Multi-фермента скрининга с использованием высокой пропускной Генетическая ферментного Screening System

Summary

В этой работе представлен метод высокопроизводительного скрининга с использованием универсальной системы генетического скрининга ферментов, которая теоретически может быть применена к более чем 200 ферментам. В данном случае единая система скрининга идентифицирует три различных фермента (липазу, целлюлазу и щелочную фосфатазу) путем простого изменения используемого субстрата (-нитрофенилацетат,-нитрофенил-β-D-целлобиозид и фенилфосфат).

Abstract

Недавняя разработка высокопроизводительного метода анализа одиночных клеток позволяет проводить скрининг новых ферментов на основе функциональной активности из крупномасштабной метагеномной библиотеки¹. Ранее мы предложили систему генетического скрининга ферментов (GESS), в которой используется регулятор диметилфенола, активируемый фенолом или-нитрофенолом. Поскольку огромное количество естественных ферментативных реакций приводит к образованию этих фенольных соединений из субстратов, производящих фенол, эта единая система генетического скрининга теоретически может быть применена для скрининга более 200 различных ферментов в базе данных БРЕНДА. Несмотря на общую применимость GESS, применение процесса скрининга требует специальной процедуры для достижения максимальных сигналов проточной цитометрии. Здесь мы подробно описываем разработанный процесс скрининга, который включает в себя предварительную обработку метагенома с помощью GESS и работу сортировщика проточной цитометрии. Три различных фенольных субстрата (-нитрофенилацетат,-нитрофенил-β-D-целлобиозид и фенилфосфат) с GESS были использованы для скрининга и идентификации трех различных ферментов (липазы, целлюлазы и щелочной фосфатазы) соответственно. Выбранная активность метагеномных ферментов была подтверждена только с помощью проточной цитометрии, но секвенирование ДНК и разнообразный анализ in vitro могут быть использованы для дальнейшей идентификации генов.

Introduction

Недавно был разработан с высокой пропускной способностью методикой определения одноклеточного позволяет новые ферменты , которые будут экранированы от крупномасштабной генетической библиотеки на основе их функциональной активности ^1. На одном уровне клетки, белки, регулирующие транскрипцию используются, чтобы вызвать экспрессию гена-репортера путем обнаружения малых молекул, которые образуются в результате активности целевого фермента. Одним из первых подход предусматривал выделение фенола деградирующих оперона из Ralstonia eutropha Е2 с использованием субстрата индуцированной генетической экспрессии скрининг метод (SIGEX), в котором подложка индуцирует экспрессию белка - репортера ^2. NhaR из Pseudomonas putida был использован для выбора бензальдегида дегидрогеназы ³ и LysG из Corynebacterium glutamicum был использован для высокопроизводительного скрининга нового L-лизин штамма из различных мутантных библиотек ^4.

Ранее генетический фермент screeniСистема нг (GESS) была предложена в качестве общего применения скрининга платформы ^5. Эта система использует регулятор ДИМЕТИЛФЕНОЛА фенол-распознающих, DmpR, Р. putida. DmpR (E135K), и мутант DmpR, также могут быть использованы в GESS (PnP-GESS) для обнаружения р -nitrophenol (PnP). В присутствии ферментов - мишеней , продуцирующих фенольные соединения, ГЕСС в E. палочка клетки испускает флуоресцентный сигнал, что позволяет быстрое выделение отдельных клеток с помощью флуоресцентного активированного сортировщика клеток (FACS). Но экспрессия метагеномной фермента, как представляется, слабее, чем у обычных рекомбинантных ферментов; Таким образом, GESS был разработан для обнаружения фенольных соединений с максимальной чувствительностью, исследуя сочетание сайта связывания рибосом (RBS) и терминатор последовательностей наряду с оптимального рабочего состояния ^5.

