Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Подход, чтобы усилить согласованность и миелинизации спинного ганглий корень Нейроны

8.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54085

⸱

24 августа 2016 г.

 , 
1Department of Chemical Engineering and Materials Science, Michigan State University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает выделение нейронов ганглия дорсального корешка (DRG), выделенных у крыс, и культивирование нейронов DRG на статической предварительно растянутой клеточной культуральной системе для улучшения выравнивания аксонов, с последующим совместным культивированием шванновских клеток (SCs) для стимулирования миелинизации.

Аннотация

Регенерация аксонов — это хаотичный процесс, в основном из-за неорганизованного выравнивания аксонов. Поэтому для того, чтобы достаточное количество регенерированных аксонов могло перекрыть место поражения, требуется правильно организованное выравнивание аксонов. Поскольку демиелинизация после повреждения нерва сильно ухудшает проводящую способность выживших аксонов, ремиелинизация имеет решающее значение для успешного функционирования регенерированных нервов. Ранее мы продемонстрировали, что мезенхимальные стволовые клетки (МСК), выровненные на предварительно растянутой поверхности, индуцировали анизотропию, потому что клетки могут ощущать большую эффективную жесткость в растянутом направлении, чем в перпендикулярном. Мы также показали, что анизотропная поверхность, возникающая из механической предварительно растянутой поверхности, аналогичным образом влияет на выравнивание, а также на рост и миелинизацию аксонов. Здесь мы предоставляем подробный протокол подготовки предварительно растянутой анизотропной поверхности, выделения и культивирования нейронов ганглия дорсального корешка (DRG) на предварительно растянутой поверхности, а также показываем миелинизирующее поведение ко-культуры нейронов DRG с шванновскими клетками (SC) на предварительно растянутой поверхности.

Введение

В нервных травм, проксимальный и дистальный нервные пни часто предотвращается прямой перестройкой нервных пучках из - за повреждения участка 1-2. Обычно аксонов тракты состоят из упорядоченных и высоко выровненных пучков аксонов, которые образуют сложные сети связи. Тем не менее, регенерация нерва является хаотический процесс из - за плохо организованной выравнивании аксона 3-4. Таким образом, чтобы генерировать достаточное количество регенерирующей аксоны, позволяющего устранить месте повреждения, то необходимо, чтобы побудить хорошо организованной аксонов выравнивания. Кроме того, демиелинизация сопровождает повреждения нерва из-за гибели myelinating клеток в месте повреждения. Так как демиелинизация сильно ухудшает проводящую способность выдерживать аксоны, процедуры , направленные на демиелинизации или способствующие ремиелинизацию являются существенными для функционального восстановления после повреждения нерва 5. Таким образом, цель данного протокола, чтобы проиллюстрировать инженерный подход, учитывающий эти два вопросарегенерации нерва.

Поверхностная анизотропия, которая определяется как разница, при измерении вдоль различных осей, в физических или механических свойств материала , в, был применен влиять выравнивание клеток, рост и миграцию 6-7. В дополнение к топографии, существуют и другие методы, чтобы индуцирующие анизотропию. Ранее мы исследовали поверхностной анизотропии, вызванной механическим статическим предварительной протяжения поли-диметил-силоксановых (PDMS) мембраны. Теория "малой деформации супер , наложенных на большой" предсказал , что эффективная жесткость клетки чувствуют в растянутом направлении отличается от перпендикулярного направления, и эта разница в эффективной жесткости из - за поверхностной анизотропии 8. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) , культивируемые на предварительно растянутой мембраны PDMS способны чувствовать анизотропию, активно вытягивать поверхность , и в результате, выравнивать в предварительно растянутой направлении 9. Аналогичным образом, поверхность ар анизотропнаяизинговских от механического предварительно растянутой поверхности влияет на выравнивание, а также роста и миелинизации спинномозговых ганглиев (DRG) аксонов 10. Здесь мы приводим протокол для индукции поверхностной анизотропии на статическом предварительно растянутой подложке PDMS для повышения аксонов регенерации 10.

