Методическая статья

Удаление экзогенных материалов из внешней части замороженных ядер по расследованию Древние биологических сообществ таил Внутри

8.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54091

⸱

3 июля 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biogeochemical Sciences Branch, Cold Regions Research and Engineering Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Hanover, NH, 2Environmental Processes Branch, Environmental Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Vicksburg, MS, 3Terrestrial and Cryospheric Scienes Branch, Cold Regions Research and Engineering Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Hanover, NH, 4Biogeochemical Sciences Branch, Cold Regions Research and Engineering Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Fairbanks, AK

В этой статье

Краткое содержание

Криосфера предлагает доступ к сохранившимся организмов, которые сохранялись при прошлых условиях окружающей среды. Протокол представлен для сбора и обеззаразить вечной мерзлоты ядер почв и льда. Отсутствие экзогенного колоний и ДНК предполагают, что микроорганизмы, обнаруженные представляют Интернете, а не загрязнение от сверления или обработки.

Аннотация

Криосфера предлагает доступ к сохранившимся организмам, которые сохранились в прошлых условиях окружающей среды. На самом деле, эти замороженные материалы могут отражать условия в течение обширных периодов времени, а исследование биологических материалов, хранящихся внутри, может дать представление о древней окружающей среде. Для надлежащего анализа этих экосистем и извлечения значимой биологической информации из мерзлых почв и льда необходим надлежащий сбор и обработка замороженных образцов. Это особенно важно для микробного анализа и анализа ДНК, поскольку присутствующие сообщества могут уникально отличаться от современных. Здесь представлен протокол успешного сбора и обеззараживания замороженных кернов. Как отсутствие колоний, используемых для легирования внешней поверхности, так и экзогенная ДНК позволяют предположить, что мы успешно обеззаразили замороженные керны и что обнаруженные микроорганизмы были из материала, а не из бурения или обработки кернов.

Введение

Криосферы (например, вечномерзлых грунтов, особенности льда, ледниковые снег, фирна и льда) предлагает заглянуть в какие типы организмов сохранялась при прошлых условиях окружающей среды. Так как эти подложки могут быть от десятков до сотен тысяч лет, их микробных сообществ, при сохранившейся заморожены с осаждения, отражают древние условия окружающей среды. Для того, чтобы надлежащим образом проанализировать эти экосистемы и извлечь полезную биологическую информацию из замороженного состояния почв и льда, правильного сбора и обработки замороженных образцов необходимо. Это имеет огромное значение , так как климатические прогнозы для 21 - го века указывают на потенциал выраженного потепления в Арктике и субарктических регионах 1. В частности, интерьер Аляски и Гренландии , как ожидается , чтобы нагреть приблизительно 5 ° C и 7 ° C, соответственно к 2100 году 2,3. Ожидается, что значительное влияние на почву и водные микробные сообщества, и, следовательно, связанной сбиогеохимические процессы. Более теплые температуры и измененное режим осадков , как ожидается , инициировать деградацию вечной мерзлоты во многих областях 2-5 потенциально может привести к более толстой, сезонноталого (активный) слой 6,7, оттаивание мерзлых грунтов, а таяние массивных ледяных тел , таких как льды, ледяные клинья, и сегрегации льда 8. Это позволит резко изменить биогеохимические атрибуты в дополнение к биоразнообразию растений и животных в этих экосистемах.

Ледниковых и сингенетические мерзлота осадка и льда особенности заманили в ловушку химических и биологических доказательств окружающей среды, представляющей то, что жил там в то время формировались особенности. Например, в интерьере Аляске, как Illinoisan и Висконсин в возрасте вечной мерзлоты присутствуют и это вечной мерзлоты, в частности, предоставляет уникальные места начиная от современных до 150000 лет до настоящего времени (YBP), которые содержат биологические и геохимические доказательства ИТПМкт прошлых климатических изменений на биоразнообразие. В результате, эти отложения обеспечивают запись биогеохимии и биоразнообразия в течение многих тысяч лет. Так как область имеет низкие цены отстаивание и никогда не таянии, нетронутые образцы доступны для сбора и анализа, либо сверлить вертикально в почвенном профиле или бурение горизонтально в туннелях. Что еще более важно, обширные записи существуют , которые особенно подчеркивают уникальные биогеохимические особенности вечной мерзлоты в этом регионе 9-14. В частности, применение ДНК-анализа для оценки наличия и степени биоразнообразия в обоих дошедших до наших дней и древних льдов и вечной мерзлоты образцов позволяет исследование взаимосвязи древних условий окружающей среды и среды обитания для оккупации конкретных организмов.

