Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Моделирование миотонической дистрофии 1 в C2C12 миобластов клеток

15.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54078

⸱

29 июля 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology and Biochemistry, University of Houston, 2Department of Economics, University of Houston, 3Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Nanchang University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе, мы приводим процедуры создания Миотоническая дистрофия 1 миобластов моделей, в том числе оптимизированного обслуживания С2С12 клеток, генной трансфекции / трансдукции и миоцитов дифференциации.

Аннотация

Миотоническая дистрофия 1 (DM1) является распространенной формой мышечной дистрофии. Хотя некоторые модели на животных были установлены для DM1, миобластов модели клеток по-прежнему важны, поскольку они обеспечивают эффективную клеточную альтернативу для изучения клеточных и молекулярных событий. Хотя клетки миобластов С2С12 широко используется для изучения миогенез, устойчивость к трансфекции генов или вирусной трансдукции, затрудняет исследование в клетках С2С12. Здесь мы опишем оптимизированный протокол, который включает в себя ежедневное техническое обслуживание, Трансфекция и трансдукции процедуры для введения генов в С2С12 миобластов и индукции дифференцировки кардиомиоцитов. Итак, эти процедуры позволяют наилучшие эффективности трансфекции / трансдукции, а также последовательные результаты дифференциации. Протокол, описанный в создании моделей DM1 миобластов клеток пойдет на пользу изучение миотоническая дистрофии, а также других мышечных заболеваний.

Введение

Миотоническая дистрофия (DM) является аутосомно - доминантным заболеванием , которое затрагивает несколько систем, наиболее особенно сердечной и скелетных мышц 1. Есть два подтипа этого заболевания, DM1 и DM2. DM1 является более распространенным и имеет более тяжелое проявление чем СД2 2. Генетическая мутация , лежащая в основе DM1 является расширением CUG триплетных повторов , расположенных в нетранслируемой области 3 '(УТР) ДМ гена протеинкиназы (ДМПК) 3. Число ЗГП повтора в непораженных особей колеблется от 5 до 37. В отличие от этого , она возрастает до более чем 50, а иногда и до тысяч у больных DM1 4. В результате РНК-связывающие белки, такие как muscleblind типа 1 (MBNL1), CUGBP и Elav типа семейство 1 (Celf1), являются misregulated. Из - за секвестрации на расширенном CUG повторами, MBNL1 теряет способность регулировать альтернативного сплайсинга 5. Celf1, с другой стороны, до регулируемой 6,7. Сверхэкспрессия Celf1 связано с потерей мышечнойи слабость, которые не отнесены к потере функции MBNL1. Животные модели, имитирующие DM1-связанных изменений, в том числе ДМПК 3'-UTR расширения СГГ, потеря MBNL1 и избыточная экспрессия Celf1, были установлены. Тем не менее, моделирование DM1 в миобластов предлагает эффективную альтернативу, особенно для рассечения DM1 связанных клеточных и молекулярных событий.

C2C12 миобластов линия клеток впервые был выделен из поврежденной мышцы С3Н мыши и широко используются для изучения миогенной дифференцировки 8,9. C2C12 клетки быстро размножаются в эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) -содержащий средства массовой информации и легко подвергаются дифференцировке, когда ФБС истощается. Тем не менее, с помощью этой миобластов дифференциации модель представляет две задачи: C2C12 клетки часто устойчивы к трансфекции генов / вирусной трансдукции; и небольшие изменения в обработке клеток и дифференцировки процедуры может привести к заметным изменениям в образовании myotube.

Наша лаборатория обычно использует С2С12 миобластов как асELL модель и разработала протоколы , которые эффективно обеспечивают гены от плазмиды трансфекции, ретровирусной трансдукции и лентивирусов трансдукции в клеточной линии С2С12 10. В видео мы покажем, оптимизированные процедуры для трансфекции / трансдукции С2С12 клеток и поддержание согласованности дифференциации в создании моделей DM1 миобластов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. C2C12 Культура клеток