Для того, чтобы вызвать выравнивание аксонов, топологические особенности с заданными узорами, сообщает предоставить контактную руководство через выровненных волокон и каналов 6,11-12, были продемонстрированы для облегчения выравнивания аксонов 11,13. Тем не менее, сообщалось методы индукции выравнивания аксонов через топологических характеристик, таких как волокна, каналы и структурирование, были неспособны удлиняться и увеличить толщину аксонов. В противоположность этому , постепенное механическое растяжение привело к выравниванию аксонов в направлении растягивания с более длинными и более толстыми аксонами , которые увеличились с величиной перегоне 14. Тем не менее, включение устройства с независимым питанием двигателя в естественных условиях не являетсяпредставляется возможным. В противоположность этому , статическое предварительно растянутой наведенной анизотропии менее сложна и может быть более легко включены в будущие конструкции каркаса для применения в естественных условиях.

В этом протоколе, статический предварительно растянутой система клеточной культуры используется для индукции поверхностной анизотропии без топологических характеристик. Предварительно растянутая система культуры состоит из мембраны PDMS, поддающегося растягиванию рамой и простирающейся стадии, после чего мембрана закреплена на раме, а заданная величина растянуть применяется на стадии вытяжки. Свежевыделенные нейроны DRG культивировали на предварительно растянутой поверхности на срок до 21 дней, отслеживаются для выравнивания и толщины аксона. Впоследствии Шванн клетки (SCS) культивировали совместно с унифицированным аксонов контролируются на миелинизации. Объединив предварительно простирания индуцированной поверхностной анизотропии мы смогли улучшить ячейки выравнивания дифференциации и аксона выравнивания роста MSCs и DRG нейронов 9-10, соответственно.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры для выделения клеток были одобрены по уходу и использованию комитета Institutional животных в Университете штата Мичиган по.

1. Приготовление предварительно растянутой поверхности анизотропного

  1. Смешайте 10: раствор основы и отвердителя 1 и вылить смесь в блюдо культуры ткани (диаметром 12 см). С помощью 4900 мг основы и 490 мг отвердителя для общей сшивающего смеси.
  2. Смесь необходимо хранить гель в вакууме в течение 20 мин, чтобы удалить пузырьки воздуха.
  3. Поместите смесь геля в печи в течение ночи отверждения при 60 ° C.
  4. После того, как мембраны лечений PDMS, обработать поверхность с кислородной плазмой с помощью системы очистки / плазменного травления в течение 3 мин при 165 мТорр и 65 куб.см при СТД потока O 2.
  5. Отрежьте кусок прямоугольной мембраны (5 × 3,5 см) от тарелки, в то же время осознавая, какая сторона представляет собой кислород обращению, убедитесь, что кислород обработанной стороной вверх и крепятся на пялец. Поместите рамку на растягивая сцену и равномерно растянуть поворотом ручки на сцене , пока не достигнет 10% удлинения (или какой - либо другой предварительно определенное растяжение, удлинение может быть непосредственно считаны из стадии вытяжки) в длинной оси 9. Закрепите растяжку, затянув винты на раме.
  6. Снимите раму со сцены. Убедитесь, что поверхность мембраны сухой и свободной от пыли, а затем поместить силиконовую камеру на мембрану, позволяя липкой стороне камеры, чтобы плотно прикрепить к мембране.
    Примечание: силиконовая камера обеспечивает хорошо для удерживания среды клеток на мембране PDMS. Конструкция устройства показана на рисунке 1.
  7. Стерилизовать поверхность с УФ в течение 10 мин.
  8. Добавить 1 мл поли-L-лизин (ФАПЧ) (0,01% в фосфатно-солевом буферном) на поверхности PDMS внутри камеры, в течение 6 ч плазменной обработки и инкубировать в течение 2 ч при 37 ° С перед посевом нейроны DRG. Это усиливает прикрепление клеток.
ле "> 2. Выделение DRG

