Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Аденовируса генной терапии для больных сахарным диабетом Кератопатия: Влияние на заживление ран и стволовых клеток маркера выражение в человеческих органов культивируемых роговиц и лимбальных эпителиальных клеток

8.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54058

⸱

7 апреля 2016 г.

 ,  , 
1Eye Program, Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Departments of Biomedical Sciences and Neurosurgery, Cedars-Sinai Medical Center, 2David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

В этой статье

Краткое содержание

Представлен пример аденовирусной генной терапии на роговице человека, культивируемых диабетическими органами, направленный на нормализацию замедленного заживления ран и заметное снижение экспрессии маркеров эпителиальных стволовых клеток в этих роговицах. В ней также описывается оптимизация этого процесса в культурах лимбального эпителия, обогащенных стволовыми клетками.

Аннотация

Цель этого протокола заключается в описании молекулярных изменений в диабетических роговиц человека и показать, как они могут быть облегчены с помощью аденовирусной генной терапии в органе культивируют роговиц. Диабетическая заболевания роговицы является осложнение диабета с частыми аномалиями нервов роговицы и эпителиальной заживления раны. Мы также зарегистрировали значительно измененную экспрессию нескольких предполагаемых маркеров эпителиальных стволовых клеток при диабете роговиц человека. Чтобы облегчить эти изменения, аденовирусной генной терапии была успешно осуществлена ​​с использованием повышающую регуляцию с-встретил протоонкогена экспрессии и / или понижающей регуляции протеиназы матрицы металлопротеиназы-10 (ММР-10) и катепсина F. Эта терапия ускоренного заживления ран у больных сахарным диабетом роговиц даже тогда, когда только лимбальных стволовых клеток отсек трансдуцированная. Наилучшие результаты были получены при комбинированном лечении. Для возможной трансплантации пациентов нормированных стволовых клеток, пример также представлен в ОПТИМИЗАЦИЯна трансдукции гена в клеточных культурах, обогащенной стволовыми использованием поликатионные усилителями. Такой подход может быть полезен не только для выбранных генов, но и для других медиаторов эпителия роговицы заживления ран и стволовых клеток функцию.

Введение

Диабетическая заболевания роговицы в основном приводит к дегенеративным эпителиальные (кератопатии) и нервов (невропатия) изменений. Она часто проявляется аномалии эпителиального заживления ран и уменьшения рогового нерва 1-4. По оценкам , 60-70% больных диабетом имеют различные проблемы роговицы 1,3. Проведенные нами исследования выявили несколько белков - маркеров с измененной экспрессии в диабетических роговиц человека , включая понижающей с-мет прото-онкогенов (рецептор фактора роста гепатоцитов) и повышающей регуляцией матриксных металлопротеиназ-10 (ММР-10) и катепсина F 5, 6. Мы также зафиксировали значительное снижение экспрессии нескольких предполагаемых маркеров эпителиальных стволовых клеток в диабетической роговиц человека.

В предыдущих исследованиях мы разработали на основе аденовирусов генной терапии для нормализации уровней маркеров диабета изменены с помощью диабетической роговице системы органной культуры человека, которая показывает медленное заживление ран, диабетическуюИзменения маркера, и стволовых снижение экспрессии клеточного маркера , похожий на роговицу бывших естественных условиях 7,8. Это сохранение изменений , как представляется, из - за существования эпигенетической памяти метаболического 9. Эта система культуры использовали далее для генной терапии. Цели для этой терапии были выбраны из маркеров либо с пониженной экспрессией в диабетических роговиц (с-мет протоонкогена), или повышенная экспрессия (MMP-10 и катепсин F).