Одним из основных преимуществ GESS является то, что это единственный метод теоретически позволяет скрининг OVэр чем 200 различных типов ферментов , в базе данных Бренда (таблица 1, HTTP: // www.brenda-enzymes.info, 2013.7) путем простого использования различных субстратов. Было показано , что целлюлазы, липазы и метилпаратиону гидролазы (MPH) можно обнаружить с помощью ПНП-Гесс с соответствующими субстратами р нитрофенил бутирата, р - нитрофенил-cellotrioside и метилпаратиона, соответственно ^5. Недавно было доказано , что щелочной фосфатазы (АР), которая является одним из новых ферментов , идентифицированных с использованием ПНП-Гесс, является первым термолабильных А.П. найден в холодоадаптированных морских метагеномов ^6.

Здесь, подробная информация о процессе скрининга представлен с PnP-GESS обнаружения деятельности трех различных типов enzymes- липазы, целлюлазы и щелочной фосфатазы -И быстрого выявления новых кандидатов ферментов из метагеномной библиотеки ^5,6. Процессы включают метагенома предварительную обработку с ПНП-GESS и эксплуатации флвл цитометрии сортировщика. В то время как полученные удары должны быть секвенированы для дальнейшей идентификации, этот протокол охватывает процедуру до шаги ферментативного подтверждения активности с использованием проточной цитометрии.

Protocol

1. Подготовка библиотеки метагеномной с ПНП-GESS

1. Построить метагеномной библиотеку в E. палочка с fosmid вектором с использованием набора fosmid производства библиотеки в соответствии с протоколом производителя ^5.
2. Аликвоты по 100 мкл библиотеки для хранения при -70 ° C, что является источником метагеномных библиотеки клеток.
   Примечание: Оптическая плотность образца , измеренной при длине волны 600 нм (OD ₆₀₀₎ этого фонда библиотеки составляет около 100.
3. Разморозить 100 мкл основного метагеномной библиотеки на льду и инокуляции в 500 мл колбу, содержащую 50 мл Лурия-Бертани (LB) и 12,5 мкг / мл хлорамфеникола, за которой следует 37 ° C инкубации в течение 2 ч.
4. Сбора клеток в 50 мл коническую пробирку центрифугированием при 1000 х г в течение 20 мин при температуре 4 ° С.
5. Ресуспендируют осадок быстро в 50 мл охлажденного льдом дистиллированной воды (DW) и центрифуге при 1000 х г в течение 20 мин при температуре 4 ° С снова.
6. Resuspend осадок в 50 мкл охлажденного льдом DW с добавлением 10% (об / об) глицерина. Используйте 50 мкл этой клеточной аликвоты для электропорации.
7. Поместите смесь электрокомпетентных клеток 50 мкл и pGESS (E135K) ⁵ ДНК (100 нг) в охлажденный льдом кювету для электропорации и электропорации (1,8 кВ / см, 25 мкФ) смеси.
8. Быстро добавить 1 мл супер оптимальной бульон с катаболитной репрессии (SOC) среды и ресуспендирования клеток мягко.
9. Передача клеток в 14 мл с круглым дном трубки с помощью пипетки и инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа.
10. Спред 500 мкл выделенных клеток на LB 20 х 20 см квадратной пластины, содержащей 12,5 мкг / мл хлорамфеникола и 50 мкг / мл ампициллина. Инкубируйте планшет при 30 ° С в течение 12 часов.
11. Скрип колонии с помощью мобильного скребок и собирают клетки в 50 мл коническую трубку с помощью ледяной носитель клеток.
12. Центрифуга при 1000 х г в течение 20 мин при температуре 4 ° С. Ресуспендируют осадок в 10 мл охлажденного льдом носителей клетокдостичь OD ₆₀₀ из 100.
13. Аликвоты по 20 мкл клеток для хранения при -70 ° C.

