the SCID-hu mouse model. Seminars in Immunology. 8 (4), 187-196 (1996).
  25. Srivastava, S., Riddell, S. R. Engineering CAR-T Cells: Design Concepts. Trends in immunology. 36 (8), (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CD4BLTNSG BLT

Похожие статьи