Методическая статья

Быстрая проверка Терминаторов Используя ПГР-голубой плазмид и Золотые ворота в сборе

DOI:

10.3791/54064

⸱

25 апреля 2016 г.

 ,  , 
1Department of Biology, Ouachita Baptist University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол использует сборку Golden Gate и плазмиду pGR-blue для быстрой количественной оценки прочности терминаторов, обнаруженных in silico.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цель этого протокола — обеспечить быструю верификацию биоинформатически идентифицированных терминаторов. Кроме того, плазмида (pGR-Blue) разработана специально для этого протокола и позволяет количественно оценить эффективность терминатора. В качестве доказательства концепции шесть терминаторов были биоинформатически идентифицированы в микобактериофаге Bernal13. После идентификации терминаторы были изготовлены в виде олигонуклеотидов с соответствующими липкими концами и отожжены вместе. С помощью сборки Golden Gate Assembly (GGA) терминаторы были клонированы в pGR-Blue. В видимом свете ложноположительные колонии кажутся синими, а положительно преобразованные колонии — белыми/желтыми. После индукции индуцируемого арабинозой промотора (pBad) с арабинозой силу колонии можно определить путем измерения отношения производимого зеленого флуоресцентного белка (GFP) к производимому красному флуоресцентному белку (RFP). С помощью pGR-Blue протокол может быть завершен всего за три дня и идеально подходит для образовательных учреждений. Кроме того, результаты показывают, что этот протокол полезен в качестве средства для понимания in silico предсказаний эффективности терминатора, связанной с регуляцией транскрипции.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Крупные проекты в области синтетической биологии требуют использования высокоэффективных терминаторов транскрипции для регулирования экспрессии генов. Идентификация новых терминаторов требует биоинформатического анализа новых геномов. Однако по мере того, как разрабатывается все больше биоинформационных программ, каждое из которых имеет уникальный алгоритм, используемый для прогнозирования, возникает все большее расхождение между предполагаемыми результатами. Поскольку этот процесс в некоторой степени субъективен и выполняется in silico, эти прогнозы нуждаются в биологическом подтверждении. 1 Кроме того, объем предполагаемых терминаторов, выявленных с помощью анализа in silico, требует использования стратегий клонирования, которые могут быть завершены в относительно короткие сроки.

Плазмида PGR-Blue является модификацией плазмиды PGR, которая была переработана для использования сборки Golden Gate (GGA) для упрощения процедуры клонирования, позволяя одновременно выполнять все этапы реакции в одной микроцентрифужной пробирке. 2,3 Выбор цвета был включен в плазмиду для облегчения идентификации положительных колоний. Успешное лигирование должно быть белым/желтым в видимом свете и флуоресцировать зеленым под синим (450 нм) или ультрафиолетовым (УФ) светом при выращивании на пластинах, содержащих арабинозу. Поскольку неразрезанный pGR-blue содержит синий хромобелок (amilCP), колонии, содержащие немодифицированную плазмиду, становятся синими в видимом свете. Это упрощение вместе с оптимизированным протоколом позволяет исследователям перейти от биоинформатической идентификации к биологическому подтверждению за три-четыре дня. Конструктивный характер этой системы может быть полезен как в исследовательской лаборатории, так и в образовательных учреждениях.

Плазмида pGR-Blue позволяет количественно оценить силу терминатора. 4 Один индуцируемый арабинозой промотор используется для получения зеленого флуоресцентного белка (GFP) и красного флуоресцентного белка (RFP). Терминатор клонируется в плазмиду после последовательности GFP, но до последовательности RFP, тем самым останавливая транскрипцию белка RFP. Прочность терминатора определяется отношением произведенного GFP к произведенному RFP.

