Методическая статья

Multi-фермента скрининга с использованием высокой пропускной Генетическая ферментного Screening System

DOI:

10.3791/54059

⸱

8 августа 2016 г.

 ,  ,  , 
1Synthetic Biology & Bioengineering Research Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, 2Biosystems and Bioengineering Program, University of Science and Technology, Daejeon, South Korea

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой работе представлен метод высокопроизводительного скрининга с использованием универсальной системы генетического скрининга ферментов, которая теоретически может быть применена к более чем 200 ферментам. В данном случае единая система скрининга идентифицирует три различных фермента (липазу, целлюлазу и щелочную фосфатазу) путем простого изменения используемого субстрата (-нитрофенилацетат,-нитрофенил-β-D-целлобиозид и фенилфосфат).

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Недавняя разработка высокопроизводительного метода анализа одиночных клеток позволяет проводить скрининг новых ферментов на основе функциональной активности из крупномасштабной метагеномной библиотеки1. Ранее мы предложили систему генетического скрининга ферментов (GESS), в которой используется регулятор диметилфенола, активируемый фенолом или-нитрофенолом. Поскольку огромное количество естественных ферментативных реакций приводит к образованию этих фенольных соединений из субстратов, производящих фенол, эта единая система генетического скрининга теоретически может быть применена для скрининга более 200 различных ферментов в базе данных БРЕНДА. Несмотря на общую применимость GESS, применение процесса скрининга требует специальной процедуры для достижения максимальных сигналов проточной цитометрии. Здесь мы подробно описываем разработанный процесс скрининга, который включает в себя предварительную обработку метагенома с помощью GESS и работу сортировщика проточной цитометрии. Три различных фенольных субстрата (-нитрофенилацетат,-нитрофенил-β-D-целлобиозид и фенилфосфат) с GESS были использованы для скрининга и идентификации трех различных ферментов (липазы, целлюлазы и щелочной фосфатазы) соответственно. Выбранная активность метагеномных ферментов была подтверждена только с помощью проточной цитометрии, но секвенирование ДНК и разнообразный анализ in vitro могут быть использованы для дальнейшей идентификации генов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Недавно был разработан с высокой пропускной способностью методикой определения одноклеточного позволяет новые ферменты , которые будут экранированы от крупномасштабной генетической библиотеки на основе их функциональной активности 1. На одном уровне клетки, белки, регулирующие транскрипцию используются, чтобы вызвать экспрессию гена-репортера путем обнаружения малых молекул, которые образуются в результате активности целевого фермента. Одним из первых подход предусматривал выделение фенола деградирующих оперона из Ralstonia eutropha Е2 с использованием субстрата индуцированной генетической экспрессии скрининг метод (SIGEX), в котором подложка индуцирует экспрессию белка - репортера 2. NhaR из Pseudomonas putida был использован для выбора бензальдегида дегидрогеназы 3 и LysG из Corynebacterium glutamicum был использован для высокопроизводительного скрининга нового L-лизин штамма из различных мутантных библиотек 4.

Ранее генетический фермент screeniСистема нг (GESS) была предложена в качестве общего применения скрининга платформы 5. Эта система использует регулятор ДИМЕТИЛФЕНОЛА фенол-распознающих, DmpR, Р. putida. DmpR (E135K), и мутант DmpR, также могут быть использованы в GESS (PnP-GESS) для обнаружения р -nitrophenol (PnP). В присутствии ферментов - мишеней , продуцирующих фенольные соединения, ГЕСС в E. палочка клетки испускает флуоресцентный сигнал, что позволяет быстрое выделение отдельных клеток с помощью флуоресцентного активированного сортировщика клеток (FACS). Но экспрессия метагеномной фермента, как представляется, слабее, чем у обычных рекомбинантных ферментов; Таким образом, GESS был разработан для обнаружения фенольных соединений с максимальной чувствительностью, исследуя сочетание сайта связывания рибосом (RBS) и терминатор последовательностей наряду с оптимального рабочего состояния 5.

