Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Продвижение 3-D агрегацию FACS Очищенная тимуса эпителиальных клеток с ЕАК 16-II / EAKIIH6 самосборки гидрогеля

5.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54062

⸱

27 июня 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Cellular Therapeutics, Allegheny Health Network, 2Division of Pharmaceutical Sciences, Mylan School of Pharmacy, Duquesne University, 3Department of Biological Sciences, Carnegie Mellon University

В этой статье

Краткое содержание

Это видео демонстрирует протокол обогащения эпителиальных клеток тимуса (TEC) градиентом плотности для выделения FACS. В нем также показано использование пептидов EAK16-II/EAKIIH6 для стимулирования образования агрегатов TEC. Микроокружение гидрогеля EAK16-II/EAKIIH6 обеспечивает трехмерную конфигурацию, необходимую для поддержания выживаемости и функционирования ТЭО

.

Аннотация

Инволюция тимуса, связанная со старением или патологическими повреждениями, приводит к снижению выработки зрелых Т-клеток. Восстановление функции недостаточной тимуса имеет решающее значение для поддержания эффективного приобретенного иммунного ответа, опосредованного Т-клетками, против вторгшихся патогенов. Тем не менее, регенерация и ревитализация тимуса оказались сложной задачей, в основном из-за трудностей воспроизведения уникального трехмерного микроокружения стромы тимуса, которое имеет решающее значение для выживания и функции эпителиальных клеток тимуса (ПЭС). Мы разработали новую гидрогелевую систему для стимулирования образования агрегатов TEC, основанную на свойстве самоорганизующихся олигопептидов EAK16-II и его гистидинилированного аналога EAKIIH6. ТЭО обогащали из изолированных клеток тимуса с градиентом плотности, сортировали с помощью флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (FACS) и мечили антителами на молекуле антиэпителиальной клеточной адгезии (EpCAM), которые вместе с анти-His IgG были закреплены на белковых адапторных комплексах A/G. Образованию клеточных агрегатов способствовали путем инкубации ТЭО с олигопептидами EAKIIH6 и EAK16-II, а затем путем увеличения ионной концентрации среды для инициирования гелеобразования. Агрегаты TEC, встроенные в гидрогель EAK, могут эффективно способствовать развитию функциональных Т-клеток in vivo при трансплантации обнаженным мышам.

Введение

Тимус является первичным лимфоидной органом, ответственным за генерацию различных слоев населения патоген-реактивная, уверенных терпимы Т-клеток, имеет важное значение для функции приобретенной иммунной системы. Это динамичный орган, в котором развивающиеся тимоциты, иммигрировал из костного мозга в качестве клеток-лимфоцитов-предшественников, мигрируют через губчатую трехмерные (3-D) матрицы тимуса стромы, подвергаются LINEAGE-спецификации и дифференциации, и в конечном счете эмигрировать в зрелых Т-клеток. Успех этого хорошо запрограммированный процесс во многом зависит от перекрестных помех между мигрирующими тимоцитов и жилых тимуса эпителиальных клеток (ТИК), преобладающей популяции вилочковой стромы, которые имеют важное значение для установления и поддержания целостности вилочковой микросреды.

На основе их анатомического расположения и уникальной функции, ТЭМ можно разделить на два подмножества: ТИКи в коре (cTECs), которые являются responность за выбор собственного MHC (главный комплекс гистосовместимости) ограничено Т-клетки (положительный выбор), а ТИК в мозговом веществе (mTECs), которые необходимы для устранения аутореактивных Т-клеток (негативный отбор) 1,2. Многие факторы (например, старение, инфекции, облучение, лекарственное лечение) может вызвать необратимые повреждения тимуса эпителия, что приводит к скомпрометированных адаптивного иммунитета. Несмотря на многочисленные попытки, восстановление функции тимуса была сложной задачей из-за трудностей, чтобы воспроизвести тимуса микросреду. Следует отметить, что вилочковой трехмерные (3-D) , конфигурация имеет решающее значение для выживания и функции ТЭМ, тогда как ТЭМ культивируют в среде 2-D быстро уменьшают экспрессию генов , критических для тимопоэз 3,4.

EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK) и С-концевой histidinylated аналог EAKIIH6 (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH) имеют низкий молекулярный вес, амфифильные олигопептиды, которые растворяются в деионизованной водоснаг, но подвергаются гелеобразование с образованием бета-фибриллы при воздействии ионной силы выше, чем 20 мМ NaCl (нормальной концентрации соли в жидкости тела человека составляет 154 мм). Это свойство отзывчивым окружающей среды делает их универсальными строительными блоками для формирования 3D-структур. His-метки на EAKII-H6 обеспечивает стыковочный механизм, с помощью которого противопехотные Его IgGs / Fc-связывающий рекомбинантный белок A / G (αH6: пА / G) комплексы могут служить в качестве адаптера для закрепления белковых лекарственных средств и других биомолекул ( например, антитела) на гидрогеля композита 5-8.

Ранее мы показали , что флуоресцентные меченных молекул IgG , базирующуюся на гидрогеля может удерживаться в месте инъекции в течение до 13 дней 9. Кроме того, когда αH6: пА / G адаптеры с прикрепленные анти-CD4 IgG , были добавлены к EAK16 II / EAKIIH6 (ЕАК) гидрогеля, CD4 + Т - клетки были специально захваченный 10. Используя подобную технику, мы недавно показали, что 3-D агрегация TECS Cульд быть повышен в ЕАК гидрогеля с адаптером комплексов, несущих ПЭС-специфических анти-EpCAM антител (αH6: Pa / G: αEpCAM). Когда пересаживают под почки капсулы голых мышей, КТР кластеры , встроенные в ЕАК гидрогеля может эффективно поддерживать развитие функциональных Т - клеток в естественных условиях 11,12.

Здесь мы проиллюстрируем наш метод, чтобы быстро и эффективно очищают ТИК с сортировкой флуоресцентно активированных клеток (FACS) и генерировать 3-D TEC агрегаты с системой EAK гидрогеля.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все животные, используемые в экспериментах, были размещены в виварии в научно-исследовательском институте Allegheny-Зингера в соответствии с протоколом были рассмотрены и одобрены Institutional животных по уходу и использованию комитета / Allegheny научно-исследовательского института Allegheny Network Health певцу.