  1. Подготовить стандартную ростовую среду для нейронов DRG.
  2. До изоляции, автоклава изоляции оборудования и фильтров реагентов. Добавляют 5 мл буфера изоляции в одну лунку 6-луночного планшета, и поместите тарелку на льду. Приготовьте 10 мл среды диссоциации путем добавления 1 мл коллагеназы А (500 Ед / мл) до 9 мл 0,05% трипсин-ЭДТА (1 мг / мл), фильтрации растворов с фильтром и место 0,22 мкм на льду.
  3. Используйте десять-двенадцать 5 - 7 старых крыс Sprague-Dawley суток за изоляции. Спрей щенкам с 75% изопропилового спирта, и принести в жертву путем обезглавливания.
  4. Срежьте кожу, перекрывающую спинной мозг со спины и удалите излишки ткани вокруг позвоночника. Под хирургической лупу с хирургическими местная подсветка на, сделать первый надрез от шеи, а затем один разрез вдоль позвоночника с обеих сторон с помощью ножниц. Отделить позвоночник от тела щенкам и удалить избыток мышц. Затем, используйте ножницы, чтобы разрезать вдоль долготуг оси позвоночника и использовать пинцет, чтобы полностью открыть позвоночник и извлечь спинного cord.Remove наконечник из пипетки, чтобы создать большее отверстие для передачи ДРГ с буфером изоляции в стерильный 15 мл пробирку.
  5. С помощью тонкой пинцет, удалите ганглий из костного кармана и собирают примерно 10 - 16 DRG с обеих сторон. Обрежьте корни нерва и передать ганглиев в ледяном буфере изоляции.
  6. Извлеките наконечник из пипетки, чтобы создать большее открытие для передачи ДРГ с буфером изоляции в стерильный 15 мл пробирку. После химической диссоциации, центрифуга ганглии при 900 х г и 4 ° С в течение 5 мин.
  7. Пусть ткани оседают на дно пробирки и осторожно удалите буфер изоляции на верхней и добавляют 10 мл раствора диссоциации среды в трубу.
  8. Инкубируйте рассеченные ткани в среде диссоциации в водяной бане C 37 ° в течение 1 ч при встряхивании трубки через каждые 5 - 10 мин.
  9. Послехимическая диссоциация, центрифуга ганглии при 900 х г и 4 ° С в течение 5 мин.
  10. Удалить супернатант и повторно приостанавливать осадок в 10 мл стандартных сред и вихревыми.
  11. Центрифуга диссоциированных клеток, как указано в разделе 2.9 еще раз.
  12. Удалить супернатант, повторно приостанавливать осадок в 12 мл стандартных сред роста и вихря.

3. Культура DRG по предварительно растянутой поверхности

  1. Перед посевом клеток, удалить растворы ФАПЧ из камеры и промыть поверхность PDMS стерильной водой и сухой воздух.
  2. После повторного суспендирования клеток, пусть множество подвески в течение 1 - 2 мин, чтобы позволить мусор оседают на дно пробирки. Добавить 1,5 мл суспензии клеток в каждую натяжного камеру и инкубировать при 37 ° С в 5% CO 2.
  3. Для устранения глиальных клеток, на 1 день в пробирке (DIV), добавьте 10 мкл (или 15 мкл) смесь фтор-2-дезокси уридин и уридин (FDU-U) акций Soluti(смотрите таблицу материалов) в каждую лунку. Через 7 ч, заменить эту среду со свежей стандартной ростовой среды и поместить предварительно растянутой устройство культура в инкубаторе при 37 ° C с 5% CO 2.
  4. В течение периода культивирования клеток (2 - 3 недели), изменения среды каждые два дня, заменив половину затрачиваемое среды свежей средой. Примечание: После культивирования на растянутых и растяжений поверхности в течение 2 недель, очищенный Стволовые добавляют в камеру и культивировали в течение следующей недели (этап 4.7).

4. Совместное культивирование клеток Шванн (SCS) с DRG нейронах по предварительно растянутой поверхности