Одним из основных преимуществ GESS является то, что это единственный метод теоретически позволяет скрининг OVэр чем 200 различных типов ферментов , в базе данных Бренда (таблица 1, HTTP: // www.brenda-enzymes.info, 2013.7) путем простого использования различных субстратов. Было показано , что целлюлазы, липазы и метилпаратиону гидролазы (MPH) можно обнаружить с помощью ПНП-Гесс с соответствующими субстратами р нитрофенил бутирата, р - нитрофенил-cellotrioside и метилпаратиона, соответственно 5. Недавно было доказано , что щелочной фосфатазы (АР), которая является одним из новых ферментов , идентифицированных с использованием ПНП-Гесс, является первым термолабильных А.П. найден в холодоадаптированных морских метагеномов 6.

Здесь, подробная информация о процессе скрининга представлен с PnP-GESS обнаружения деятельности трех различных типов enzymes- липазы, целлюлазы и щелочной фосфатазы -И быстрого выявления новых кандидатов ферментов из метагеномной библиотеки 5,6. Процессы включают метагенома предварительную обработку с ПНП-GESS и эксплуатации флвл цитометрии сортировщика. В то время как полученные удары должны быть секвенированы для дальнейшей идентификации, этот протокол охватывает процедуру до шаги ферментативного подтверждения активности с использованием проточной цитометрии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка библиотеки метагеномной с ПНП-GESS

  1. Построить метагеномной библиотеку в E. палочка с fosmid вектором с использованием набора fosmid производства библиотеки в соответствии с протоколом производителя 5.
  2. Аликвоты по 100 мкл библиотеки для хранения при -70 ° C, что является источником метагеномных библиотеки клеток.
    Примечание: Оптическая плотность образца , измеренной при длине волны 600 нм (OD 600) этого фонда библиотеки составляет около 100.
  3. Разморозить 100 мкл основного метагеномной библиотеки на льду и инокуляции в 500 мл колбу, содержащую 50 мл Лурия-Бертани (LB) и 12,5 мкг / мл хлорамфеникола, за которой следует 37 ° C инкубации в течение 2 ч.
  4. Сбора клеток в 50 мл коническую пробирку центрифугированием при 1000 х г в течение 20 мин при температуре 4 ° С.
  5. Ресуспендируют осадок быстро в 50 мл охлажденного льдом дистиллированной воды (DW) и центрифуге при 1000 х г в течение 20 мин при температуре 4 ° С снова.
  6. Resuspend осадок в 50 мкл охлажденного льдом DW с добавлением 10% (об / об) глицерина. Используйте 50 мкл этой клеточной аликвоты для электропорации.
  7. Поместите смесь электрокомпетентных клеток 50 мкл и pGESS (E135K) 5 ДНК (100 нг) в охлажденный льдом кювету для электропорации и электропорации (1,8 кВ / см, 25 мкФ) смеси.
  8. Быстро добавить 1 мл супер оптимальной бульон с катаболитной репрессии (SOC) среды и ресуспендирования клеток мягко.
  9. Передача клеток в 14 мл с круглым дном трубки с помощью пипетки и инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа.
  10. Спред 500 мкл выделенных клеток на LB 20 х 20 см квадратной пластины, содержащей 12,5 мкг / мл хлорамфеникола и 50 мкг / мл ампициллина. Инкубируйте планшет при 30 ° С в течение 12 часов.
  11. Скрип колонии с помощью мобильного скребок и собирают клетки в 50 мл коническую трубку с помощью ледяной носитель клеток.
  12. Центрифуга при 1000 х г в течение 20 мин при температуре 4 ° С. Ресуспендируют осадок в 10 мл охлажденного льдом носителей клетокдостичь OD 600 из 100.
  13. Аликвоты по 20 мкл клеток для хранения при -70 ° C.