Предыдущие исследования выявили климатические воздействия на млекопитающих, растений и микроорганизмов из образцов , относящихся к 50k YBP 11, 15-19 лет, хотя каждое исследование использовали differeМетодология нт для сбора и обеззараживать вечной мерзлоты или ледяных кернов. В некоторых случаях, сердечники бурения стерилизовали 16, 20-21, хотя конкретная методология не уточнить , были ли чужеродной нуклеиновой кислоты также исключены из образцов. В других исследованиях, бактериальные изоляты 15 (например, Serratia marcescens), а также флуоресцентные микросферы 22 были использованы для измерения эффективности процедур дезактивации.

Этот эксперимент был частью более крупного исследования следственным микробных сообществ из образцов вечной мерзлоты, начиная с приблизительно 40k YBP. Конкретная цель этой части исследования состояла в том, чтобы успешно обеззараживать льда и вечной мерзлоты ядер. Насколько нам известно, ни одна методика не интегрировал использование растворов, предназначенных для устранения иностранных нуклеиновых кислот и связанных с ними нуклеазы из внешней части замороженных ядер. И это несмотря на то, что эти решения являются commonlу используется для обеззараживания лабораторного оборудования для молекулярных экспериментов.

После того, как сердечники были дезактивированы, геномную ДНК экстрагировали с использованием протоколов , разработанных Гриффитс и др. , 23 и Towe и др. 24, количественно с помощью спектрофотометра, и разбавляют стерильной, ДНК , свободной от воды , чтобы достичь 20 нг в реакции. Бактериальные гены 16S рРНК амплифицировали с праймерами 331F и 797R и зонд BacTaq 25 и архей генов 16S рРНК амплифицировали с использованием праймеров Arch 349F и Arch 806R и зонд ТМ Arch 516F 26 при следующих условиях: 95 ° С в течение 600 с последующим 45 циклов 95 ° C в течение 30 сек, 57 ° с в течение 60 сек и при 72 ° C в течение 25 сек с конечным удлинением при 40 ° с в течение 30 сек. Все реакции КПЦР проводились в двух экземплярах. В 20 мкл объемы реакции включали 20 нг ДНК, 10 мкМ праймеров, 5 мкМ зонда и 10 мкл реакционной смеси КПЦР. Стандарты FOг бактериальных и архейного КПЦР были приготовлены с использованием геномной ДНК из Pseudomonas Шогезсепз и Halobacterium Салинарум соответственно. Оба были выращены до логарифмической фазы. отсчеты Пластинчатые были проведены и ДНК выделяли из культур. Геномную ДНК количественно с помощью спектрофотометра с предположением одного и шести копий гена 16S рРНК на геном для Н. Салинарум и P. Шогезсепз соответственно 27-28. были вычислены числа копий бактериальных и архей генов на основе стандартной кривой, логарифмирована для учета неравных отклонений между курсами лечения, и оценены ANOVA.