1. Переваривание тимусе коллагеназой

  1. Урожай вилочковой железы.
    1. Эвтаназии 3-5-недельных мышей C57BL6 / J в двуокиси углерода (СО 2) камеры для сбора вилочковой железы. Более подробно, поместить мышей в камере под СО 2 индукции в течение 3-5 мин и подтвердить смерть путем проверки сердца или дыхания.
    2. Положите тушу на спине и намочить тело с 70% -ным этанолом. Сделайте небольшой горизонтальный разрез с острыми, прямыми Препарационные ножницами на его животе через кожу. Потяните кожу на обоих концах (головы и ног), так что она вывернута наизнанку.
    3. Сделайте горизонтальный разрез с рассекает ножницами только подсамое низкое ребро и разрезают через диафрагму в сторону. Держа мечевидного отростка с пинцетом и вырезать середину ребер, идущих с обеих сторон. Подтяните ребра / грудину так, что тимус четко виден.
      Примечание: Тимус расположен непосредственно на вершине сердца, состоит из 2-х лепестков и белого полупрозрачного цвета.
    4. С помощью изогнутых щипцов, осторожно выкопать и вытащить тимуса лепестка от соединительной ткани и передачи в моющем растворе (см перечень материалов).
  2. Готовят пищеварение раствора путем смешивания 9 мл среды RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute среднего 1640), 0,025 мг / мл очищенного коллагеназа, 10 мМ HEPES [4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфонова кислота], и 0,2 мг / мл ДНКазы I в центрифужную пробирку на 50 мл. Хранить раствор Пищеварение в 37 ° С на водяной бане до использования.
    Примечание: Количество варочным раствором, приготовленным достаточно для пяти взрослых thymi мыши, который можно инкубировать в одном 5 мл полистирола круглодоннуюнижняя труба.
  3. Передача тимус до 60 мм ткани блюдо культуры, содержащей 5-6 мл RPMI-1640.
  4. Рассеките тимус с 28 G иглой шприца инсулина на мелкие кусочки (около 1 мм 3 кв) , чтобы позволить лимфоциты вытечь.
  5. Промыть вилочковой части с RPMI-1640, который находится в чашке Петри со стеклянной пипетки Пастера. Наклоните блюдо и пусть тимуса фрагменты оседают на дно. Медленно аспирация и отбросить RPMI-1640 супернатанта с помощью стеклянной пипетки. Повторите этот шаг, промывая 5-6 мл среды RPMI-1640, в 4-5 раз со стеклянной пипеткой до тех пор, пока раствор не станет менее прозрачным.
    Примечание: Стеклянные пипетки рекомендуется на этом этапе, так как фрагменты тимуса имеют тенденцию придерживаться пластика, что приводит к чрезмерной потере тканей тимуса. Для остальной части процедуры, использование пластиковых пипеток.
  6. После окончательной промывки, отбросить супернатант, как описано на стадии 1.5. Добавить раствор 3 мл переваривания и переносят кусочки тимуса и раствора в 5 мл с круглым дном рolystyrene трубки.
  7. Поместите пробирку на ротатор трубки и инкубировать при 37 ° С в течение 6 мин при скорости вращения 12 оборотов в минуту.
  8. После инкубации, пусть вилочковой фрагменты оседают на дно трубки под действием силы тяжести. Собирают супернатант с пипеткой Пастера и переносят в 50 мл центрифужную пробирку с 10 мл промывочного раствора. Центрифуга при 300 мкг в течение 5 мин, отбросить супернатант и клетки вновь суспендируют в растворе 10 мл промывки. Держите на льду.
  9. Повторите шаги 1.6-1.8 дважды на тимуса фрагментов в 5 мл с круглым дном полистирола трубки. Бассейн супернатант в том же 50 мл трубки.
    Примечание: Центрифугирование не является необходимым для второй и третьей промывки.
  10. После окончательного переваривания, пипеткой вверх и вниз с 2 мл пластиковой серологической пипетки, чтобы сломать оставшиеся фрагменты в трубке и передачи в центрифужную пробирку на 50 мл.
  11. Центрифуга 50 мл трубки при 300 мкг в течение 5 мин, аспирата супернатант, ресуспендируют в 10 мл промывочного Buffeг и фильтр через мкм клеточный фильтр 100. Держите на льду.

2. Обогащение ТЭМ с разрывным градиентом плотности

  1. Готовят 21% раствор градиента плотности путем смешивания 2,4 мл в градиенте плотности среды (60% вес / об иодиксанола в воде) и 9,6 мл промывочного раствора.
  2. Центрифуга диссоциированных клеток тимуса в трубке 50 мл сбора с шагом 1.11 при 300 мкг в течение 5 мин и ресуспендируют в 2,5 мл буфера для промывки.
  3. Добавьте 20 мл среды RPMI-1640 к клеточной суспензии.
  4. Заполните 12 мл 21% -ного раствора градиента плотности в 10 мл серологической пипеткой с электронным дозаторов. Поместите кончик серологической пипеткой в ​​нижней части 50-мл центрифужные пробирки, содержащие клетки, и чтобы раствор градиента плотности стечь на дно трубки под действием силы тяжести.
    1. Аккуратно выталкивать раствор градиента плотности с пипеткой, чтобы закончить генерации двух слоев различной плотности.
  5. Центрифуга при 600 мкг Foг 20 мин при комнатной температуре в качающийся-роторе. Установите скорость торможения на уровне самого медленного.
  6. Перенести верхний слой и интерфейс к новой 50 мл пробирку.
    Примечание: Большинство ТЭМ сохраняются в интерфейсе. Лимфоциты будет выпадать в осадок на дно пробирки после центрифугирования. Если эти клетки должны быть использованы для других целей, промыть осадок с помощью 20 мл промывочного раствора в течение трех раз. Ресуспендируют клеток в 10 мл буфера для промывки.
  7. Добавьте промывочный раствор до 40 мл в пробирку на шаге 2.6 и центрифуге при 400 мкг в течение 6 мин при температуре 4 ° С. Для того, чтобы удалить супернатант, аспирация с пипеткой.
  8. Повторите промывание и аспирация еще 2 раза, как описано в шаге 2.7.
  9. Ресуспендируют в 2 мл промывочного раствора и подсчета клеток с помощью гемоцитометра.