В отчете Vision andChange 5 предлагается, чтобы образование в области науки, технологий, инженерии и математики (STEM) включало в учебный процесс опыт, основанный на исследованиях. 6 Однако это требует разработки протоколов, которые могут быть выполнены учащимися с ограниченными навыками в определенные временные рамки. Несмотря на то, что протокол может быть выполнен всего за три дня, он также был разработан таким образом, чтобы каждый крупный шаг мог быть выполнен в отдельном еженедельном (2-3 часа) лабораторном периоде для создания исследовательского опыта курса (CRE). При таком использовании процедура займет от трех до шести недель и подходит как для вводных, так и для продвинутых курсов по генетике, клеточной биологии или биоинформатике.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Проектирование и заказа олигонуклеотиды с Соответствующих липкими концами

  1. Выявление потенциальных Rho-независимого терминатора путем геномного анализа с помощью программ, которые свободно доступны в Интернете. 7
  2. При работе с двухцепочечной ДНК, определяют ориентацию терминатора быть испытанным. 7 ГПР-Blue плазмиду только проверяет терминаторы лигируют в 5' - 3 'направлении сверху (вперед цепь).
    1. Преобразование нижней (обратный) нити терминатор к его обращенно дополнения переориентировать последовательность для тестирования в ПГР-голубым цветом с помощью бесплатного программного обеспечения, например, APE.
  3. После того, как ориентация определяется правильным, добавьте липкий конец "5'-CGAC-3 '" с 5'-конца верхней нити. Добавьте липкий конец "5'-CCGC-3 '" до 5' конца нижней нити. 8 Это гарантирует , что сшита вставка будет вставлена ​​в соответствующийОриентировка с помощью GGA.
  4. После того, как последовательности определяются, порядок, как одноцепочечными олигонуклеотидами на коммерческой основе.

2. Отжиг олигонуклеотиды (Относится только к сублимационной сушке ДНК)

  1. Повторное приостановить отдельные олигонуклеотиды в нуклеазная свободной воде до концентрации 100 мкМ.
  2. Сделать 10x отжига буфер: 1 М NaCl и 100 мМ Трис-HCl, рН 7,4. Отжиг буфер можно хранить при температуре 4 ° С в течение нескольких недель. После отжига буфер выполнен и олигонуклеотиды ресуспендировали, начинают отжиг 8.
  3. Для каждого терминатора быть испытанным, добавить 16 мкл сверхчистой воды до 1,5 мл трубки микроцентрифужных.
  4. Добавляют 2 мкл 10х отжига буфера в каждую пробирку микроцентрифужных.
  5. Добавить 1 мкл верхней нити олигонуклеотида (100 мкМ), от желаемого терминатора.
  6. Добавить 1 мкл нижней ветви олигонуклеотида (100 мкМ), от желаемого терминатора.
  7. Создание кипящему ба водый с использованием 1000 мл химический стакан, содержащий приблизительно 400 мл водопроводной воды и места на горячей плите.
  8. Поместите трубки микроцентрифужных с шага 2.6 в поплавком и кипятят в течение 4 мин. Через 4 мин, выключить плиту тепла , но оставить трубку и плавать в водяной бане медленно охлаждаться O / N (18 ч) 8. Храните отожженном терминаторов при -20 ° С.

3. Золотые ворота в сборе (Standard Mix - экономически эффективное)

  1. Сделать 40 нМ разведение отожженных терминаторов. Добавьте 124 мкл нуклеазы свободной воды в 1 мкл отожженной терминаторы смеси (100 мкМ).
    1. Центрифуга образцов в течение 30 сек при 10000 XG и хранить на льду.
  2. В настоящее время используется новая труба подходит для амплификатора, добавьте 6 мкл нуклеазы свободной воды.
  3. Добавить 1 мкл ДНК - лигазы коммерческий буфер [300 мМ Трис-HCl (рН 7,7-7,8), 100 мМ MgCl 2, 100 мМ DTT и 10 мМ АТФ]. Выполнить все последующие шаги на льду.
  4. Добавить1 мкл ПГР-Blue (35-50 нг / мкл) плазмиды назначения в микроцентрифужных трубки.
  5. Добавить 1 мкл 40 нМ отожженных терминаторов в микроцентрифужных трубки.
  6. Добавить 0,5 мкл коммерчески высокоточный BsaI Рестриктна в микроцентрифужных трубки.
  7. Добавить 0,5 мкл коммерческого ДНК-лигазы в микроцентрифужных трубки.
  8. Центрифуга реакционной смеси при 10000 х г в течение 120 сек. Затем поместите трубку непосредственно в амплификатор.
  9. Запуск программы амплификатора: 20 циклов: 1 мин при 37 ° С, а затем 1 мин при 16 ° С, а затем 1 цикл 15 мин при 37 ° С. Используйте образцы сразу или заморозить и хранить при температуре -20 ° C. 8