Состав сообществ определяли путем секвенирования гена 16S рРНК с использованием клеток потока и технологии усиления моста и анализа сообществ с "количественным проникновения в микробной экологии» (QIIME) 29. Вперед и обратного чтения были соединены вместе, а затем последовательности были отфильтрованы, индексированные,а также представители высокого качества были отобраны для De Novo операционные таксономические единицы (ОТУ) назначение через выравнивания последовательностей с эталонной базой данных. Выровненных последовательностей сравнивали с отдельной справочной базы данных для таксономического назначения. Таблица ОТУ уровень филюм был создан для определения общего состава сообщества.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка оборудования и мерзлотоведения Основные коллекции

  1. Оборудование для подготовки и отбора проб на местах и ​​сохранение передач
    1. Собрать бур для взятия пробы, вставив адаптер диска в верхней части ствола и поворачивая рычаг, чтобы зафиксировать его на месте. Pin адаптер трубку на адаптер привода и пин-код двигателя на адаптер трубки. Вставьте резцы на бочке.
    2. Носите легкие костюмы долг, нитриловые перчатки и маски, чтобы уменьшить любое загрязнение к образцам. Пользуйтесь средствами защиты слуха и каски для безопасности при входе в туннель мерзлотоведения (Рисунок 1).
    3. Введите туннель и выберите место для сбора образцов (рис 1В).
      Примечание: Для вертикального или горизонтального расположения бурения, выберите область , где , как известно , доказательства того, что материал в замороженном состоянии (например, лед или вечной мерзлоты), нет известных крупных корневых систем, и нет никакого известного гравия. Убрать всеживой растительный материал из области перед сбором пробы. При бурении по вертикали или горизонтали, выберите область, которая является относительно плоской и доступной с шнеком.
    4. Подготовьте рабочую станцию ​​отводками землю с пластмассовым материалом, который был стерилизован с 70% изопропанола, ДНК деконтаминации раствора и обеззараживающим раствором РНКазы.
    5. Поместите 10 см диаметр поливинилхлорид (ПВХ), резать трубу вдоль пополам на рабочей станции, чтобы обеспечить желоб для хранения стержней, как они будут удалены из бура. Дезактивацию трубы ПВХ с 70% изопропилового спирта, ДНК обеззараживание раствором и обеззараживающим раствором РНКазы.
    6. Рядом с рабочей станции, обеззараживают шнек путем распыления его с 70% изопропанола, ДНК обеззараживание раствором и обеззараживающим раствором РНКазы. Удалить из решения шнек с вытирания.
  2. коллекция кернов льда и вечной мерзлоты и хранение
    1. Выберите область стены к образцу (см 1.2.1Заметка).
    2. Обеззараживайте примерно 10 см в диаметре замороженной области стенки, протерев его 70% изопропанола, ДНК обеззараживание раствором и обеззараживающим раствором РНКазы.
    3. Поднимают Очищенное шнек на интересующей области таким образом, чтобы она была перпендикулярна к площади образца и начать бурение на очищаемой поверхности стенки (рис 1C, D).
    4. Осторожно снимите шнек из области отбора проб. Отсоедините шнек от двигателя и поместите шнек над стерильной ПВХ трубы в чистой рабочей станции. Осторожно наклоните шнек таким образом, чтобы замороженные ядра выскользнуть на стерильном трубы из ПВХ (рис 1E).
    5. Обеззараживайте перчатки с 70% изопропанола, ДНК обеззараживание раствором и обеззараживающим раствором РНКазы.
    6. Возьмите льда и вечной мерзлоты ядер с стерильных перчатках и поместить их в стерильные пакеты.
    7. Поместите ядер в более прохладном или холодном помещении, пока они не будут отправлены или обработаны.
    8. Ш.И.П. замороженных ядер с использованием сухого льда, чтобы поддерживать их при температуре ниже 0 ° C.
    9. Сразу хранить сердечников при -80 ° С.