  1. Изолировать SCs , как описано группой доктора Кампана в ранее 15.
    1. Если коротко, то изолировать ГКС от 1-дневного возраста детеныша. Сбор и диссоциируют седалищный нервы как химически (трипсин-ЭДТА и коллагеназы A) и механически (18 калибра иглы / 10 мл шприц) 15.
    2. Семя разложенных клеток в поли-D-лизина (PDL) соованные Т25 колбу и культуры при 37 ° С в 5% CO 2. На 5-й день, очищают клетки путем отбора антител с использованием анти-Thy 1.1 антител и кроличий комплемент и субкультуры очищенные клетки к прохождению 2 - 4. С помощью культуральной среды, содержащей Дульбекко модифицированную Дульбекко (DMEM), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) , 1% пенициллин / стрептомицин (Пенна / Стрептококковое), 21 мкг / мл бычьего гипофизарный экстракт (BPE), и 4 мкМ форсколин.
  2. Удалить культуральную среду, из ГКС, и добавляют 5 мл 0,05% трипсин-ЭДТА в колбу. Инкубируйте клетки при 37 ° С в 5% СО 2 в течение 2 - 3 мин.
  3. Проверьте клетки под оптическим микроскопом с использованием объектива 10х, чтобы увидеть, если они поднимают вверх из колбы, затем добавляют 5 мл культуральной среды и смешивают с клетками в колбе.
  4. Добавить суспензии клеток в центрифужные пробирки объемом 15 мл и центрифугируют при 200g и 20 ° С в течение 5 мин.
  5. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 7 мл стандарт DRG медианы ростаНМА.
  6. Взять 10 мкл клеточной суспензии в микроцентрифужных пробирку емкостью 0,5 мл, смешивают с 10 мкл трипанового синего, а затем подсчитывают количество клеток с помощью гемоцитометра при оптической микроскопии с использованием объектива 10х. Развести клеточной суспензии до 5000 клеток на мл путем добавления питательной среды DRG.
  7. Удалить 0,5 мл среды от DRG культуры в растянутом камере и добавляют 0,5 мл суспензии SC в DRG культуры.
  8. Культуры клеток в течение 1 недели при 37 ° С и 5% СО 2. Изменение средств массовой информации каждые два дня, заменив половину истощенной средой со свежей стандартной питательной среды для DRG. После 1 недели совместного культивирования, процесс клетки с помощью иммуногистохимии 10.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Система предварительно растянутой культуры клеток способствует DRG выравнивание аксонов 10. DRG нейроны культивировали на предварительно растянутой и растяжений поверхности в течение 12 дней. Аксоны окрашивали для бета-III-тубулина , чтобы продемонстрировать их выравнивание. Рисунок 2 сравнивает ориентацию аксонов на подложках предварительно растянутой и Нерастянутые PDMS после 12 дней культивирования. В DRG аксоны расположены параллельно натянутым направлении...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Для того, чтобы побудить аксонов выравнивание по предварительно растянутой поверхности, есть два важных шага: 1) мембрана PDMS должна быть ровной и гомогенной толщины; и 2) глиальные клетки должны быть удалены из DRG. После смешивания PDMS и сшивателя и отверждения в печи, сшитый гель PDMS должны храниться на ровной поверхности стола и осторожно, чтобы избежать перекоса. Лечение кислородной плазмой мембраны PDMS необходимо следовать в течение 6 часов с помощью ФАПЧ покрытия, так как гидрофильность поверхности (требуется...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют никакого конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Эрика Vasco за его помощь в подготовке субстратов PDMS, д-р Ван Shiyong в лаборатории доктора Марины Маты в Университете штата Мичиган за полезные советы и обучение изоляции DRG, и д-р Марк Tuszynski и д-р . В. Мари Кампана Калифорнийского университета в Сан-Диего за полезные предложения и протокол для изоляции SC. Это исследование было поддержано частично Национальным научным фондом (конбетить 0941055 и конбетить 1510895), Национальный институт здравоохранения (R21CA176854, R01GM089866 и R01EB014986).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Нейробазальная среда 1xGibcoBRL21103-049
B27 Добавка 50xGibcoBRL17504-044
Глутамакс-I 100xGibcoBRL35050-061
Albumax-IGibcoBRL11020-021
Фактор роста нервов-7SInvitrogen13290-010
Пенициллин-стрептомицинGibcoBRL15140-122
0,05% трипсин-ЭДТА/1 мМ ЭДТАGibcoBRL25300-054
поли-L-лизинтревиген<а href="http://www.trevigen.com/item/2/7/64/220/Cultrex_PolyLLysine/">3438-100-01
поли-D-лизинSigmap-6407
фтор-2 дезокси-уридинSigmaF0503
UridineSigmaU3003
Хэнк s Сбалансированный солевой раствор (HBSS)Invitrogen14170-112Изоляционный буфер
типа I КоллагеназаWorthingtonLS004196
DMEMGibco11885
Тепло инактивированная фетальная бычья сывороткаHycloneSH30080.03
BPECloneticsCC-4009
ForskolinCalbiochem344270
Силиконовая камераGreiner bio-oneFlexiPERM ConA
Система плазменной очистки/травленияMarch InstrumentsPX-250
Anti-Thy 1.1 антителоSigma- AldrichM7898
Rabbit ComplementSigma- AldrichS-7764
Стандартная средадля выращиванияДля 500 мл Neurobasal Medium 1x добавьте 10 мл B-27 50x, 5 мл Glutamax-I 100x, 2,5 мл Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 мл Albumax-I и 1 μ l NGF-- 7S (50 μ г/мл).
FDU Uridine стоковый растворFDU 100 мг в 10 мл ddH2O (10 мг/мл), процеживаем в колпаке и делим на 500 мкм; Уридин 5 г в 166,7 мл дН<суб>2О (33 мг/мл), профильтровать в колпаке, разделить на 200 мкм; l аликвоты и хранить при -20 ° ° C. Возьмите 61,5 μ л FDU (10 мг/мл) и 20,5 мкм; л уридина (33 мг/мл) и добавить 4 918 μ л ddH2O до конечной концентрации в запасе, затем разделить на 1 мл аликвот и хранить при -20 °°C.