2. Удаление ложных срабатываний из библиотеки метагеномной

1. Растаяйте запаса метагеномных библиотеки клеток (из стадии 1.13), содержащих метагеномной fosmid ДНК и pGESS (E135K) на льду.
2. Инокулируйте 10 мкл клеток в 2 мл LB, содержащей 50 мкг / мл ампициллина и 12,5 мкг / мл хлорамфеникола в 14-мл с круглым дном трубки. Инкубируют при 37 ° C при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту в течение 4 часов.
3. В то же время, включите машину FACS и откройте программное обеспечение FACS по умолчанию. Используйте следующие параметры: диаметр кончика насадки, 70 мкм; Форвард Scatter Area (FSC-A) чувствительность, 300 V-логарифмическое усиление; Боковой Scatter Площадь (SSC-A) чувствительность, 350 V-логарифмическое усиление; Флуоресцеинизотиоцианатом Площадь (FITC-A) чувствительность, 450 V-логарифмическое усиление; пороговый параметр, FSC-значение 5.
   Примечание: Типовые настройки приведеныдля FACS устройства , указанного в таблице материалов. Настройка параметров для других устройств FACS.
4. Развести метагеномных библиотеки клеток из шага 2.2 добавлением 5 мкл образца к 5-мл с круглым дном пробирку, содержащую 1 мл PBS.
5. Поместите разбавленный образец библиотеки на порт погрузки прибора FACS и нажмите на кнопку Загрузить на панели управления Приобретение программного обеспечения FACS.
6. Установите частоту событий на 1000 - 1500 событий / сек, нажав и управления кнопки Flow Rate на приборной панели.
7. Создать журнал масштабируется FSC-A против журнала масштабируется SSC-график рассеяния на глобальном листе, нажав на кнопку Dot участок в панели инструментов. Отрегулируйте Разброс R1 затвора, чтобы охватить Синглетное события (бактериальная популяция) с помощью кнопки Полигон Gate в панели инструментов.
8. Участок гистограмма с количеством клеток по сравнению с журнала масштабируется FITC-A на листе, нажав на кнопку Гистограмма. Затем отрегулируйте напряжение FITC от CytomeВкладка Параметры тер на окне инспектора управления таким образом, что пик распределения в форме колокола составляет менее 10 ² ФИТЦ-A.
9. Создание журнала масштабируется FSC-A против. журнал FITC-Участок, нажав на кнопку Dot участка на мировом листе. Установить сортировочный R2 затвора на участке с помощью кнопки Полигон Gate на панели инструментов, так что ворота расположены между + 5% и -5% клеток от центра распределения (всего 10% клеток вокруг пика BELL- образной кривой).
10. Поместите пробирку , содержащую 1,2 мл LB , содержащей 50 мкг / мл ампициллина и 12,5 мкг / мл хлорамфеникола на выходе из прибора FACS и отсортировывать 10 ⁶ клеток , удовлетворяющие оба R1 и R2 ворота.
11. Снимите трубку сбора, колпачок и осторожно завихрения.

