В этом протоколе, мы приводим процедуры создания Миотоническая дистрофия 1 миобластов моделей, в том числе оптимизированного обслуживания С2С12 клеток, генной трансфекции / трансдукции и миоцитов дифференциации.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Моделирование миотонической дистрофии 1 в C2C12 миобластов клеток
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Миотоническая дистрофия 1 (DM1) является распространенной формой мышечной дистрофии. Хотя некоторые модели на животных были установлены для DM1, миобластов модели клеток по-прежнему важны, поскольку они обеспечивают эффективную клеточную альтернативу для изучения клеточных и молекулярных событий. Хотя клетки миобластов С2С12 широко используется для изучения миогенез, устойчивость к трансфекции генов или вирусной трансдукции, затрудняет исследование в клетках С2С12. Здесь мы опишем оптимизированный протокол, который включает в себя ежедневное техническое обслуживание, Трансфекция и трансдукции процедуры для введения генов в С2С12 миобластов и индукции дифференцировки кардиомиоцитов. Итак, эти процедуры позволяют наилучшие эффективности трансфекции / трансдукции, а также последовательные результаты дифференциации. Протокол, описанный в создании моделей DM1 миобластов клеток пойдет на пользу изучение миотоническая дистрофии, а также других мышечных заболеваний.
Введение
Миотоническая дистрофия (DM) является аутосомно - доминантным заболеванием , которое затрагивает несколько систем, наиболее особенно сердечной и скелетных мышц 1. Есть два подтипа этого заболевания, DM1 и DM2. DM1 является более распространенным и имеет более тяжелое проявление чем СД2 2. Генетическая мутация , лежащая в основе DM1 является расширением CUG триплетных повторов , расположенных в нетранслируемой области 3 '(УТР) ДМ гена протеинкиназы (ДМПК) 3. Число ЗГП повтора в непораженных особей колеблется от 5 до 37. В отличие от этого , она возрастает до более чем 50, а иногда и до тысяч у больных DM1 4. В результате....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. C2C12 Культура клеток
- Поддержание С2С12 миобластов мыши в 100 мм пластины в ростовой среде (среда Игла в модификации Игла (DMEM),), дополненной 20% эмбриональной бычьей сыворотки, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 2 мМ L-глутамина. Разрешить C2C12 пассированные клетки становятся примерно 50 - 60% сплошности.
- Выбросите среду для роста и промыть клетки С2С12 с 3 мл при комнатной температуре фосфатно-буферном солевом растворе (PBS). Удалите PBS и добавляют 500 мкл 0,25% трипсин-ЭДТА для открепления клеток. Поместите пластинку в 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе в течение 3 - 5 мин.
- Нейтрализовать трипсина путем д....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Клетки C2C12 трансфицировали GFP-CUG5 или GFP-CUG200. После выбора лекарственной устойчивости, были созданы стабильные бассейны, которые могут быть визуализированы с помощью экспрессии GFP (Фигура 1А). Формирование Myotube в дифференцированных миобластов была обнаружена тяжелой цепи миозина иммунным окрашиванием 10 (Фигура 1В). Количественное myotube формирования показали , что показатели слитые снизились с 35,4 ± 4,1% до 2,6 ± 1,1% и myotube .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Клеточная линия C2C12 была использована в качестве модели для изучения миогенез 11-14. Эти клетки сохраняют фибробластоподобных внешний вид, быстро пролиферируют в среде , содержащей 20% фетальной бычьей сыворотки и легко дифференцировать в среде , содержащей 2% лошадиной сыворотки , 15 ед . Быстрый рост и дифференциация являются выгодные характеристики в модели миогенез клеток. Здесь мы демонстрируем использование плазмиды, ретровирусных и лентивирусов векторов для введения кДНК, 3'-UTR и shRN.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарим докторов Тома Купера из Медицинского колледжа Бейлора, Мани С. Махадевана из Университета Висконсин-Мэдисон и Дидье Троно из Университета Женевы за реактивы. Эта работа поддержана стартап-фондом Университета Хьюстона (YL), грантом Американской кардиологической ассоциации (YL, 11SDG5260033) и Национальным фондом естественных наук Китая (XP, 81460047).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| DMEM, с высоким содержанием глюкозы | Life Technologies | 11965-084 | для культуральной среды |
| Фетальная сыворотка крупного рогатого скота - Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | для культуральной среды |
| Пенициллин-Стрептомицин-Глутамин (100x) | Life Technologies | 10378-016 | для культуральной среды |
| Инсулин из поджелудочной железы крупного рогатого скота | Sigma Aldrich | I6634-100MG | для среда для дифференцировки |
| лошадиной сыворотки | Atlanta Biologicals | S12150 | для дифференцировочной среды |
| FuGENE Реагент для трансфекции HD | Promega | E2311 | для трансфекции |
| G418 сульфат | Золотая биотехнология | G-418-10 | для лекарственно-устойчивой селекции |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | sc-108071 | для лекарственно-устойчивой селекции |
| NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels, 1,0 мм, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | для вестерн-блоттинга |
| NuPAGE Transfer Buffer (20x) | Life Technologies | NP00061 | для вестерн-блоттинга |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | NP0002 | для вестерн-блоттинга |
| Amersham Protran Supported 0,2 NC, 300 мм x 4 м | GE здравоохранение медико-биологический | 10600015 | для вестерн-блоттинга |
| MF 20 | Developmental Hybridoma Bank | MF 20 | первичный Ab для иммуноокрашивания |
| козий антимышиный IgG (H+L) вторичный антитело, конъюгат Texas Red-X | Thermo Fisher Scientific | T-862 | вторичный Ab для иммуноокрашивание |
| Одноэтапная qRT-PCR MasterMix | AnaSpec | 05-QPRT-032X | для qRT-PCR |
| TriPure Изолирующий реагент | Roche | 11667165001 | для выделения РНК |
| CUG-BP1 антитело (3B1) | santa cruz | sc-20003 | первичный Ab вестерн-блот |
| антитело к актину | санта-круз | sc-1615 | козий поликлональный IgG для контроля нагрузки |
| 293T Ecopack | Clontech | 631507 | клетки для ретровирусного препарата |
| pMSCV-puro | Clontech | 634401 | пустой ретровирусный вектор для ретровирусного препарата |
| pMSCV-Celf1Flag-puro | домашний сконструированный | недоступный | ретровирусный вектор кодирующий Celf1Flag, используемый в ретровирусном препарате |
| psPAX2 | подарок от Дидье Троно | недоступен | для препарата лентивируса |
| pMD2.G | подарок от Дидье Троно | недоступен | для препарата лентивируса |
| GFP-CUG5 | подарок от M.S. Mahadevan | не доступен | подробности в ссылке 10 |
| GFP-CUG200 | подарок от M.S. Mahadevan | нет | подробностей в ссылке 10 |
| Тритон X-100 | Sigma Aldrich | X100 | для иммуноокрашивания |
| параформальдегида | Sigma Aldrich | P6148 | для иммуноокрашивания |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P9416 | для иммуноокрашивания |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | для иммуноокрашивания |
Ссылки
- Harper, P. S. Myotonic dystrophy. 3rd edn. , W. B. Saunders. (2001).
- Timchenko, L. Molecular mechanisms of muscle atrophy in myotonic dystrophies. Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2280-2287 (2013).
- Brook, J. D., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