4. Золотые ворота в сборе (Commercial Master Mix - Время Эффективное)

  1. Добавьте 124 мкл нуклеазы свободной воды в 1 мкл 100 мкМ отожженных терминаторы, созданный на шаге 2. Это разбавляет концентрацию ДНК терминатора до 40 нм.Выполните этот шаг в новом, маркированы 1,5 мл микроцентрифужных трубку.
  2. В новую пробирку, подходящей для амплификатора, добавить 14 мкл нуклеазы свободной воды. Убедитесь, что новая трубка обозначена соответствующим образом.
  3. Добавьте 2 мкл Commercial Master Mix буфера в микроцентрифужных трубки.
  4. Добавляют 1 мкл ПГР-голубой плазмиды (35-50 нг / мкл) в микроцентрифужных трубки.
  5. Добавьте 2 мкл 40 нМ отожженных терминаторов в микроцентрифужных трубки.
  6. Добавить 1 мкл Commercial Master Mix в микроцентрифужных трубки.
  7. Центрифуга 40 нм трубки при 10000 мкг в течение 120 сек. Затем поместите трубку непосредственно в амплификатор.
  8. Запуск программы амплификатора: 1 цикл 60 мин при 37 ° С, а затем 1 цикл 15 мин при 55 ° С. Используйте образцы сразу или заморозить и хранить при температуре -20 ° C.

5. Трансформация и отбор колоний

  1. Подготовьте Лурия Base (LB) агар чашки Петри, содержащих 1 мМ Концентратион ампициллин (Amp) и 10 мМ концентрация арабинозы (АРБ). Приготовьте по меньшей мере , 10 мл 1 M L -арабинозы маточного раствора , так как этот раствор будет использоваться на последующих этапах.
  2. Используйте любой высокоэффективное (10 8 - 10 9 трансформантов / мкг) химически компетентную E. палочки (JM109) клетки для трансформации. 9 Для достижения наилучших результатов, добавьте 3-5 мкл реакции лигирования в 50 мкл компетентных клеток. При использовании химических компетентных клеток, следовать протоколу преобразования, специфичные для используемого клетки.
  3. Намажьте половину (25 мкл) трансформированных клеток на предварительно подогретой LB (АМФ / АРБ) агаром с использованием стерильного L-образный "хоккейной клюшки" и инкубировать O / N при 37 ° С. В связи с высокой скоростью к ампициллину в декомпозиции, не инкубировать при 37 ° С в течение 24 часов.
  4. Выполнить отбор колонии на основе цвета путем визуального осмотра. Успешный лигирование должен быть белый / желтый в видимом свете и флуоресцирует зеленый недеформированнойг-синий (450 нм) или ультрафиолетового света. Неудачная лигирования будет производить колонии, которое синего цвета под видимым светом после 18 - 20 часов.