3. Разделительные ТЭМ с FACS

  1. Отрегулировать клетки от шага 2,9 при концентрации 1х10 6 клеток / 100 мкл промывочного раствора и передачиклетки в 5 мл с круглым дном трубы (полипропилен или полистирол, в соответствии с рекомендациями инструкции сортировщика потока).
  2. Добавьте 2 мкл анти-Fc IgG рецептора на 1х10 6 клеток и инкубируют при 4 ° С в течение 10 мин.
  3. Добавить анти-CD45 (1: 150 разбавление, 10 мкл на образце) и анти-EpCAM (разведение 1: 100, 10 мкл на образце) антител и инкубируют при 4 ° С в течение более 20 мин.
  4. Промывают клетки с промывочного раствора 2 мл и центрифугируют при 400 х г в течение 6 мин при температуре 4 ° С. Аспирируйте супернатант с пипеткой.
  5. Ресуспендируют клеток в 1 мл 1х фосфатно-солевым буферным раствором (PBS).
  6. Фильтруют через сито 100 мкм.
  7. Применение клеток в сортировочный инструмента. Выберите лимфоцит и TEC население за исключением самых маленьких клеток на стороне рассеянного света (SSC) / вперед рассеянного света (FSC) панели (мертвые клетки), а затем ворота на выбранной популяции для CD45- EpCAM + для сортировки 13.

4. Generation ТЭМ / EAK Совокупностей

Примечание: Выполните приготовления реагентов и действия, связанные с смесительной камере под ламинарным укрытием.

  1. Готовят пА / G адаптер комплексов путем смешивания 4 мкл анти-His-меткой IgG, 8 мкл анти-EpCAM IgG и 2,6 мкл пА / G в стерильном 1,5 мл микроцентрифужных трубки, и инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин.
  2. Отрегулировать отсортированные ТИК с шага 3,7 до 5x10 4 клеток / мл с промывочным раствором, и пипетку 100 мкл в одну лунку низкой испарительной 96-луночного круглым дном планшета для культуры ткани. Добавить 14,6 мкл адаптера комплексов пА / G к клеткам. Поместите пластину на качающейся платформе в течение 20 мин при температуре 4 ° С.
  3. Промывают один раз 200 мкл промывочного раствора. Центрифуга пластины при 400 х г в течение 6 мин. Удалите супернатант с помощью микропипетки.
  4. Промывают один раз 200 мкл 10% раствора сахарозы. Центрифуга при 400 мкг в течение 6 мин. Удалите супернатант с помощью микропипетки.
  5. Ресуспендируют клеток в 30 мкл 10% сterile раствор сахарозы на лунку.
  6. Добавьте 10 мкл EAKIIH6 (7,5 мг / мл) и инкубируют в течение 5 мин при комнатной температуре.
  7. Добавьте 20 мкл EAK16-II (10 мг / мл) к смеси TEC.
  8. Добавьте 100 мкл полной среды в системе, чтобы инициировать гелеобразование. Поместите пластину на платформе шейкере в течение 15-20 мин при комнатной температуре.
  9. Поместите пластину в инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% СО 2. Через 2-4 часа, добавить еще 100 мкл полной среды.
  10. Измените среда каждый день до использования.
    1. Отберите 100 мкл среды с поверхности без нарушения гель с использованием микропипетки и осторожно добавляют 100 мкл подогретого среды, помещая кончик пипетки к стенке скважины.