2. Удаление ложных срабатываний из библиотеки метагеномной

  1. Растаяйте запаса метагеномных библиотеки клеток (из стадии 1.13), содержащих метагеномной fosmid ДНК и pGESS (E135K) на льду.
  2. Инокулируйте 10 мкл клеток в 2 мл LB, содержащей 50 мкг / мл ампициллина и 12,5 мкг / мл хлорамфеникола в 14-мл с круглым дном трубки. Инкубируют при 37 ° C при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту в течение 4 часов.
  3. В то же время, включите машину FACS и откройте программное обеспечение FACS по умолчанию. Используйте следующие параметры: диаметр кончика насадки, 70 мкм; Форвард Scatter Area (FSC-A) чувствительность, 300 V-логарифмическое усиление; Боковой Scatter Площадь (SSC-A) чувствительность, 350 V-логарифмическое усиление; Флуоресцеинизотиоцианатом Площадь (FITC-A) чувствительность, 450 V-логарифмическое усиление; пороговый параметр, FSC-значение 5.
    Примечание: Типовые настройки приведеныдля FACS устройства , указанного в таблице материалов. Настройка параметров для других устройств FACS.
  4. Развести метагеномных библиотеки клеток из шага 2.2 добавлением 5 мкл образца к 5-мл с круглым дном пробирку, содержащую 1 мл PBS.
  5. Поместите разбавленный образец библиотеки на порт погрузки прибора FACS и нажмите на кнопку Загрузить на панели управления Приобретение программного обеспечения FACS.
  6. Установите частоту событий на 1000 - 1500 событий / сек, нажав и управления кнопки Flow Rate на приборной панели.
  7. Создать журнал масштабируется FSC-A против журнала масштабируется SSC-график рассеяния на глобальном листе, нажав на кнопку Dot участок в панели инструментов. Отрегулируйте Разброс R1 затвора, чтобы охватить Синглетное события (бактериальная популяция) с помощью кнопки Полигон Gate в панели инструментов.
  8. Участок гистограмма с количеством клеток по сравнению с журнала масштабируется FITC-A на листе, нажав на кнопку Гистограмма. Затем отрегулируйте напряжение FITC от CytomeВкладка Параметры тер на окне инспектора управления таким образом, что пик распределения в форме колокола составляет менее 10 2 ФИТЦ-A.
  9. Создание журнала масштабируется FSC-A против. журнал FITC-Участок, нажав на кнопку Dot участка на мировом листе. Установить сортировочный R2 затвора на участке с помощью кнопки Полигон Gate на панели инструментов, так что ворота расположены между + 5% и -5% клеток от центра распределения (всего 10% клеток вокруг пика BELL- образной кривой).
  10. Поместите пробирку , содержащую 1,2 мл LB , содержащей 50 мкг / мл ампициллина и 12,5 мкг / мл хлорамфеникола на выходе из прибора FACS и отсортировывать 10 6 клеток , удовлетворяющие оба R1 и R2 ворота.
  11. Снимите трубку сбора, колпачок и осторожно завихрения.