6. Проверка и Количественное Терминатор

  1. Приготовьте 5 мл стерильного LB-бульоне пробирки с 1 мМ ампициллина и 10 мМ арабинозы. Число труб, необходимых зависит от количества терминаторов проходит испытания плюс контрольной группе (клетки с устойчивость к ампициллину, которые не флуоресцируют и клеток, содержащих режиссерский PGR-Blue плазмиды).
  2. Под видимым светом выбрать 2-3 белый / желтые колонии (шаг 5.4), используя стерильную петлю. Разрешить образцы для инкубирования в бульонах на шейкере при 37 ° С и 160 оборотах в минуту в течение 16-18 часов. Не инкубировать эти образцы в течение более 24 часов.
    1. Необязательно использовать спектрофотометр для определения плотности оптической ячейки при 600 нм (OD 600) для обеспечения адекватного роста клеток. Как правило, OD 600 ~ 0.8-1.0 наблюдается через 16-18 ч роста.
  3. использованиестерильный 96-луночный планшет для остальных этапов. Провести эти шаги в асептических условиях и в трех экземплярах. Добавьте 199 мкл стерильного LB + Amp / арабинозы бульона (1 мМ ампициллина / 10 мМ арабинозы) в каждую лунку. Включите номер на пластине для трех отдельных элементов управления.
    1. Используйте следующие три элемента управления: только хорошо (1), содержащий LB + Amp / арабинозы бульон и хорошо (2) для нетрансформированных компетентные клетки (пустой), чтобы служить в качестве заготовки. Для количественной оценки (3) прочности терминатора, клетки, содержащие режиссерский оригинальный ГПР или содержащий ГПР-Blue лигирован с непостоянным истекающий последовательности должны быть включены (управления заданием для количественной оценки). На рисунке 1 макета планшет - ридер.
  4. Пипеткой 1 мкл раствора клетки из O / N бульоны в отдельные лунки 96-луночного планшета.
  5. Уплотнительные пластины с воздухопроницаемой крышкой и встряхивают в течение 18-20 ч при 37 ° С и 160 оборотов в минуту.
  6. С помощью планшет - ридера, определить OD 600 путем считыванияОптическую плотность при 600 нм. Мера флуоресценции GFP следующим образом : 395 возбуждения и эмиссии 509. Мера RFP флуоресценции следующим образом : возбуждение 575 и излучение 605. После 18-20 ч, оптическая плотность 600 должна составлять приблизительно 0,5.
  7. Для нормализации для изменения роста, использовать уравнение: figure-protocol-1 как для GFP и RFP.
  8. После нормализации, определить относительную силу терминатор с помощью уравнения figure-protocol-2

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол будет производить клетки , содержащие ПГР-синего цвета с терминатором лигированы между GFP и RFP с использованием Golden Gate в сборе (рис 2). Положительные колонии, содержащие вставку лигировали могут быть выбраны на основе цвета. В видимом свете положительные колонии будет белый / желтый и ложных срабатываний будет производить голубые колонии после 18-20 ч инкубации при 37 ° С (рисунок 3).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наиболее важным шагом в этом протоколе является правильная разработка олигонуклеотид перед заказом. Олигонуклеотиды должны иметь соответствующие липкие концы добавлены к концам 5'как на верхней и нижней нити, чтобы гарантировать, что GGA включение возможно. Кроме того, важно, чтобы переключить ориентацию слева перед терминатор (терминаторов, которые останавливают транскрипцию на нижней ветви), что и справа, обращенной (прекращает транскрипцию на верхней нити) терминаторы, потому что экспрессия GFP и RFP находится в ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы признать Малькольм Кэмпбелл и Тодд Eckdahl с Genome Consortium для активного обучения (GCAT) и Альянса HHMI-научного образования - фага Hunters Выросшие Genomics и эволюционная наука программы (SEA-фагов).