5. Характеристика ТИК / EAK Совокупностей

  1. Чтобы проверить функцию TEC / EAK агрегатов в естественных условиях, собрать TEC / EAK гидрогель после O / N культуры и пересадки под почечную капсулу бестимусных обнаженноймыши, используя ранее описанную процедуру 11,14.
  2. Контроль за развитие Т-клеток на периферии путем сбора 50-100 мкл пробы крови в ЭДТА-содержащие пробирки для сбора крови из голых мышей через 4-6 недель после трансплантации и пятна с коктейлем анти-CD4, -CD8, -CD45 и -CD3 антитела 12.
  3. Проанализировать процент Т-лимфоцитов в периферической крови лейкоцитов с проточной цитометрии (FCM), с помощью программного обеспечения для анализа одноклеточ- 12.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для изучения эффективности использования протокола градиента плотности разделения для обогащения стромальных клеток CD45-, клетки, полученные как из интерфейса и осажденных лимфоцитах гранул окрашивали анти-CD45 и анти-EpCAM антител. Оба анти-Улекс Europaeus Agglutinin 1 (UEA1) и антитела анти-МНС класса II, также были включены в окрашивании коктейль для дальнейшей идентификации подмножества CTEC и Mtec. Как показано на рисунке 1, мы смогли достичь обычно близко к 15-20 ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В то время как ТЭМ являются преобладающими популяция вилочковой стромы и играют существенную роль для структуры и функции тимуса желез, они составляют лишь около 0,1-0,5% от общего тимуса клеточности. Они также являются хрупкими клетки , как высокий процент гибели клеток изредка наблюдаются следующие коллагеназы, то есть лечение , чтобы диссоциировать из ТИК внеклеточного матрикса (ЕСМ). Их редкость (~ 200 000 за тимуса мыши) и хрупкость сделал это сложная задача, чтобы изолировать ТИК. Недавнее использование в...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана Национальным институтом здравоохранения грантов R21 AI113000 (WSM) и R01 AI123392 (YF).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
TEC Isolation
70% EthanolDecon Laboratories2701(1 галлон)Ethanol 200 Proof, ножницы для препарирования деионизированной водой
, прямыеFine Science Tools, Inc.91460-11
Щипцы Грефе, прямые FineScience Tools, Inc.11053-10
Щипцы Грефе, изогнутыеFine Science Tools, Inc.11052-10
для стирки1x PBS, 0,1% BSA, 2  mM EDTA
1x PBS (Фосфатно-солевой буфер)Gibco10010-023
BSA (Бычий сывороточный альбумин)SigmaA1470-100G
EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота)Invitrogen15575-038
Раствор9 мл RPMI-1640, 0,025  мг/мл Либераза ТМ Исследовательский класс, 10  mM HEPES, 0,2  мг/мл DNaseI
RPMI-1640Gibco11879-020
Liberase TM Research GradeRoche 05 401 127 001именуется "очищенная коллагеназа"
1  M HEPESLonza17-737E
Dnase IRoche10 104 159 001
50  мл Центрифужная пробиркаCorning430290
60  мм чашка для культуры тканейFalcon353002
1/2  cc U-100 Инсулиновый шприц 28  1/2  ГБектон Дикинсон329461
5  мл Трубка полистирольная круглодонная Falcon352058
5  мл стеклянная пипеткаFisher Healthcare13-678-27EИспользуйте для промывания фрагментов тимуса. Фрагменты тимуса имеют свойство прилипать к стенке с помощью пластиковых пипеток.
Вращатель трубок MACSmixMiltenyi130-090-753
100  &микро; m Фильтр для ячеекFalcon352360
Градиент плотности среды: OptiPrepAxis-Shield
Cell Sorting
5  мл Полипропиленовая трубка с круглым дномFalcon352063
Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block)BD Biosciences553142Использовать в неразбавленном виде, 2  &микро; л на образец
Антимышиный CD45-PercpCy5.5eBioscience45-0451-80Использование в 1:150, 10  &микро; l на образец
Anti-mouse CD326 (EpCAM)-PEeBioscience12-5791-82Использование в 1:100, 10  &микро; l на образец
BD InfluxBD Biosciences
Программное обеспечение для анализа одиночных клетокFlowJo
EAK Gel Assembly
Anti-His-TagAnaSpec29673"anti-His-Tag IgG"
Очищенный анти-мышь CD326 (EpCAM)BioLegend118202"anti-EpCAM IgG"
Рекомбинантный белок A/GPierce Biotechnology
1.5  ml Safe-Lock Tubes, Biopur, SterileFisher Healthcare05-402-24Bпод названием "1.5  мл микроцентрифужная пробирка
"96-лунка, тарелка для культуры тканей, круглое дно с крышкой с низким уровнем испаренияBD Falcon353917
Качающаяся платформа: Nutator Mixer No.1105BD Clay Adams
10% сахарозаSigmaS0389Готовится со стерильной дистиллированной водой
EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKAK-CONH2)Американская пептидная компания& НБСП;пользовательский синтезированный, 10  мг/мл
EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAAKHHHHHH-CONH2)American Peptide Company пользовательский синтезированный, 7.5  мг/мл
Полная средаRPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-глутамин, 1% NEAA, 5  mM HEPES, 50  &микро; M 2-меркаптоэтанол
RPMI-1640Gibco11879-020
FBS (фетальная бычья сыворотка)Atlanta BiologicalsS11150Термическая инактивация перед использованием
Pen/StrepGibco15140-122
L-глютамин 200  mM (100x)Gibco25030-081
NEAA (заменимая аминокислота) 100xGibco11140-050
1  M HEPESBioWhittaker17-737E
2-меркаптоэтанол (100x)MilliporeES-007-E
Шейкер платформы: Танцовщица животаStovall Life Sciences Inc.модель: USBDbo
Раствор для дифференцирования