3. метагеномной Фермент Скрининг

  1. Инкубируйте отсортированных клеток (со стадии 2.11) при 37 ° С при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту до OD 600 достигает 0,5.
  2. Добавить 1 мкл раствора скопировать индукции для усиления внутриклеточного fosmid числа копий. Инкубируйте клетки еще в течение 3 ч при 37 ° C при встряхивании со скоростью 250 оборотов в минуту.
  3. Для подготовки клеток для сортировки, добавьте 0,5 мл культивируемых клеток и соответствующего субстрата (п - нитрофенил ацетат, р - нитрофенил-β-D-целлобиозида, или фенил , фосфат) в 14-мл с круглым дном трубки в конечной концентрации 100 мкМ.
    1. Для получения контрольной пробы, добавляют 0,5 мл культивируемых клеток из шага 3.2 в 14-мл с круглым дном трубки. Добавьте тот же объем PBS в объеме субстрата в стадии 3.3.
  4. Выдержите двух образцов при 37 ° С при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту в течение 3 часов.
  5. В то же время, подготовить машину FACS с теми же конфигурациями, как на стадии 2.3.
  6. Добавьте 5 мкл клеток (для сортировки) и контрольных клеток на две 5 мл круглодонную пробирки, содержащие 1 мл PBS, соответственно.
  7. Поместите пробирку, содержащую контрольные клетки на Тон порт погрузки из FACS и нажмите на кнопку Загрузить на панели управления Приобретение программного обеспечения FACS. Регулировка частоты событий 1000 - 3000 событий / сек с помощью кнопки управления Flow Rate на приборной панели.
  8. Создание журнала масштабируется FSC-A против журнала масштабируется SSC-точечный график, нажав на кнопку Dot участка на мировом листе программного обеспечения и регулировки разброса R1 затвора , чтобы охватить Синглетное события (бактериальное население) с помощью кнопки Полигон Gate на панель инструментов.
  9. Создание журнала масштабируется FSC-A vs. журнал масштабируется FITC-точечный график, нажав на кнопку Dot участка на листе и установить сортировочный R2 затвора на участке с помощью кнопки Полигон Gate на панели инструментов , так что менее 0,1% от негативные клетки обнаруживаются в ворота R2.
  10. Заменить контрольный образец трубки с сортировочной пробирки с образцом, и регулировать скорость событий 1000 - 3000 событий / сек, управляя кнопками Flow Rate на приборной панели.
  11. Поместите пробирку, содержащую 0,5мл LB на выходе из прибора FACS и разобравшись 10 4 клеток , удовлетворяющие обе ворота R1 и R2.
    Примечание: критерий сортировки может находиться в диапазоне от верхнего от 0,1% до 5% от FITC-А в воротах R2. В этом протоколе, топ 1% клеток были собраны в качестве позитивов.
  12. Снимите трубку сбора, колпачок и осторожно завихрения.
  13. Намажьте емкостью 0,5 мл собранных образцов на двух чашках с агаром (90 мм чашках Петри), содержащих LB, 50 мкг / мл ампициллина, 12,5 мкг / мл хлорамфеникола, и инкубируйте при 37 ° С в течение ночи.
  14. При необходимости выполнить дополнительные раунды сортировки для FITC-A обогащения, повторив шаги 3.1-3.14.