Аденовирусная (AV) терапия была использована в целом органных культивируют роговиц или корнеосклеральный периферической лимбальных только купе. Это отделение таит эпителиальные стволовые клетки , которые возобновить эпителий роговицы и активно участвовать в ранозаживляющих 4,10-15. Здесь протоколы предназначены для нормальной и диабетического человека роговичного органной культуры, эпителиальные заживление ран, выделение и характеристики клеток, обогащенных культур стволовых клеток лимбальных и аденовирусной трансдукции клетки и роговичного. нашРезультаты показывают целесообразность этой терапии для нормализации экспрессии маркеров и заживление ран у больных сахарным диабетом роговиц для возможной трансплантации в будущем. Они также предполагают , что комбинированная терапия является наиболее эффективным способом восстановить нормальную структуру маркера и эпителиальной исцеление в диабетической роговицы 16-18.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Национальный исследовательский болезнь Interchange (NDRI, Филадельфия, штат Пенсильвания), подаваемая соглашался посмертных здоровых и диабетических человеческих глаз и роговицу. Протокол Ndri в человеческой коллекции тканей утверждается управленческую комитетом и при условии соблюдения Национальных институтов здравоохранения надзора. Это исследование было проведено в соответствии с утвержденным Советом по Cedars-Sinai Medical Center Institutional (IRB) освобождены протокола EX-1055. Сотрудничая хирурги роговицы, DRS. E. Maguen и Y. Рабинович, поставляемый выбросьте корнеосклеральный ободов для выделения стволовых клеток, обогащенных роговицы эпителиальных культур. Это исследование было проведено в соответствии с утвержденным протоколом IRB Pro00019393.

1. Человеческий Роговичная Орган культуры

Примечание: Нормальные и диабетические роговица или целые глаза получены в охлажденном среде хранения роговицы (например, Optisol GS) в течение 48 часов после смерти от национального поставщика Ndri.

  1. Удалите роговиц из контейнера для хранения с пинцетом и мыть их дважды яп антибиотик-противогрибковое (ABAM) смесь. В случае целых глаз, вырезать роговицу из глобусов с изогнутыми ножницами. Оставьте по крайней мере, на 5 мм конъюнктивы обода, а также мыть роговиц в ABAM.
  2. Приготовьте смесь, которая будет помещена в роговице вогнутости. Он состоит из не содержащей сыворотки минимальной необходимой среде (MEM), содержащей ABAM, 1 мг / мл телячьей кожи коллагена (из исходного раствора 10 мг / мл в 0,1 N уксусной кислоте), 1% агар, и инсулин-трансферрин-селенит дополнение 7.
  3. Микроволновая эту смесь до кипения для стерилизации и агар растворения. Это может занять до 1 мин для все для растворения. Оставьте крышку трубки частично открытым, так как смесь переливается легко, когда она закипит. По этой причине некоторые кипящие циклы могут быть необходимы, каждый в течение 10-15 сек. Охладить смесь до 37-39 ° С.
  4. Поместите роговиц эпителиальной стороной вниз в стерильные 60 мм блюд. Заполните роговичный вогнутость с приблизительно 0,5 мл смеси, описанной в разделе 1.2.смесь затвердевает на роговицу в течение 2 мин.
  5. Поместите роговиц агар стороной вниз в стерильные 60-мм чашки и добавьте полную среду , содержащую MEM с ABAM, и инсулин-трансферрин-селенит добавка 7 (37 ° С) , чтобы держать его уровень приблизительно у лимба для воздушно-жидкостной интерфейс культуры. Объем среды составляет 7-8 мл на чашку.
  6. Поместите посуду с роговицей в атмосфере 5% СО 2 инкубаторе с увлажнением с водой сковороду (таким образом, уровень влажности поддерживается на уровне или выше 95%) при 35 ° C (нормальная температура) роговичный. Добавьте 100 мкл среды (две капли) ежедневно на эпителии, чтобы увлажнить роговицу.
  7. Монитор роговицы морфологии и эпителиального жизнеспособность клеток микроскопически при проходящем свете с использованием стандартного микроскопа с объективом 4X. Сделайте это один раз в день.
  8. Изменение среды каждые три дня. Роговицы можно культивировать в течение не менее трех недель. Для проведения экспериментов по генной терапии, культуры роговицы в течение 3-5 дней, а затем transducе с генами, представляющим интерес (4,1-4,4), оставьте еще 3-5 дней в зависимости от трансгенов и при условии соблюдения ранозаживляющих протокола (2.1-2.4).

2. Эпителиальные заживление ран

Примечание: В диабетических роговиц, то эпителии механическим соскребанием не представляется возможным, потому что хрупкий эпителиальной базальной мембраны отсоединяется в процессе, который не происходит в нормальных роговиц. Таким образом, чтобы сохранить нормальные и диабетические роговиц при аналогичных условиях раневого процесса, химического удаления эпителия с н-гептаноле используется 19. Эта процедура удаляет эпителий, но оставляет позади интактной базальной мембраны в обоих нормальных и диабетических роговицей.