  1. Поддержание С2С12 миобластов мыши в 100 мм пластины в ростовой среде (среда Игла в модификации Игла (DMEM),), дополненной 20% эмбриональной бычьей сыворотки, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 2 мМ L-глутамина. Разрешить C2C12 пассированные клетки становятся примерно 50 - 60% сплошности.
  2. Выбросите среду для роста и промыть клетки С2С12 с 3 мл при комнатной температуре фосфатно-буферном солевом растворе (PBS). Удалите PBS и добавляют 500 мкл 0,25% трипсин-ЭДТА для открепления клеток. Поместите пластинку в 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе в течение 3 - 5 мин.
  3. Нейтрализовать трипсина путем добавления питательной среды 3 мл. Пипетировать 6 - 8 раз, чтобы приостановить клетки. Добавить 1 мл подвешенной клетки к новым 100 мм пластины и инкубировать при 37 ° С, 5% СО 2.

2. C2C12 Cell Трансфекция / трансдукции и выбор

  1. C2C12 плазмиду трансфекция
    1. 24 ч до трансфекции рКонец 7,0 х 10 5 C2C12 клеток в одну лунку шесть-луночного планшета для каждой трансфекции.
      Примечание: Это приводит к 50 - 60% монослоя ко времени трансфекции.
    2. Разрешить реагент трансфекции до комнатной температуры перед использованием.
    3. Добавить 2 мкг плазмидной ДНК (GFP-CUG5 или GFP-CUG200) в 200 мкл предварительно нагретом среде без сыворотки и вихревыми кратко. Добавить реагента для трансфекции 6 мкл в среду и сразу же перемешать в течение 30 сек с помощью вихря. Выдержите смесь в течение 30 мин при комнатной температуре.
    4. Замените носитель клеток С2С12 до 2,5 мл сыворотки среды роста. Добавьте Смесь для трансфекции в клетки после инкубации. Возвращение пластины в 5% СО 2, 37 ° С инкубатор.
    5. Держите клеток в трансфекции смеси / ростовой среде без сыворотки в течение 4 часов или до ночи. Изменение СМИ обратно в СМИ роста на следующий день или когда цитотоксичность очевидна.
      Примечание: Цитотоксичность оценивали с помощью микроскопического обследования СЕLLS. Обратите внимание на изменения в морфологии клеток и открепления клеток. Пока нет явной цитотоксичность, инкубация в течение ночи в бессывороточной ростовой среде усиливает трансфекцию.
    6. Выберите ячейки, через 48 часов после трансфекции путем добавления 1,2 - 1,6 мг / мл G418 для ~ 10 дней, пока культура управления (трансфицируют без плазмид) не не имеет живых клеток. Изменение среды каждые два дня с культуральной среде с добавлением G418.
    7. Поддерживать клетки , устойчивые к G418 в ростовой среде и 5% СО 2 при 37 ° С в течение последующих экспериментов.
  2. препарат ретровируса и C2C12 ретровирусной трансдукции
    1. Готовят НЕК 293 культуральной среды путем дополнения DMEM высокий уровень глюкозы с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 2 мМ L-глутамина.
      1. Примерно через 24 часа до трансфекции, плиты 4.0 х 10 6 экотропным упаковочных клеток НЕК 293 , основанных на 100 мм пластины (80% слияния в трансфекцией) Containing среда для культивирования клеток.
    2. Разрешить реагент трансфекции до комнатной температуры перед использованием.
    3. Смешайте 15 мкг плазмидной ДНК (pMSCV-Puro или pMSCV-Celf1Flag-Puro) в 1 мл ростовой среды без сыворотки. Vortex кратко. Добавьте 30 мкл реагента для трансфекции, полученного на стадии 2.2.2 в ДНК / сыворотки среде роста трубки, и хорошо перемешать с помощью вихря. Выдержите смесь при комнатной температуре в течение 30 мин.
    4. Добавл ют по капле смесь для трансфекции в упаковывающих клетках НЕК 293 экотропным основе. Аккуратно водоворот пластин и вернуть их обратно в 5% СО 2, 37 ° С инкубатор. Через 24 часа, изменения носителя 10 мл подогретого свежей средой роста.
    5. Урожай супернатант (содержащий ретровирус) через 48 часов после трансфекции с помощью пипетки и перенести надосадочную жидкость в центрифужную пробирку на 50 мл. Добавьте 10 мл новых теплых СМИ к пластине и вернуть его в инкубатор. Хранить надосадочную жидкость при температуре 4 ° С.
      Примечание: Средства массовой информации осторожно добавляют к тон стороне колодца так, чтобы не нарушить клеточный монослой.
    6. Заготавливают вторую партию надосадочную 60 ч после трансфекции и объединить его с супернатанта из 2.2.5. Центрифуга при 500 х г, 4 ° С в течение 7 минут, чтобы удалить остатки клеток.