4. Хит Выбор и активность энзимов Подтверждение

  1. Анализ проточной цитометрией
    1. Из инкубированных пластины на шаге 3.14, выберите колонию, не оказывающем флуоресценции с использованием сборщика колонии под наблюдением 488 нм длины волны светодиодной подсветки.
    2. Привить выбранную колонию в 14 мл роунд дном пробирку , содержащую 2 мл LB , содержащей 50 мкг / мл ампициллина и 12,5 мкг / мл хлорамфеникола , при 37 ° C при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту , пока его OD 600 достигает 0,5.
    3. Добавьте 2 мкл раствора скопировать индукции для усиления внутриклеточного fosmid числа копий. Инкубируйте клетки еще в течение 3 ч при 37 ° C при встряхивании со скоростью 250 оборотов в минуту.
    4. Приготовьте 14 мл с круглым дном трубки и добавляют 1 мл культивируемых клеток (шаг 4.1.3). Добавьте соответствующий субстрат (р - нитрофенил ацетат, р -nitrophenyl- & beta ; -D-целлобиозида или фенил , фосфата) в конечной концентрации 100 мкМ.
      1. Для контроля, добавьте по 1 мл культивируемых клеток с шага 4.1.3 в 14 мл с круглым дном, добавить необходимые тот же объем PBS в объеме субстрата в стадии 4.1.4.
    5. Выдержите двух образцов при 37 ° С при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту в течение 3 часов.
    6. В то же время, подготовить машину FACS с теми же конфигурациями, как на стадии 2.3,
    7. Добавьте 5 мкл контрольного и субстрата клеток, обработанных по 5 мл круглым дном пробирки, содержащие 1 мл PBS, соответственно.
    8. Поместите пробирку, содержащую контрольные клетки на погрузочной порту устройства FACS и нажмите на кнопку Загрузить на панели управления Приобретение программного обеспечения FACS. Установите частоту событий на 1000 - 3000 событий / сек с помощью кнопок Flow Rate на приборной панели.
    9. Нажмите на кнопку Acquisition для измерения FITC-A.
    10. Заменить пробирку управления с подложкой обработанной пробы трубки. Установите частоту событий на 1000 - 3000 событий / сек с помощью кнопок Flow Rate на приборной панели.
    11. Нажмите на кнопку Acquisition для измерения FITC-A.
    12. Сравните флуоресценции двух групп клеток путем построения гистограммы числа клеток по сравнению с лог масштабируется FITC-A.
  2. Другие анализы, чтобы подтвердить активность фермента
    1. Для дальнейшей идентификации отобранных кандидатов ферментов, экстракт fosmid ДНК с использованием стандартной про экстракциицедуры из коммерческих наборов экстракции и анализа нуклеотидной последовательности, или проверить активность фермента 6,7 в пробирке.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Три фенольные субстраты были рассмотрены с целью идентификации новых метагеномных ферменты из метагенома в библиотеке океанских приливов и отливов плоских осадков в Тэанской, Южная Корея, следуя предлагаемого протокола. Для строительства библиотеки, в среднем 30 - метагенома последовательности 40 кб были вставлены в fosmids, которые основаны на E. палочка F фактор репликон и представлены в виде одной копии в клетке. Обратите внимание , что fosmids широко используются для построе...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Повышение эффективности производства биокатализаторов является ключевым для успеха био-химической промышленности , основанной 9 и метагенома считается одним из лучших естественных источника фермента. В этом смысле важно скрининга новых ферментов из метагенома , где большинство генетических ресурсов не были изучены 10. Существует несколько методов отбора были разработаны , которые непосредственно обнаружить ферментные продукты с использованием активаторы транскрипции 11, 12 , но эти метод...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано грантами от Центра интеллектуальной синтетической биологии Global Frontier Project (2011-0031944), программы Next-Generation Biogreen 21 (PJ009524), NRF-2015M3D3A1A01064875 и программы исследовательской инициативы KRIBB.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
CopyControlEpicentreCCFOS110Fosmid 
Индукционный раствор CopyControlЭпицентр CCIS125Фосмид Копия индукционного раствора
EPI300ЭпицентрEC300110Электрокомпетентная ячейка
pCC1FOSЭпицентрCCFOS110Фосмид вектор
Ген Пульсер MxcellBio-RadЭлектропорационная кювета и электропоратная система
FACSAria IIIBecton DickinsonПроточная цитометрия (аппарат FACS)
AZ100M,Микроскоп Nikon 
УльтраСлим Маэстрогенсветодиодный осветитель
50 мл коническая трубкаBD Falcon
14 мл круглодонная туба BD Falcon
5 мл туба с круглым дномBD Falcon
p-нитрофенилфосфатSigma-AldrichN7653Substrate
p-нитрофенил β-D-целлобиозидSigma-AldrichN5759Substrate
p-нитрофенилбутилатSigma-AldrichN9876& НБСП;субстрат
Luria-Bertani (LB)BD Difco244620Триптон 10 г/л, Экстракт дрожжей 5 г/л, Хлорид натрия 10 г/л
Супер Оптимальный бульон (SOB)BD Difco244310Триптон 20 г/л, Дрожжевой экстракт 5 г/л, Хлорид натрия 0,5 г/л, Сульфат магния 2,4 г/л, Хлорид калия 186 мг/л
Супер Оптимальный бульон с подавлением катаболитов (SOC)SOB, 0,4 % глюкозы
2x Дрожжевой экстракт Триптон (2xYT)BD Difco244020Панкреатический перевар казеина 16 г/л, Дрожжевой экстракт 10 г/л, Дрожжевой экстракт 5 г/л
Клеточная среда хранения 2xYT бульон, 15% глицерин, 2% глюкоза
pGESS(E135K)Вектор ДНК, содержащий dmpR, гены egfp с их соответствующими промоторами, RBS и терминатор.
См. ссылку 5 в рукописи для Подробнее.
ХлорамфениколSigmaC0378
АмпициллинSigmaA9518
BD FACSДиваБектон ДикинсонПроточная цитометрия версии 7.0
PBSGibco70011-0440,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,0144% Na<суб>2HPO<суб>4, 0,024% KH<суб>2ОП<суб>4, pH 7,4
Производственный комплект библиотеки

