Этот протокол использует сборку Golden Gate и плазмиду pGR-blue для быстрой количественной оценки прочности терминаторов, обнаруженных in silico.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Быстрая проверка Терминаторов Используя ПГР-голубой плазмид и Золотые ворота в сборе
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Цель этого протокола — обеспечить быструю верификацию биоинформатически идентифицированных терминаторов. Кроме того, плазмида (pGR-Blue) разработана специально для этого протокола и позволяет количественно оценить эффективность терминатора. В качестве доказательства концепции шесть терминаторов были биоинформатически идентифицированы в микобактериофаге Bernal13. После идентификации терминаторы были изготовлены в виде олигонуклеотидов с соответствующими липкими концами и отожжены вместе. С помощью сборки Golden Gate Assembly (GGA) терминаторы были клонированы в pGR-Blue. В видимом свете ложноположительные колонии кажутся синими, а положительно преобразованные колонии — белыми/желтыми. После индукции индуцируемого арабинозой промотора (pBad) с арабинозой силу колонии можно определить путем измерения отношения производимого зеленого флуоресцентного белка (GFP) к производимому красному флуоресцентному белку (RFP). С помощью pGR-Blue протокол может быть завершен всего за три дня и идеально подходит для образовательных учреждений. Кроме того, результаты показывают, что этот протокол полезен в качестве средства для понимания in silico предсказаний эффективности терминатора, связанной с регуляцией транскрипции.
Введение
Крупные проекты в области синтетической биологии требуют использования высокоэффективных терминаторов транскрипции для регулирования экспрессии генов. Идентификация новых терминаторов требует биоинформатического анализа новых геномов. Однако по мере того, как разрабатывается все больше биоинформационных программ, каждое из которых имеет уникальный алгоритм, используемый для прогнозирования, возникает все большее расхождение между предполагаемыми результатами. Поскольку этот процесс в некоторой степени субъективен и выполняется in silico, эти прогнозы нуждаются в биологическом подтверждении. 1 Кроме того, объем предполагаемых терминаторов, выявленны....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Проектирование и заказа олигонуклеотиды с Соответствующих липкими концами
- Выявление потенциальных Rho-независимого терминатора путем геномного анализа с помощью программ, которые свободно доступны в Интернете. 7
- При работе с двухцепочечной ДНК, определяют ориентацию терминатора быть испытанным. 7 ГПР-Blue плазмиду только проверяет терминаторы лигируют в 5' - 3 'направлении сверху (вперед цепь).
- Преобразование нижней (обратный) нити терминатор к его обращенно дополнения переориентировать последовательность для тестирования в ПГР-голубым цветом с помощью бесплатного программного обеспечения, например,
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Этот протокол будет производить клетки , содержащие ПГР-синего цвета с терминатором лигированы между GFP и RFP с использованием Golden Gate в сборе (рис 2). Положительные колонии, содержащие вставку лигировали могут быть выбраны на основе цвета. В видимом свете положительные колонии будет белый / желтый и ложных срабатываний будет производить голубые колонии после 18-20 ч инкубации при 37 ° С (рисунок 3).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Наиболее важным шагом в этом протоколе является правильная разработка олигонуклеотид перед заказом. Олигонуклеотиды должны иметь соответствующие липкие концы добавлены к концам 5'как на верхней и нижней нити, чтобы гарантировать, что GGA включение возможно. Кроме того, важно, чтобы переключить ориентацию слева перед терминатор (терминаторов, которые останавливают транскрипцию на нижней ветви), что и справа, обращенной (прекращает транскрипцию на верхней нити) терминаторы, потому что экспрессия GFP и RFP находится в .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Авторы хотели бы признать Малькольм Кэмпбелл и Тодд Eckdahl с Genome Consortium для активного обучения (GCAT) и Альянса HHMI-научного образования - фага Hunters Выросшие Genomics и эволюционная наука программы (SEA-фагов).
Этот проект был поддержан грантами от Национального центра исследовательских ресурсов (P20RR016460) и Национального института общих медицинских наук (P20GM103429) из Национальных институтов здравоохранения. Это исследование было поддержано частично Национальным научным фондом в рамках гранта # IIA-1457888. Кроме того, институциональные (Ouachita Baptist University) средства были предост....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| pGR-Blue Plasmid | Addgene | 68374 | |
| pGR-Plasmid | Addgene | 46002 | |
| AeraSeal-(Стерильные листы) | Excel Scientific | BS-25 | Стерильные листы только |
| 10x T4 DNA Ligase Buffer | NEB | ||
| BsaI-HF | NEB | R3535S | Фермент без HF будет работать, но менее термостабилен. |
| NEB Golden Gate Assembly Mix | NEB | E1600S | Commerial Master Mix упоминается в протоколе. |
| T4 ДНК-лигаза | NEB | M0202S | |
| Круглая микроцентрифуга плавающая стойка | Nova Tech International | F18875-6401 | |
| Ампициллина натриевая соль | Sigma Aldrich | A9518 | |
| L-(+)-Arabinose | Sigma Aldrich | A-3256 | D-Arabinose не будет индуцировать промотор pBAD |
| Основание Лурии (LB) - Бульон, Миллер | Sigma Aldrich | L1900 | |
| Luria Base (LB) - Агар, Миллер | Сигма Олдрич | L2025 | |
| Tecan-Infinite M200 Считыватель пластин | Tecan | ||
| Mix & Go Competent Cells - Штамм JM109 | Zymo Research | T3005 | Используйте рекомендованный компанией протокол трансформации |
| ApE: Программное обеспечение для редактирования плазмид | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ | ||
| Tris-HCl, Molecular Grade | Promega | H5121 | |
| Sodium Chloride (Кристаллический/Биологический, Сертифицированный) | Fisher Chemical | S671 | |
| Коммерциальный олигонуклеотидный синтез | Integrated DNA Technologies (IDT) | http://www.idtdna.com/site | |
| Микротест Тканевые Культуральные Планшеты - 96 лунок (Стерильный) | Falcon | 35-3072 | |
| микобактериофаг "Bernal13" | Генбанк | KJ510413 | |
| Нуклеазная свободная вода | Интегрированные технологии ДНК (IDT) | IDT004 | |
| Стерильный, L-образный Hockey-Stick Cell | Life Science Products | 6444-S1 | |
| Nano-drop 2000c UV-Vis спектрометр | Thermo Scientific | 2000c | |
| ARНолд: веб-инструмент для прогнозирования Rho-независимых терминаторов транскрипции. |
Ссылки
- Li, J., Zhang, Y. Relationship between promoter sequence and its strength in gene expression. Eur Phys J E Soft Matter. 37 (9), (2014).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