    7. Передача супернатант в новую 50 мл центрифужную пробирку. С помощью ретровируса для трансдукции клеток С2С12 в этой точке переходит к шагу 2.2.9 или аликвоты и хранить супернатант при -20 ° С для последующего использования.
    8. Разморозить ретровируса из 2.2.7 при комнатной температуре, если замороженной используется здесь.
      Примечание: Избегайте многократных циклов замораживания-оттаивания.
    9. Пластина клеток С2С12 в тот же день трансдукции, направленных на 30 - 40% слияния.
      1. Выбросьте среду для роста и мыть клетки С2С12 с 3 мл PBS при комнатной температуре. Удалите PBS, добавляют 500 мкл 0,25% трипсин-ЭДТА, и инкубируйте в 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе в течение 3 - 5 мин.
      2. Нейтрализовать трипсина путем добавления 3 мл Медиана ростаНМУ. Пипетировать 6 - 8 раз, чтобы приостановить клетки. Граф клеток с использованием гемоцитометра и добавить 8,0 × 10 5 C2C12 клеток до 60 мм планшет.
    10. Добавить 0,5 мл ретровирус заражает один 60 мм пластины клеток в 3 мл питательной среды. Возвращение пластины в инкубатор.
    11. Заменить 3 мл свежей среды, дополненной выбора антибиотика (пуромицин 1 - 3 мкг / мл) 48 ч после заражения. Заменить 3 мл среды с антибиотиком каждый день в течение ~ 5 дней до untransduced культуры управления C2C12 не вымирает.
  3. Лентивирус подготовка и C2C12 лентивирусов трансдукции
    Примечание: Выполните все процедуры, связанные с Лентивирус в уровень биологической безопасности 2 кабинета и следовать биологические инструкции по технике безопасности. Жидкие отходы, содержащие вирус, должны быть продезинфицированы перед утилизацией.
    1. Пластина 4.0 х 10 6 клеток 293T в 100 мм пластины (~ 80% сплошности в день трансфекции) с НЕК 293 культуральной среды клеток (DMEM высокий уровень глюкозы, дополненной 10% плоднойбычий сывороточный, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 2 мМ L-глутамина) 24 ч до трансфекции.
    2. Подогреть трансфекцию реагента до комнатной температуры. Смешайте лентивирусов упаковки векторов (4 мкг pMD2.G и 6 мкг psPAX2) вместе с 8 мкг лентивирусов переноса вектора (Celf1 shRNA или платные каналы управления shRNA) в 1 мл не содержащей сыворотки среды для культивирования клеток. Vortex кратко.
    3. Добавьте 36 мкл подогретого реагента для трансфекции в ДНК / DMEM трубки и хорошо перемешать с помощью вихря. Выдержите смесь при комнатной температуре в течение 30 мин.
    4. Удалите 293Т из инкубатора и добавить смесь для трансфекции к пластине. Аккуратно вихревой пластины и вернуть его обратно в 5% CO 2, 37 ° С инкубатор. Через 24 часа, замените трансфекция смесь с 10 мл свежей культуральной средой.
    5. Собирают супернатант, содержащий лентивирусов 48 ч после трансфекции и передачи ее в центрифужную пробирку на 50 мл. Добавьте 10 мл новые теплые СМИ к пластине и вернуть егов инкубатор. Хранить надосадочную жидкость при температуре 4 ° С.
    6. Соберите вторую партию надосадочную 60 ч после трансфекции и объединить его с супернатантом из 2.3.5. Центрифуга кратко при 500g, 4 ° С в течение 7 мин.
    7. Передача супернатант в свежую 50 мл центрифужную пробирку. При использовании свежего вируса, переходите к шагу 2.3.9. Для использования в будущем, хранить содержащую вирус надосадочную жидкость при температуре от -20 & deg; С в виде аликвот по 10 мл.
    8. Оттепель вирус из 2.3.7 при комнатной температуре перед использованием, если используется замороженный запас.
      Примечание: Избегайте многократных циклов замораживания-оттаивания.
    9. C2C12-CUG200 клетки пластины (полученные в разделе 2.1), как описано в 2.2.9 в тот же день трансдукции.
      Примечание: Цель на 30 - 40% слияния.
    10. Добавьте 0,5 мл вируса, чтобы заразить 60 мм пластины С2С12-CUG200 и вернуть пластины в инкубатор.
    11. Заменить культуральной среды свежей средой, дополненной антибиотика селекции (пуромицин 1 - 3 мкг / мл) 72 ч после трансдукции.Refresh медиакультуры ежедневно с антибиотиком выбора для ~ 5 дней, пока все untransduced культура управления C2C12-CUG200 не гаснет.
    12. С помощью Вестерн-блот для проверки Celf1 нокдаун в GFP-CUG200 трансфицированных клеток.