  1. Чтобы выполнить центральную эпителии 20, место 5 мм диска фильтровальной бумаги , смоченную в н-гептаноле на центральной передней поверхности роговицы в течение 75 сек.
  2. Снимите фильтр и промойте роговицу в полной среде. Заполните вогнутость с 0,5 мл агар-коллагенсмесь и культура, как и в 1.4. После того, как санацией, эпителиальные клетки , как правило , умирают и шелушиться оставляя позади микроскопически нетронутыми базальную мембрану 7.
  3. Используйте 8,5 мм диски для создания больших эпителиальные ран в опытах с только лимбальных генной терапии. Это позволит обеспечить участие лимбальных стволовых клеток в процессе заживления.
  4. Монитор заживления роговицы микроскопически. Сделайте фотографии на 4X и 10X каждый день, пока эпителиальный дефект не полностью зажила. Процесс заживления может занять от 2-х до 15 дней в зависимости от состояния (нормальное или диабетический) и раневой размера.
    Примечание: Во время процесса заживления, черные паукообразные клетки наблюдаются в верхней фокальной плоскости. Эти клетки являются апоптотических стромальные кератиноциты , которые умерли после того, как эпителиального удаления 4. Заживление определяется , чтобы быть полным , когда эти мертвые клетки не зарастает целительной эпителия и больше не видны (рис 2, вставка).
  5. После заживлениязавершение, разрезать роговицу пополам, встраивать их в ОКТ соединения и способа непрямой иммунофлуоресценции на участках криостата или для вестерн - блоттинга 16,21.

3. Выделение лимбальных клеток и поддержания стволовых клеток, обогащенных культур

Примечание: Подготовить первичный лимбальную эпителиальной стволовых клеток (LESC) -энантиомером культур от корнеосклеральный ободами. Ободы , поступающие от здоровых доноров и выбрасываться после трансплантаций роговицы получены от сотрудничающими хирургов в стандартном носителе данных роговичный (например, Optisol). В противном случае, LESC обогащенным культуры могут быть получены из ободов, вырезанных из нормальных и диабетических целые роговицей или глобусы, полученные от NDRI в роговичной носителе информации.

  1. Если весь роговица или глобусы используются, в первую очередь изолировать лимбальных области. Чтобы сделать это, поместите роговицу на стерильной пластиковой чашке с эпителиальной стороной вверх и снимите центральную зону с 9-мм трепана (круговой роговице нож).Сбросьте эту центральную часть. Затем иссечь лимбальную зону с использованием 13 мм трепана и отбросить внешнюю часть конъюнктивы. Для того, чтобы изолировать клетки используют рогалик типа лимбальную обод. Перед тем как выделения клеток, удалить эндотелиальные клетки и прилипшие остатки радужной оболочки с внутренней стороны роговицы, противоположной поверхности эпителия с стерильным ватным тампоном.
  2. Изолировать лимбальных клеточных листов с использованием диспазу лечения. Инкубируют каждый корнеосклеральный обод с 2,4 ед / мл диспаза II в 1,5 мл кератиноцитов бессывороточной среде (KSFM) , дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) , при температуре 37 ° С в течение 2 ч 22.
  3. Аккуратно ослабить лимбальную эпителиального лист клеток с обода под рассекает стереомикроскопа с пинцетом и диссоциируют клеток в 1 мл 0,25% трипсина - 0,02% раствором ЭДТА в течение 30 мин при комнатной температуре.
  4. Вымойте клеток в 10 мл среды (например, Epilife) и осадить их при 300 мкг в настольной центрифуге в течение 5 мин при комнатной температуре.
  5. Ресуспендируют-йе клетки в культуральной среде: среда с N2, B27 и добавки роста кератиноцитов человека, и 10 нг / мл фактора роста эпидермиса (EGF).
  6. Семенной клеток при 3000-5000 клеток / мл в колбы или 60 мм чашки , покрытые смесью человеческого подвальных мембранных белков , включая фибронектин, типа IV коллагена и ламинина (FCL), в 0,5-1 мкг / см 2, в KSFM средний.
  7. Культуры клеток в увлажненной (95% или более высокой влажности) CO 2 инкубаторе при температуре 37 ° С , пока они не образуют полностью вырожденные монослоев. Это может занять 1-2 недели.
    Примечание: Регулярно подтвердить идентичность клеток путем положительного иммуногистохимического окрашивания для предполагаемых маркеров LESC включая PAX6, кератин (К) 14, K15, K17 и ΔNp63α. Подробности окрашивания , включая первичные антитела были опубликованы 8,16-18,22.
  8. Для прохода конфлюентных клеток, относятся к ним с 1 мл 0,05% -ного раствора трипсина (1: 5 разбавление 0,25% раствора) в течение 10 мин при 37 ° С. Добавить 5 мл соевого трраствора ингибитора ypsin (10 мг / мл) разводят в соотношении 1: 4 в среде, и Центрифуга клетки, как в 3.5.
  9. Промыть осадок клеток в 3 мл раствора разводили соевого ингибитора трипсина. Пластина клеток на FCL покрытием (см 3.7) блюда или стеклянную камеру слайды на 2 - х 10 4 клеток / мл.