3. метагеномной Фермент Скрининг

1. Инкубируйте отсортированных клеток (со стадии 2.11) при 37 ° С при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту до OD ₆₀₀ достигает 0,5.
2. Добавить 1 мкл раствора скопировать индукции для усиления внутриклеточного fosmid числа копий. Инкубируйте клетки еще в течение 3 ч при 37 ° C при встряхивании со скоростью 250 оборотов в минуту.
3. Для подготовки клеток для сортировки, добавьте 0,5 мл культивируемых клеток и соответствующего субстрата (п - нитрофенил ацетат, р - нитрофенил-β-D-целлобиозида, или фенил , фосфат) в 14-мл с круглым дном трубки в конечной концентрации 100 мкМ.
   1. Для получения контрольной пробы, добавляют 0,5 мл культивируемых клеток из шага 3.2 в 14-мл с круглым дном трубки. Добавьте тот же объем PBS в объеме субстрата в стадии 3.3.
4. Выдержите двух образцов при 37 ° С при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту в течение 3 часов.
5. В то же время, подготовить машину FACS с теми же конфигурациями, как на стадии 2.3.
6. Добавьте 5 мкл клеток (для сортировки) и контрольных клеток на две 5 мл круглодонную пробирки, содержащие 1 мл PBS, соответственно.
7. Поместите пробирку, содержащую контрольные клетки на Тон порт погрузки из FACS и нажмите на кнопку Загрузить на панели управления Приобретение программного обеспечения FACS. Регулировка частоты событий 1000 - 3000 событий / сек с помощью кнопки управления Flow Rate на приборной панели.
8. Создание журнала масштабируется FSC-A против журнала масштабируется SSC-точечный график, нажав на кнопку Dot участка на мировом листе программного обеспечения и регулировки разброса R1 затвора , чтобы охватить Синглетное события (бактериальное население) с помощью кнопки Полигон Gate на панель инструментов.
9. Создание журнала масштабируется FSC-A vs. журнал масштабируется FITC-точечный график, нажав на кнопку Dot участка на листе и установить сортировочный R2 затвора на участке с помощью кнопки Полигон Gate на панели инструментов , так что менее 0,1% от негативные клетки обнаруживаются в ворота R2.
10. Заменить контрольный образец трубки с сортировочной пробирки с образцом, и регулировать скорость событий 1000 - 3000 событий / сек, управляя кнопками Flow Rate на приборной панели.
11. Поместите пробирку, содержащую 0,5мл LB на выходе из прибора FACS и разобравшись 10 ⁴ клеток , удовлетворяющие обе ворота R1 и R2.
    Примечание: критерий сортировки может находиться в диапазоне от верхнего от 0,1% до 5% от FITC-А в воротах R2. В этом протоколе, топ 1% клеток были собраны в качестве позитивов.
12. Снимите трубку сбора, колпачок и осторожно завихрения.
13. Намажьте емкостью 0,5 мл собранных образцов на двух чашках с агаром (90 мм чашках Петри), содержащих LB, 50 мкг / мл ампициллина, 12,5 мкг / мл хлорамфеникола, и инкубируйте при 37 ° С в течение ночи.
14. При необходимости выполнить дополнительные раунды сортировки для FITC-A обогащения, повторив шаги 3.1-3.14.

4. Хит Выбор и активность энзимов Подтверждение

1. Анализ проточной цитометрией
   1. Из инкубированных пластины на шаге 3.14, выберите колонию, не оказывающем флуоресценции с использованием сборщика колонии под наблюдением 488 нм длины волны светодиодной подсветки.
   2. Привить выбранную колонию в 14 мл роунд дном пробирку , содержащую 2 мл LB , содержащей 50 мкг / мл ампициллина и 12,5 мкг / мл хлорамфеникола , при 37 ° C при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту , пока его OD ₆₀₀ достигает 0,5.
   3. Добавьте 2 мкл раствора скопировать индукции для усиления внутриклеточного fosmid числа копий. Инкубируйте клетки еще в течение 3 ч при 37 ° C при встряхивании со скоростью 250 оборотов в минуту.
   4. Приготовьте 14 мл с круглым дном трубки и добавляют 1 мл культивируемых клеток (шаг 4.1.3). Добавьте соответствующий субстрат (р - нитрофенил ацетат, р -nitrophenyl- & beta ; -D-целлобиозида или фенил , фосфата) в конечной концентрации 100 мкМ.
      1. Для контроля, добавьте по 1 мл культивируемых клеток с шага 4.1.3 в 14 мл с круглым дном, добавить необходимые тот же объем PBS в объеме субстрата в стадии 4.1.4.
   5. Выдержите двух образцов при 37 ° С при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту в течение 3 часов.
   6. В то же время, подготовить машину FACS с теми же конфигурациями, как на стадии 2.3,
   7. Добавьте 5 мкл контрольного и субстрата клеток, обработанных по 5 мл круглым дном пробирки, содержащие 1 мл PBS, соответственно.
   8. Поместите пробирку, содержащую контрольные клетки на погрузочной порту устройства FACS и нажмите на кнопку Загрузить на панели управления Приобретение программного обеспечения FACS. Установите частоту событий на 1000 - 3000 событий / сек с помощью кнопок Flow Rate на приборной панели.
   9. Нажмите на кнопку Acquisition для измерения FITC-A.
   10. Заменить пробирку управления с подложкой обработанной пробы трубки. Установите частоту событий на 1000 - 3000 событий / сек с помощью кнопок Flow Rate на приборной панели.
   11. Нажмите на кнопку Acquisition для измерения FITC-A.
   12. Сравните флуоресценции двух групп клеток путем построения гистограммы числа клеток по сравнению с лог масштабируется FITC-A.
2. Другие анализы, чтобы подтвердить активность фермента
   1. Для дальнейшей идентификации отобранных кандидатов ферментов, экстракт fosmid ДНК с использованием стандартной про экстракциицедуры из коммерческих наборов экстракции и анализа нуклеотидной последовательности, или проверить активность фермента ^6,7 в пробирке.