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eggeling, L., Bott, M., Marienhagen, J. Novel screening methods-biosensors. Curr. Opin. Biotech. 35, 30-36 (2015).
  2. Uchiyama, T., Abe, T., Ikemura, T., Watanabe, K. Substrate-induced gene-expression screening of environmental metagenome libraries for isolation of catabolic genes. Nat. Biotechnol. 23 (1), 88-93 (2005).
  3. Van Sint Fiet, S., van Beilen, J. B., Witholt, B. Selection of biocatalysts for chemical synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (6), 1693-1698 (2006).
  4. Binder, S., et al. A high-throughput approach to identify genomic variants of bacterial metabolite producers at the single-cell level. Genome Biol. 13 (5), R40(2012).
  5. Choi, S., et al. Toward a generalized and High-throughput Enzyme Screening System Based on Artificial Genetic Circuits. ACS Synthetic Biology. 3 (3), 163-171 (2014).
  6. Lee, D. H., et al. A novel psychrophilic alkaline phosphatase from the metagenome of tidal flat sediments. BMC Biotechnology. 15 (1), (2015).
  7. Warnecke, F., et al. Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite. Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).
  8. Kim, U. J., Shizuya, H., de Jong, P. J., Birren, B., Simon, M. I. Stable propagation of cosmid sized human DNA inserts in an F factor based vector. Nucleic Acids Research. 20 (5), 1083-1085 (1992).
  9. Jemli, S., Ayadi-Zouari, D., Hlima, H. B., Bejar, S. Biocatalysts: application and engineering for industrial purposes. Crc. Cr. Rev. Biotechn. 36 (2), 246-258 (2014).
  10. Lorenz, P., Eck, J. Metagenomics and industrial applications. Nat. Rev. Microbiol. 3 (6), 510-516 (2005).
  11. Uchiyama, T., Miyazaki, K. Product-induced gene expression, a product responsive reporter assay used to screen metagenomic libraries for enzyme encoding genes. Applied and environmental microbiology. 76 (21), 7029-7035 (2010).
  12. Mohn, W. W., Garmendia, J., Galvao, T. C., De Lorenzo, V. Surveying bio-transformations with à la carte genetic traps: translating dehydrochlorination of lindane (gamma-hexachlorocyclohexane) into lacZ-based phenotypes. Environmental microbiology. 8 (3), 546-555 (2006).
  13. Tang, S. Y., Cirino, P. C. Design and application of a mevalonate-responsive regulatory protein. Angew Chem. Int. Ed. 50 (5), 1084-1086 (2011).
  14. Jha, R. K., Kern, T. L., Fox, D. T., Strauss, C. E. M. Engineering an Acinetobacter regulon for biosensing and high-throughput enzyme screening in E. coli via flow cytometry. Nucleic Acids Res. 42 (12), 8150-8160 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

FACSGFP

Похожие статьи