4. аденовируса Трансдукция органоспецифической культивируют роговиц

Примечание: рекомбинантные аденовирусы (AV) включают в себя AV-вектор (не ген не вставлен), AV-CMET (с С-мет гена открытой рамки считывания), AV-shM10 (с shRNA к ММР-10) и AV-shCF ( с shRNA к катепсин F). Они являются Е1 / Е3-удален тип 5 AV-экспрессирующих гены под контролем основного немедленного раннего промотора цитомегаловируса. АВ-CMET вирусы создаются с помощью AV вектор PAD / CMV / V5-DEST 16. Вирусы AV-shRNA на заказ порождается субклонирования shRNA последовательностей наряду с hh1 промотора и последовательности тегов GFP из iLenti-EGFP вектор в репликации некомпетентным (-E1 / -E3) Humaп AV 5 типа генома с использованием Адено-4 системы экспрессии 17.

  1. Преобразовывают один орган культивировали роговицу каждой пары с AV-вектором и другой роговицы, с экспрессии генов-модулирующей AV. С помощью AV-CMET на 0,8 до 1,25 х 10 8 бляшкообразующих единиц (БОЕ) на роговице в культуральной среде в течение 48 ч при 37 ° С в поддержании роговицу под средней поверхности каждого в лунку блюдо 24-луночного. Используйте вирусы AV-shRNA на 1-2 х 10 8 КОЕ на роговице.
  2. Используйте вирусы для трансдукции в полной среде с добавлением 75 мкг / мл цитрата силденафила. Этот реагент активирует Кавеолин транспорт , облегчающую вирусный поглощение эпителиальными клетками 21. Из-за короткого периода полураспада силденафила в водных растворах, повторно добавить такое же количество в среднем 4-5 ч позже. Стандартное лечение в течение 48 часов.
  3. Передача роговиц к новым блюдам с закругленным концом стерильного шпателя и культуры в среде без AV, поддерживая средний уровень у лимба. После дополненияitional 4-8 дней на границе раздела жидкость-воздух, процесс АВ обработанных роговиц для различных анализов или испытания для эпителиального заживления ран (смотри выше). Смочить Регулярно роговицу во время культуры путем добавления 100 мкл среды (две капли) на верхней части роговицы.
  4. Для трансдукции только лимбальных клетки, инкубировать вирусы с роговиц на границе раздела воздух-жидкость со средним уровнем у лимба, чтобы избежать трансдукции центрального эпителия.