2. мерзлота и ядро ​​обработки льда

  1. Подготовка материала
    1. Приготовьте стерильную нуклеиновой кислоты свободный сверхмощный алюминиевой фольги, металлические стеллажи, изделия из стекла, металла, пинцет и стекловату путем обжига в печи при температуре 450 ° С в течение 4 ч. Отложите эти материалы пока не используется.
    2. Стерилизуют 95% этанола и сверхчистой воды, пропусканием раствора через фильтр с размером пор 0,22 мкм.
    3. раствор этанола Хранить при -20 ° C и воды при 4 ° С.
    4. Стерилизовать пластиковая линейка путем распыления его с 70% -ным этанолом, ДНК деконтаминации раствора и РНКазы обеззараживание раствором и сразу же после того, как протирки каждого раствора.
  2. Бактериальная культура Подготовка
    1. Приготовьте бульон и пластины для роста Serratia marcescens.
      1. Для бульона, смешайте 5 г попробоватьptone, 1 г глюкозы, 5 г дрожжевого экстракта и 1 г двухосновного фосфата калия, а затем добавить дистиллированную воду, чтобы достигнуть 1 L. Для того, чтобы плиты, добавить 15 г агар вышеуказанной смеси. Для бульона и пластин, довести рН до 7 и автоклаве при температуре 121 ° С в течение 15 мин.
    2. Приготовьте 1х фосфатный отшлифованной физиологический раствор (PBS) путем объединения 8 г хлорида натрия, 0,2 г хлорида калия, 1,44 г двухосновного фосфата натрия и 0,24 г одноосновного фосфата калия и добавить дистиллированную воду, чтобы достигнуть 800 мл. Регулировка рН до 7,4 и добавляют дистиллированную воду до достижения 1 л автоклаве при температуре 121 ° С в течение 15 мин.
    3. Инокулируйте бульон стерильной петлей путем погружения в S. marcescens культура , которая была ранее хранили замороженными при -80 ° С. В асептических условиях, серийный разбавленный культуру путем добавления 1 мл культуры в 9 мл PBS и вручную инвертировать решение. Добавить 1 мл этого раствора до 9 мл PBS и вручную инвертировать решение. Повторите еще ​​восемь раз до 10 -9 diluние достигается.
    4. Разведите 10 -6, 10 -7, 10 -8 и 10 -9 решений на чашках с агаром, распределяя по 1 мл бульона на тарелку и распространения с сотовым распределителю. Делайте это в трех экземплярах на разведение. Хранить исходную культуру при температуре 4 ° С.
    5. Инкубируйте пластин при 30 ° С в течение 24 ч. Подсчитайте число колоний, чтобы подсчитать число клеток в исходной культуре. Примечание: Число колоний в исходной культуре, будет зависеть от скорости роста бактерий.
    6. Пипеткой 250 мкл исходной культуры в стерильный 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Развести оригинальную культуру, добавив достаточное количество объема 1x PBS , чтобы получить приблизительно 10 9 клеток / мл , как определено по количеству колоний в предыдущем шаге. Гранул клеток в микроцентрифужных трубки центрифугированием при 2500 х г в течение 10 мин.
      Примечание: Объем 1x PBS будет варьироваться в зависимости от скорости роста бактерий.
    7. В стерильную biohood, Пипеткой от бульона и ресуспендирования клеток в 1 мл буфера PBS 1x. Хранить при температуре 4 ° С до использования или примерно двух месяцев.
    8. В день обработки, разбавить S. marcescens культуры с этапа 2.2.7 путем добавления 1 мл исходной S. marcescens культуры до 39 мл PBS буфера 1х в центрифужную пробирку на 50 мл.
  3. Подготовьте холодной комнате пространство для обработки и сохранения основного снаряжения
    1. Перед охлаждая холодной комнаты, чистые стены, полы, и металлический стол с 1% -ным раствором хлорной извести.
    2. Заданное значение температуры холодильной камеры до приблизительно -11 ° С.
    3. После того, как холодная комната достигла желаемой температуры, носить светлые костюмы дежурстве, нитриловые перчатки и маски, чтобы уменьшить любые загрязнения в холодной комнате и образцов.
      Примечание: Два правильно одетые лица, необходимые для этой процедуры.
    4. Принесите стерильных материалов (например, алюминиевая фольга, металлические стеллажи, изделия из стекла, поднос, S. marcescens культуры и миcrotome лезвие) и образцы в холодной комнате и место на стерильном столе.