Ссылки

  1. Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
  2. Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
  3. Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
  4. Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
  5. Fung, S. Y., Yang, H., Chen, P. Formation of colloidal suspension of hydrophobic compounds with an amphiphilic self-assembling peptide. Colloids Surf B Biointerfaces. 55, 200-211 (2007).
  6. Jun, S., et al. Self-assembly of the ionic peptide EAK16: the effect of charge distributions on self-assembly. Biophys J. 87, 1249-1259 (2004).
  7. Saunders, M. J., et al. Engineering fluorogen activating proteins into self-assembling materials. Bioconjug Chem. 24, 803-810 (2013).
  8. Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc of the Natl Acad Sci U S A. 90, 3334-3338 (1993).
  9. Wen, Y., et al. Coassembly of amphiphilic peptide EAK16-II with histidinylated analogues and implications for functionalization of beta-sheet fibrils in vivo. Biomaterials. 35, 5196-5205 (2014).
  10. Zheng, Y., et al. A peptide-based material platform for displaying antibodies to engage T cells. Biomaterials. 32, 249-257 (2011).
  11. Tajima, A., et al. Bioengineering mini functional thymic units with EAK16-II/EAKIIH6 self-assembling hydrogel. Clin Immunol. 160, 82-89 (2015).
  12. Fan, Y., et al. Bioengineering Thymus Organoids to Restore Thymic Function and Induce Donor-Specific Immune Tolerance to Allografts. Mol Ther. 23, 1262-1277 (2015).
  13. Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
  14. Fan, Y., et al. Compromised central tolerance of ICA69 induces multiple organ autoimmunity. J Autoimmun. 53, 10-25 (2014).
  15. Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
  16. Williams, K. M., et al. Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury. Clin Transl Sci. 2, 279-285 (2009).
  17. McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis. J Immunol Methods. 367, 85-94 (2011).
  18. Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol methods. 385, 23-34 (2012).
  19. Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells. J Vis Exp. , e51780(2014).
  20. Graham, J. M. Separation of monocytes from whole human blood. ScientificWorldJournal. 2, 1540-1543 (2002).
  21. Li, X., Donowitz, M. Fractionation of subcellular membrane vesicles of epithelial and nonepithelial cells by OptiPrep density gradient ultracentrifugation. Methods Mol Biol. 440, 97-110 (2008).
  22. Mita, A., et al. Purification method using iodixanol (OptiPrep)-based density gradient significantly reduces cytokine chemokine production from human islet preparations, leading to prolonged beta-cell survival during pretransplantation culture. Transplant Proc. 41, 314-315 (2009).
  23. Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).
  24. Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annu Rev Immunol. 24, 571-606 (2006).
  25. St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Sci Rep. 3, 1860(2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

FACSEAKA GEpCAM
Продвижение 3-D агрегацию FACS Очищенная тимуса эпителиальных клеток с ЕАК 16-II / EAKIIH6 самосборки гидрогеля
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.