3. C2C12 дифференцировка клеток

  1. Пластина 2 х 10 6 клеток в одну лунку 6-луночного планшета в 2,5 мл среды для выращивания 24 ч до начала дифференцировки.
    Примечание: Плотность покрытия может быть отрегулирована таким образом, что полное слияние достигается через 24 ч.
    1. Промыть вырожденные клетки с PBS и добавляют 2,5 мл с низким сывороточным дифференциации среды (модифицированной среде Игла, дополненной 2% лошадиной сыворотки, 100 ед / мл пенициллина Дульбекко, 100 мкг / мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина и 1 мкМ инсулина) , Замените среду каждые два дня.
      Примечание: Держите запаса инсулина замороженные и добавить его в средствах массовой информации при каждой смены среды.
  2. Во время С2С12 дифференциации, собирать образцы для цюаньственном ОТ-ПЦР (см раздел 4) в следующих временных точках: Day0, 1, 2, 4 и 6. Процесс культура для иммунологического окрашивания на 6-й день - 8 (см раздел 5).

Выделение РНК и 4. Количественный ОТ-ПЦР

  1. Используйте протокол производителя для выделения РНК. После выделения ресуспендируют РНК гранул в 30 мкл РНКазы без воды и пипеткой вверх и вниз несколько раз.
    Примечание: Образцы могут перейти к количественной ОТ-ПЦР или могут храниться при температуре -80 ° C.
  2. Использование комплекта RT КПЦР для количественного RT-PCR 10 и следовать инструкциям производителя. Готовят реакционную смесь в соответствии с таблицей 1.
Компонент Объем (мкл) Конечная концентрация
реакционный буфер 2x 10 1x
Прямой праймер 0,5 200 нМ
Обратный праймер 0,5 200 нМ
зонд 0,5 200 нМ
Ревертазам & РНКазы Ингибитор 0,1 0,25 Ед / мл
шаблон 1 100 нг общей РНК
РНКазы свободной воды 7.4 Не Доступно
Total Mix 20

Таблица 1. Количественный ОТ-ПЦР Master Mix Приготовление

  1. Выполните 20 мкл RT-КПЦР реакции с использованием теплового профиля Таблица 2.
Обратный шаг транскрипции 30 мин, 48 ° С
полимер ДНКактивация аза / инактивация обратной транскриптазы 10 мин, 95 ° C
40 циклов 15 сек, 95 ° С
1 мин, 60 ° С