5. аденовируса трансдукция культивированных клеток лимбальных

  1. Поддерживать LESC-обогащенных культур в среде с 10 нг / мл EGF (см 3.5) на пластиковой посуде , покрытых смесью FCL при 0,5 мкг / см 2.
  2. Трансдукция культивированных клеток, которые достигли 70-80% слияния с AV укрывает зеленого флуоресцентного белка (ген AV-GFP) или AV-омлет shRNA-GFP в диапазоне множественности инфекции (MOI: 1-300 КОЕ / клетку) , в среде с 2 нг / мл EGF. Выполните transductioN в течение 4 ч при 37 ° С в минимальном объеме (0,2 мл), а затем 20 ч в 0,5 мл среды. Кавеолин транспортный активатор силденафил не требуется для культивирования клеток трансдукции.
  3. С помощью одного из следующих реагентов, которые облегчают AV связывания с клеточной поверхностью, для повышения эффективности А.В. трансдукции: либо поликатионы (1 мкг / мл поли-L-лизин или 5 мкг / мл полибрена) или 6 мкл / реагента трансдукции мл ( например, ViraDuctin), или 20 мкл / мл трансдукции энхансер (например, ibiBoost).
  4. После замены среды на один без AV, инкубировать культивируемые клетки в течение 4 -х дней, в увлажненной атмосфере СО 2 инкубаторе и оценить уровень экспрессии GFP с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа.
  5. Используйте царапанию заживлении ран анализа для оценки миграции клеток в AV-трансдуцированных культур. Растут клетки в луночные камеры горками. Сделайте раны в монослое, царапая клетки в прямой линейное движение с 200 мкл пиPette наконечник. После того, как ранении, изменить среду более свежую, чтобы удалить отдельные клетки.
  6. Сфотографировать раны каждый день с помощью цифровой камеры, прикрепленной к перевернутой микроскопа при увеличении 4X. Регистрируют время, когда исцеление завершена (края раны вступают в контакт по всей раны).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Ранее мы показали , что в роговичных органных культурах, различия в экспрессии диабетических маркеров (например, базальной мембраны белков и интегрина α3β1) и заживления ран между нормальной и диабетических роговиц сохраняются. Эта система культуры подвергали генной терапии, направленной на нормализацию уровней маркеров диабета изменены, с-Met, MMP-10, и катепсина F.

Когда весь роговичный эпителий был трансдуцированны...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Роговица, как представляется, является идеальным ткани для генной терапии из-за своей поверхности места, где для доставки генов, а также оценка эффективности и побочных эффектов, которые легко. Тем не менее, клинический перевод этого мощного подхода по - прежнему медленно из - за недостатка данных о генетических причинах заболеваний роговицы и мишеней 24 генной терапии. Диабетических осложнений , включая изменения роговицы , могут быть в значительной степени эпигенетические характер, что выражается в метаболи...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии финансовых интересов.

Благодарности

Мы с благодарностью признательны за финансовую поддержку от NIH/NEI R01 EY13431 (AVL), грант CTSI UL 1RR033176 (AVL) и гранты от Института регенеративной медицины, Медицинский центр Cedars-Cedars.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
среда минимальная незаменимаяThermo Fisher Scientific11095-080
Optisol-GS Bausch & Lomb50006-OPT
ABAM антибиотико-антимикотическая смесьThermo Fisher Scientific15240062
коллаген кожи теленка Сигма-Олдрич С9791
агар, тканевая культура сортаSigma-Aldrich А1296
н-гептанолСигма-Олдрич72954-5ML-F
O.C.T. состав VWR International25608-930
Dispase II Roche Applied Science4942078001
кератиноцитарная сыворотка (КСФМ) Thermo Fisher Scientific17005042
среда EpiLife с кальциемThermo Fisher ScientificMEPI500CA
N2, 100xThermo Fisher Scientific17502-048
B27 средняя добавка, 50xчеловека Thermo Fisher Scientific17504-044
, 100xThermo Fisher ScientificS-001-5
трипсин 0,25% - ЭДТА 0,02% с феноловым краснымThermo Fisher Scientific25200056
трипсин 0,25% с феноловым краснымThermo Fisher Scientific15050065
ингибитор соевого трипсина Сигма-Олдрич T6414
фетальная бычья сывороткаThermo Fisher Scientific26140079
добавка инсулин-трансферрин-селенит (ITS)Sigma-Aldrich I3146-5ML
антитело к кератину 14Santa Cruz Biotechnologysc-53253
антитело к кератину 15Santa Cruz Biotechnologysc-47697
антитело к кератину 17Santa Cruz BiotechnologySC-58726
антитело к Δ Np63αSanta Cruz Biotechnologysc-8609
антитела к PAX6BioLegendPRB-278P-100
антитела к nidogen-1R& D SystemsMAB2570
антитела к интегрину α 3&бета; 1EMD MilliporeMAB1992
фибронектин человекаBD Biosciences354008
человеческим ламининомSigma-Aldrich L4445
коллаген IV типа человеческийSigma-Aldrich C6745-1ML
аденовирус, экспрессирующий MMP-10 shRNACapital BioSciencesна заказ
аденовирус, экспрессирующий катепсин F, shRNACapital BioSciencesна
аденовирус, экспрессирующий скремблированную shRNA, и GFPCapital BioSciencesна заказ
аденовирус, экспрессирующий c-metOriGene (плазмида)SC323278
аденовирус экспрессирующий GFPKeraFASTFVQ002
силденафил цитрат, 25 мгPfizerиз аптечного
эпидермального фактора роста Thermo Fisher ScientificPHG0311
поли-L-лизинSigma-Aldrich P4707
полибренSigma-Aldrich 107689-10G
ViraDuctinCell BiolabsAD-200
ibiBoostibidi, Германия50301
фосфатно-солевой буфер (PBS)Thermo Fisher Scientific10010049
Corning круглый конец Чашки Петри Dow Corning3005
60 ммThermo Fisher Scientific174888
Nunc Lab-Tek II многолуночные камерные горки Sigma-AldrichC6807
200 μ l наконечники для пипетокBioexpressP-1233-200других поставщиков доступны
инвертированные микроскопы NikonDiaphotдругих поставщиков/моделей в наличии
CO2 инкубатор Thermo Fisher Scientific370 (Steri-Cycle)другие поставщики/модели
люминесцентные микроскопыOlympus, ЯпонияBX-40другие поставщики/модели доступны
препарирующие стереомикроскопыLeica, ГерманияS4 Eдругие поставщики/модели
Добавка для роста кератиноцитов человека добавка для роста кератиноцитов заказ доступны