Results

Три фенольные субстраты были рассмотрены с целью идентификации новых метагеномных ферменты из метагенома в библиотеке океанских приливов и отливов плоских осадков в Тэанской, Южная Корея, следуя предлагаемого протокола. Для строительства библиотеки, в среднем 30 - метагенома последовательности 40 кб были вставлены в fosmids, которые основаны на E. палочка F фактор репликон и представлены в виде одной копии в клетке. Обратите внимание , что fosmids широко используются для построе...

Discussion

Повышение эффективности производства биокатализаторов является ключевым для успеха био-химической промышленности , основанной ⁹ и метагенома считается одним из лучших естественных источника фермента. В этом смысле важно скрининга новых ферментов из метагенома , где большинство генетических ресурсов не были изучены ^10. Существует несколько методов отбора были разработаны , которые непосредственно обнаружить ферментные продукты с использованием активаторы транскрипции ^{11, 12} , но эти метод...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CopyControl	Epicentre	CCFOS110	Fosmid
Индукционный раствор CopyControl		Эпицентр CCIS125	Фосмид Копия индукционного раствора
EPI300	Эпицентр	EC300110	Электрокомпетентная ячейка
pCC1FOS	Эпицентр	CCFOS110	Фосмид вектор
Ген Пульсер Mxcell	Bio-Rad		Электропорационная кювета и электропоратная система
FACSAria III	Becton Dickinson		Проточная цитометрия (аппарат FACS)
AZ100M,	Микроскоп Nikon
УльтраСлим	Маэстроген		светодиодный осветитель
50 мл коническая трубка	BD Falcon
14 мл круглодонная туба	BD Falcon
5 мл туба с круглым дном	BD Falcon
p-нитрофенилфосфат	Sigma-Aldrich	N7653	Substrate
p-нитрофенил β-D-целлобиозид	Sigma-Aldrich	N5759	Substrate
p-нитрофенилбутилат	Sigma-Aldrich	N9876& НБСП;	субстрат
Luria-Bertani (LB)	BD Difco	244620	Триптон 10 г/л, Экстракт дрожжей 5 г/л, Хлорид натрия 10 г/л
Супер Оптимальный бульон (SOB)	BD Difco	244310	Триптон 20 г/л, Дрожжевой экстракт 5 г/л, Хлорид натрия 0,5 г/л, Сульфат магния 2,4 г/л, Хлорид калия 186 мг/л
Супер Оптимальный бульон с подавлением катаболитов (SOC)		SOB, 0,4 % глюкозы
2x Дрожжевой экстракт Триптон (2xYT)	BD Difco	244020	Панкреатический перевар казеина 16 г/л, Дрожжевой экстракт 10 г/л, Дрожжевой экстракт 5 г/л
Клеточная среда хранения 2x			YT бульон, 15% глицерин, 2% глюкоза
pGESS(E135K)			Вектор ДНК, содержащий dmpR, гены egfp с их соответствующими промоторами, RBS и терминатор. См. ссылку 5 в рукописи для Подробнее.
Хлорамфеникол	Sigma	C0378
Ампициллин	Sigma	A9518
BD FACSДива	Бектон Дикинсон		Проточная цитометрия версии 7.0
PBS	Gibco	70011-044	0,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,0144% Na<суб>2HPO<суб>4, 0,024% KH<суб>2ОП<суб>4, pH 7,4