Таблица 2. Количественный ОТ-ПЦР термический профиль

5. Иммунологическое

  1. Закрепить монослойной культуре в 2,5 мл свежеприготовленного 4% параформальдегида / PBS при комнатной температуре в течение 10 мин.
  2. Проницаемыми образцов в 2,5 мл 0,1% Тритона Х-100 / PBS в течение 30 мин при комнатной температуре.
  3. Передача образцов в увлажненной камере. Блок образцов в 2,5 мл блокирующего буфера (0,1% неионный ПАВ / PBS, 10% нормальной козьей сыворотки) в течение 30 мин при 37 ° С.
  4. Откажитесь блокирующий буфер и применять 800 мкл первичного антитела против тяжелой цепи миозина, разведенного в блокирующем буфере (1: 100). Инкубируйте в увлажненной камере в течение ночи при комнатной температуре.
  5. Промыть пластины 3 тимэс (10 мин каждый) с 2,5 мл буфера для промывки (0,1% полисорбат 20 / PBS) на 2-й день.
  6. Удалите промывочный буфер и применять 800 мкл вторичного антитела (козье антитело против мышиного IgG, 1: 500, разбавленный в PBS). Инкубируйте в увлажненной камере при комнатной температуре в течение 1 часа.
  7. Промыть два раза (10 мин каждая) с 2,5 мл буфера для промывки.
  8. Инкубируют 800 мкл DAPI (1 мкг / мл, разбавленного в дистиллированной деионизированной H 2 O) в течение 5 мин.
  9. Промыть с 2,5 мл буфера для промывки снова в течение 10 мин.
  10. Изменение промывочного буфера в 2,5 мл PBS и использовать флуоресцентный микроскоп для захвата изображений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Клетки C2C12 трансфицировали GFP-CUG5 или GFP-CUG200. После выбора лекарственной устойчивости, были созданы стабильные бассейны, которые могут быть визуализированы с помощью экспрессии GFP (Фигура 1А). Формирование Myotube в дифференцированных миобластов была обнаружена тяжелой цепи миозина иммунным окрашиванием 10 (Фигура 1В). Количественное myotube формирования показали , что показатели слитые снизились с 35,4 ± 4,1% до 2,6 ± 1,1% и myotube ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Клеточная линия C2C12 была использована в качестве модели для изучения миогенез 11-14. Эти клетки сохраняют фибробластоподобных внешний вид, быстро пролиферируют в среде , содержащей 20% фетальной бычьей сыворотки и легко дифференцировать в среде , содержащей 2% лошадиной сыворотки , 15 ед . Быстрый рост и дифференциация являются выгодные характеристики в модели миогенез клеток. Здесь мы демонстрируем использование плазмиды, ретровирусных и лентивирусов векторов для введения кДНК, 3'-UTR и shRN...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим докторов Тома Купера из Медицинского колледжа Бейлора, Мани С. Махадевана из Университета Висконсин-Мэдисон и Дидье Троно из Университета Женевы за реактивы. Эта работа поддержана стартап-фондом Университета Хьюстона (YL), грантом Американской кардиологической ассоциации (YL, 11SDG5260033) и Национальным фондом естественных наук Китая (XP, 81460047).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DMEM, с высоким содержанием глюкозыLife Technologies11965-084для культуральной среды
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота - PremiumAtlanta BiologicalsS11150для культуральной среды
Пенициллин-Стрептомицин-Глутамин (100x)Life Technologies10378-016для культуральной среды
Инсулин из поджелудочной железы крупного рогатого скотаSigma AldrichI6634-100MGдля среда для дифференцировки
лошадиной сывороткиAtlanta BiologicalsS12150для дифференцировочной среды
FuGENE  Реагент для трансфекции HDPromegaE2311 для трансфекции
G418 сульфат Золотая биотехнология G-418-10для лекарственно-устойчивой селекции
Puromycin dihydrochlorideSigma Aldrichsc-108071для лекарственно-устойчивой селекции
NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels, 1,0 мм, 15 wellLife TechnologiesNP0323BOXдля вестерн-блоттинга
NuPAGE Transfer Buffer (20x)Life TechnologiesNP00061для вестерн-блоттинга
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)Life TechnologiesNP0002для вестерн-блоттинга
Amersham Protran Supported 0,2 NC, 300 мм x 4 мGE здравоохранение медико-биологический10600015для вестерн-блоттинга
MF 20Developmental Hybridoma BankMF 20первичный Ab для иммуноокрашивания
козий антимышиный IgG (H+L) вторичный антитело, конъюгат Texas Red-XThermo Fisher ScientificT-862вторичный Ab для иммуноокрашивание
Одноэтапная qRT-PCR MasterMixAnaSpec05-QPRT-032Xдля qRT-PCR
TriPure Изолирующий реагентRoche11667165001для выделения РНК
CUG-BP1 антитело (3B1)santa cruzsc-20003первичный Ab вестерн-блот
антитело к актинусанта-крузsc-1615козий поликлональный IgG для контроля нагрузки
293T EcopackClontech631507клетки для ретровирусного препарата
pMSCV-puroClontech634401пустой ретровирусный вектор для ретровирусного препарата
pMSCV-Celf1Flag-puroдомашний сконструированныйнедоступныйретровирусный вектор кодирующий Celf1Flag, используемый в ретровирусном препарате
psPAX2подарок от Дидье Трононедоступендля препарата лентивируса
pMD2.Gподарок от Дидье Трононедоступендля препарата лентивируса
GFP-CUG5подарок от M.S. Mahadevanне доступенподробности в ссылке 10 
GFP-CUG200подарок от M.S. Mahadevanнетподробностей в ссылке 10 
Тритон  X-100Sigma AldrichX100для иммуноокрашивания
параформальдегидаSigma AldrichP6148для иммуноокрашивания
TWEEN  20Sigma AldrichP9416для иммуноокрашивания
DAPISigma AldrichD9542для иммуноокрашивания