Ссылки

  1. Bikbova, G., Oshitari, T., Tawada, A., Yamamoto, S. Corneal changes in diabetes mellitus. Curr Diabetes Rev. 8 (4), 294-302 (2012).
  2. Calvo-Maroto, A. M., Perez-Cambrodí, R. J., Albarán-Diego, C., Pons, A., Cerviño, A. Optical quality of the diabetic eye: a review. Eye (Lond). 28 (11), 1271-1280 (2014).
  3. Tripathy, K., Chawla, R., Sharma, Y. R., Venkatesh, P., Vohra, R. Corneal changes in diabetes mellitus. DOS Times. 20 (5), 55-58 (2015).
  4. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Prog Retin Eye Res. 49, 17-45 (2015).
  5. Saghizadeh, M., et al. Overexpression of matrix metalloproteinase-10 and matrix metalloproteinase-3 in human diabetic corneas: a possible mechanism of basement membrane and integrin alterations. Am J Pathol. 158 (2), 723-734 (2001).
  6. Saghizadeh, M., et al. Proteinase and growth factor alterations revealed by gene microarray analysis of human diabetic corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (10), 3604-3615 (2005).
  7. Kabosova, A., Kramerov, A. A., Aoki, A. M., Murphy, G., Zieske, J. D., Ljubimov, A. V. Human diabetic corneas preserve wound healing, basement membrane, integrin and MMP-10 differences from normal corneas in organ culture. Exp Eye Res. 77 (2), 211-217 (2003).
  8. Saghizadeh, M., et al. Alterations of epithelial stem cell marker patterns in human diabetic corneas and effects of c-met gene therapy. Mol Vis. 17, 2177-2190 (2011).
  9. Kowluru, R. A., Kowluru, A., Mishra, M., Kumar, B. Oxidative stress and epigenetic modifications in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Prog Retin Eye Res. 48 (Sep), 40-61 (2015).
  10. Lehrer, M. S., Sun, T. T., Lavker, R. M. Strategies of epithelial repair: modulation of stem cell and transit amplifying cell proliferation. J Cell Sci. 111 (Pt 19), 2867-2875 (1998).
  11. Lu, L., Reinach, P., Kao, W. W. Corneal epithelial wound healing. Exp Biol Med. 226 (7), 653-664 (2001).
  12. Rama, P., et al. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. N Engl J Med. 363 (2), 147-155 (2010).
  13. Di Girolamo, N., et al. Tracing the fate of limbal epithelial progenitor cells in the murine cornea. Stem Cells. 48 (1), 203-225 (2014).
  14. Amitai-Lange, A., et al. Lineage tracing of stem and progenitor cells of the murine corneal epithelium. Stem Cells. 33 (1), 230-239 (2015).
  15. Di Girolamo, N. Moving epithelia: Tracking the fate of mammalian limbal epithelial stem cells. Prog Retin Eye Res. 48 (Sep), 203-225 (2015).
  16. Saghizadeh, M., Kramerov, A. A., Yu, F. S., Castro, M. G., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and diabetic markers in organ cultured human diabetic corneas by adenoviral delivery of c-met gene. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (4), 1970-1980 (2010).
  17. Saghizadeh, M., et al. Enhanced wound healing, kinase and stem cell marker expression in diabetic organ-cultured human corneas upon MMP-10 and cathepsin F gene silencing. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8172-8180 (2013).
  18. Saghizadeh, M., Dib, C. M., Brunken, W. J., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and stem cell marker patterns in organ-cultured human diabetic corneas by gene therapy of limbal cells. Exp Eye Res. 129 (Dec), 66-73 (2014).