Этот проект был поддержан грантами от Национального центра исследовательских ресурсов (P20RR016460) и Национального института общих медицинских наук (P20GM103429) из Национальных институтов здравоохранения. Это исследование было поддержано частично Национальным научным фондом в рамках гранта # IIA-1457888. Кроме того, институциональные (Ouachita Baptist University) средства были предоставлены через JD Patterson Summer Research Fellowship.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
pGR-Blue PlasmidAddgene68374
pGR-PlasmidAddgene46002
AeraSeal-(Стерильные листы)Excel ScientificBS-25Стерильные листы только
10x T4 DNA Ligase BufferNEB
BsaI-HFNEBR3535SФермент без HF будет работать, но менее термостабилен.
NEB Golden Gate Assembly MixNEBE1600SCommerial Master Mix упоминается в протоколе.
T4 ДНК-лигазаNEBM0202S
Круглая микроцентрифуга плавающая стойкаNova Tech InternationalF18875-6401
Ампициллина натриевая сольSigma AldrichA9518
L-(+)-ArabinoseSigma AldrichA-3256D-Arabinose не будет индуцировать промотор pBAD
Основание Лурии (LB) - Бульон, МиллерSigma AldrichL1900
Luria Base (LB) - Агар, МиллерСигма ОлдричL2025
Tecan-Infinite M200 Считыватель пластинTecan
Mix & Go Competent Cells - Штамм JM109Zymo ResearchT3005Используйте рекомендованный компанией протокол трансформации
ApE: Программное обеспечение для редактирования плазмидhttp://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/
Tris-HCl, Molecular GradePromegaH5121
Sodium Chloride (Кристаллический/Биологический, Сертифицированный)Fisher ChemicalS671
Коммерциальный олигонуклеотидный синтезIntegrated DNA Technologies (IDT)http://www.idtdna.com/site
Микротест Тканевые Культуральные Планшеты - 96 лунок (Стерильный)Falcon35-3072
микобактериофаг "Bernal13"ГенбанкKJ510413
Нуклеазная свободная водаИнтегрированные технологии ДНК (IDT)IDT004
Стерильный, L-образный Hockey-Stick CellLife Science Products6444-S1
Nano-drop 2000c UV-Vis спектрометрThermo Scientific2000c
ARНолд: веб-инструмент для прогнозирования Rho-независимых терминаторов транскрипции.
http://rna.igmors.u-psud.fr/

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, J., Zhang, Y. Relationship between promoter sequence and its strength in gene expression. Eur Phys J E Soft Matter. 37 (9), (2014).
  2. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), e3647(2008).
  3. Lampropoulos, A., et al. GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis. PLoS One. 8 (12), e83043(2013).
  4. Chen, Y. J., et al. Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints. Nat Methods. 10 (7), 659-664 (2013).
  5. Woodin, T., Carter, V. C., Fletcher, L. Vision and change in biology undergraduate education, a call for action--initial responses. CBE Life Sci Educ. 9 (2), 71-73 (2010).
  6. Vasaly, H. L., Feser, J., Lettrich, M. D., Correa, K., Denniston, K. J. Vision and change in the biology community: snapshots of change. CBE Life Sci Educ. 13 (1), 16-20 (2014).
  7. Naville, M., Ghuillot-Gaudeffroy, A., Marchais, A., Gautheret, D. ARNold: a web tool for the prediction of Rho-independent transcription terminators. RNA Biol. 8 (1), 11-13 (2011).
  8. Campbell, A. M., et al. pClone: Synthetic Biology Tool Makes Promoter Research Accessible to Beginning Biology Students. CBE Life Sci Educ. 13 (2), 285-296 (2014).
  9. Rhee, J. I., et al. Influence of the medium composition and plasmid combination on the growth of recombinant Escherichia coli JM109 and on the production of the fusion protein EcoRI::SPA. J Biotechnol. 55 (2), 69-83 (1997).
  10. Dirla, S., Chien, J. Y., Schleif, R. Constitutive mutations in the Escherichia coli AraC protein. J Bacteriol. 191 (8), 2668-2674 (2009).
  11. Schleif, R. Regulation of the L-arabinose operon of Escherichia coli. Trends Genet. 16 (12), 559-565 (2000).
  12. Kosuri, S., et al. Composability of regulatory sequences controlling transcription and translation in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 14024-14029 (2013).
  13. Sharon, E., et al. Inferring gene regulatory logic from high-throughput measurements of thousands of systematically designed promoters. Nat Biotechnol. 30 (6), 521-530 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

GFP RFP

Похожие статьи