Ссылки

  1. Liu, C., et al. Layer-by-Layer Films for Biomedical Applications. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 525-546 (2015).
  2. Faweett, J. W., Keynes, R. J. Peripheral Nerve Regeneration. Annu Rev Neurosci. 13, 43-60 (1990).
  3. Li, Y., Field, P. M., Raisman, G. Repair of adult rat corticospinal tract by transplants of olfactory ensheathing cells. Science. 277, 2000-2002 (1997).
  4. Geller, H. M., Fawcett, J. W. Building a bridge: Engineering spinal cord repair. Exp Neurol. 174, 125-136 (2002).
  5. Totoiu, M. O., Keirstead, H. S. Spinal cord injury is accompanied by chronic progressive demyelination. J Comp Neurol. 486, 373-383 (2005).
  6. Chua, J. S., et al. Extending neurites sense the depth of the underlying topography during neuronal differentiation and contact guidance. Biomaterials. 35, 7750-7761 (2014).
  7. Dowell-Mesfin, N. M., et al. Topographically modified surfaces affect orientation and growth of hippocampal neurons. J Neural Eng. 1, 78-90 (2004).
  8. Baek, S., Gleason, R. L., Rajagopal, K. R., Humphrey, J. D. Theory of small on large: Potential utility in computations of fluid-solid interactions in arteries. Comput Method Appl M. 196, 3070-3078 (2007).
  9. Liu, C., et al. Effect of Static Pre-stretch Induced Surface Anisotropy on Orientation of Mesenchymal Stem Cells. Cell Mol Bioeng. 7, 106-121 (2014).
  10. Liu, C., et al. The impact of pre-stretch induced surface anisotropy on axon regeneration. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
  11. Berns, E. J., et al. Aligned neurite outgrowth and directed cell migration in self-assembled monodomain gels. Biomaterials. 35, 185-195 (2014).
  12. Kidambi, S., Lee, I., Chan, C. Primary neuron/astrocyte co-culture on polyelectrolyte multilayer films: A template for studying astrocyte-mediated oxidative stress in neurons. Adv Funct Mater. 18, 294-301 (2008).
  13. Xia, H., et al. Directed neurite growth of rat dorsal root ganglion neurons and increased colocalization with Schwann cells on aligned poly(methyl methacrylate) electrospun nanofibers. Brain Research. 1565, 18-27 (2014).
  14. Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations. Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).
  15. Mantuano, E., Jo, M., Gonias, S. L., Campana, W. M. Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein (LRP1) Regulates Rac1 and RhoA Reciprocally to Control Schwann Cell Adhesion and Migration. Journal of Biological Chemistry. 285, 14259-14266 (2010).
  16. Kim, B., ET, K. P., Papautsky, I. Long-term stability of plasma oxidized PDMS surfaces. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 7, 5013-5016 (2004).
  17. Lopera, S., Mansano, R. D. Plasma-Based Surface Modification of Polydimethylsiloxane for PDMS-PDMS Molding. ISRN Polymer Science. 2012, (2012).
  18. Chandra, G. Organosilicon Materials. , Springer. Berlin Heidelberg. (2013).
  19. Wu, M. H. Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion. Surf Interface Anal. 41, 11-16 (2009).
  20. Moore, M. J., et al. Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration. Biomaterials. 27, 419-429 (2006).
  21. Clarke, J. C., et al. Micropatterned methacrylate polymers direct spiral ganglion neurite and Schwann cell growth. Hearing Res. 278, 96-105 (2011).
  22. Pfister, B. J., et al. Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons. J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Предварительно растянутая анизотропная поверхностьулучшение выравнивания аксоновсовместное культивирование с клетками Шваннаанализ процесса миелинизациирастяжение ПДМС-мембраныизоляция нейронов ганглиев задних корешковпротокол культивирования клетокинженерия нервной тканиподдержка регенерации аксонов
Подход, чтобы усилить согласованность и миелинизации спинного ганглий корень Нейроны
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.