Ссылки

  1. Harper, P. S. Myotonic dystrophy. 3rd edn. , W. B. Saunders. (2001).
  2. Timchenko, L. Molecular mechanisms of muscle atrophy in myotonic dystrophies. Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2280-2287 (2013).
  3. Brook, J. D., et al. Molecular basis of myotonic dystrophy: expansion of a trinucleotide (CTG) repeat at the 3' end of a transcript encoding a protein kinase family member. Cell. 68 (4), 799-808 (1992).
  4. Chau, A., Kalsotra, A. Developmental insights into the pathology of and therapeutic strategies for DM1: Back to the basics. Dev Dyn. 244 (3), 377-390 (2015).
  5. Ho, T. H., et al. Muscleblind proteins regulate alternative splicing. EMBO J. 23 (15), 3103-3112 (2004).
  6. Kuyumcu-Martinez, N. M., Wang, G. S., Cooper, T. A. Increased steady-state levels of CUGBP1 in myotonic dystrophy 1 are due to PKC-mediated hyperphosphorylation. Mol Cell. 28 (1), 68-78 (2007).
  7. Kalsotra, A., et al. The Mef2 transcription network is disrupted in myotonic dystrophy heart tissue, dramatically altering miRNA and mRNA expression. Cell Rep. 6 (2), 336-345 (2014).
  8. Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
  9. Blau, H. M., Chiu, C. P., Webster, C. Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons. Cell. 32 (4), 1171-1180 (1983).
  10. Peng, X., et al. Celf1 regulates cell cycle and is partially responsible for defective myoblast differentiation in myotonic dystrophy RNA toxicity. Biochim Biophys Acta. 1852 (7), 1490-1497 (2015).
  11. Amack, J. D., Mahadevan, M. S. The myotonic dystrophy expanded CUG repeat tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast differentiation. Hum Mol Genet. 10 (18), 1879-1887 (2001).
  12. Amack, J. D., Paguio, A. P., Mahadevan, M. S. Cis and trans effects of the myotonic dystrophy (DM) mutation in a cell culture model. Hum Mol Genet. 8 (11), 1975-1984 (1999).
  13. Bhagavati, S., Shafiq, S. A., Xu, W. (CTG)n repeats markedly inhibit differentiation of the C2C12 myoblast cell line: implications for congenital myotonic dystrophy. Biochim Biophys Acta. 1453 (2), 221-229 (1999).
  14. Amack, J. D., Mahadevan, M. S. Myogenic defects in myotonic dystrophy. Dev Biol. 265 (2), 294-301 (2004).
  15. Emerson, C. P., Sweeney, H. L. Methods in muscle biology. 52, Academic Press. (1997).
  16. Ward, A. J., Rimer, M., Killian, J. M., Dowling, J. J., Cooper, T. A. CUGBP1 overexpression in mouse skeletal muscle reproduces features of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19 (18), 3614-3622 (2010).
  17. Koshelev, M., Sarma, S., Price, R. E., Wehrens, X. H. T., Cooper, T. A. Heart-specific overexpression of CUGBP1 reproduces functional and molecular abnormalities of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19 (6), 1066-1075 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

C2C12Celf1
Моделирование миотонической дистрофии 1 в C2C12 миобластов клеток
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.