  19. Hatchell, D. L., et al. Damage to the epithelial basement membrane in the corneas of diabetic rabbits. Arch Ophthalmol. 101 (3), 469-471 (1983).
  20. Chung, J. H., Kim, W. K., Lee, J. S., Pae, Y. S., Kim, H. J. Effect of topical Na-hyaluronan on hemidesmosome formation in n-heptanol-induced corneal injury. Ophthalmic Res. 30 (2), 96-100 (1998).
  21. Saghizadeh, M., et al. Adenovirus-driven overexpression of proteinases in organ-cultured normal human corneas leads to diabetic-like changes. Brain Res Bull. 81 (2-3), 262-272 (2010).
  22. Sareen, D., et al. Differentiation of human limbal-derived induced pluripotent stem cells into limbal-like epithelium. Stem Cells Transl Med. 3 (9), 1002-1012 (2014).
  23. Funari, V. A., et al. Differentially expressed wound healing-related microRNAs in the human diabetic cornea. PLoS One. 8 (12), e84425(2013).
  24. Mohan, R. R., Rodier, J. T., Sharma, A. Corneal gene therapy: basic science and translational perspective. Ocul Surf. 11 (3), 150-164 (2013).
  25. Liu, J., et al. Different tropism of adenoviruses and adeno-associated viruses to corneal cells: implications for corneal gene therapy. Mol Vis. 14, 2087-2096 (2008).
  26. Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 4 (5), 346-358 (2003).
  27. Sharma, G. D., He, J., Bazan, H. E. P38 and ERK1/2 coordinate cellular migration and proliferation in epithelial wound healing: evidence of cross-talk activation between MAP kinase cascades. J Biol Chem. 278 (24), 21989-21997 (2003).
  28. Saika, S., et al. Role of p38 MAP kinase in regulation of cell migration and proliferation in healing corneal epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (1), 100-109 (2004).
  29. Xu, K. P., Li, Y., Ljubimov, A. V., Yu, F. S. High glucose suppresses epidermal growth factor receptor/phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathway and attenuates corneal epithelial wound healing. Diabetes. 58 (5), 1077-1085 (2009).
  30. Xu, K., Yu, F. S. Impaired epithelial wound healing and EGFR signaling pathways in the corneas of diabetic rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (6), 3301-3308 (2011).
  31. Takamura, Y., et al. Aldose reductase inhibitor counteracts the enhanced expression of matrix metalloproteinase-10 and improves corneal wound healing in galactose-fed rats. Mol Vis. 19, 2477-2486 (2013).
  32. Byun, Y. S., Kang, B., Yoo, Y. S., Joo, C. K. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves corneal epithelial innervation and wound healing in diabetic rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1948-1955 (2015).
  33. Deng, S. X., et al. Characterization of limbal stem cell deficiency by in vivo laser scanning confocal microscopy: a microstructural approach. Arch Ophthalmol. 130 (4), 440-445 (2012).
  34. Lagali, N., et al. In vivo morphology of the limbal palisades of Vogt correlates with progressive stem cell deficiency in aniridia-related keratopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (8), 5333-5342 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Протоонкоген c-metподавление экспрессии MMP-10ингибирование катепсина Fполикатионные усилители
Аденовируса генной терапии для больных сахарным диабетом Кератопатия: Влияние на заживление ран и стволовых клеток маркера выражение в человеческих органов культивируемых роговиц и лимбальных эпителиальных клеток
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.