  4. Мерзлота и обработки кернов льда в холодном помещении объекта
    1. Поместите ядро ​​мерзлоты на стерильном нуклеиновой кислоты свободного листа алюминиевой фольги.
    2. Слегка инокуляции вне ядра с разбавленной культуры S. marcescens с помощью стерильной пены пробку (рис 2B).
    3. Поместите ядро ​​на стерильную металлическую стойку, которая находится над лотком.
    4. Стерилизовать стали микротома лезвие с 70% -ным этанолом, ДНК обеззараживание раствором и обеззараживающим раствором РНКазы.
    5. Имеют индивидуальные чистый нитриловые перчатки с 70% -ным этанолом, ДНК обеззараживание раствором и обеззараживающим раствором РНКазы и удерживать ядро ​​на 45 ° над тарелкой.
    6. Имеют индивидуальные Б аккуратно соскрести примерно 5 мм от внешней стороны всей сердцевины, в том числе на концах, с помощью стерильного лезвия в то время как Физическое лицо поворачивается ядро ​​после каждого соскоба ( Фигуры 2С и 3А, В). Протрите лезвие с 70% -ным этанолом, ДНК обеззараживание раствором и обеззараживающим раствором РНКазы по мере необходимости.
    7. Имеют индивидуальные Б вылить стерилизовали с помощью фильтра 95% этанола на сердечник тщательно и быстро, в то время как Физическое лицо поворачивает сердечник как раствор вливают (цифры 2D, 3С).
    8. Имеют индивидуальные B немедленно промойте сердцевину с стерилизованным фильтрацией воды.
    9. Заменить использовали металлические стойки на лотке с новой стерильной металлической стойке.
    10. Иметь Физическое лицо очистить свои нитриловые перчатки с 70% -ным этанолом, ДНК обеззараживание раствором и обеззараживающим раствором РНКазы и удерживать ядро ​​на 45 ° над тарелкой.
    11. Имеют индивидуальные B распылить всю сердцевину с ДНК обеззараживание раствором.
    12. Имеют индивидуальные B немедленно промойте сердцевину с стерилизованным фильтрацией воды.
    13. Имеют индивидуальные B распылить весь сердечник с обеззараживающим раствором РНКазы.
    14. Есть индивидуаль B немедленно промойте сердцевину с стерилизованным фильтрацией воды.
    15. Поместите сердечник на стерильный лист алюминиевой фольги и слегка завернуть.
  5. Оттепель внешнее ядро
    1. Поместите стерильную металлическую стойку над стерильную стеклянную посуду в стерильном biohood с ламинарным потоком.
    2. Поместите два агаром , специфичные для S. marcescens в стеклянную посуду ниже стерильной стойки для сбора жидкости из ядра (рис 2E).
    3. Поместите ядро ​​на стерильной металлической стойке.
    4. Разрешить примерно 2-5 мм от внешней поверхности сердечника оттаивают при 23 ° C (в среднем, это будет происходить в течение примерно 10 мин). Поверните ядро ​​примерно на 90 ° через каждые 2 мин.
    5. Тампон всю поверхность сердечника с использованием стерильного пинцета и стерильную стекловату и прививают два агаром специфичные для S. marcescens моечные этих материалов на поверхность пластин. Инокулируйте две новые пластинки с оригинальной культурой используется для легирования с внешней поверхностиядро, которое подвергали воздействию низких температур холодной комнате.
    6. Измерьте наружные размеры талой цилиндрического сердечника путем размещения стерильный линейки рядом, но не касаясь ядра.
    7. Поместите сердечник в большой стерильный пакет и хранить его при температуре -80 ° С.
  6. Проверьте для роста
    1. Выдержите агаром при 23 ° С в течение одной недели.
    2. Изучение агаром для роста S. marcescens колонии.
      1. Если нет видимых колоний на пластине, перейдите к шагу 2.5.3.
      2. Если колонии появляются на тарелку, повторите процедуру с шага 2.1.1 в разделе 2 "мерзлота и обработки кернов льда".
    3. Получить ядро ​​от морозильной камеры и асептически перенести его в стерильный пакет.
    4. Хранить ядро ​​в стерильном пакете при температуре 4 ° С в течение приблизительно 24-48 ч, чтобы растопить весь сердечник.

3. Получение подвыборки для Нуклеиновой Кислоты экстракции из кернов льда и вечной мерзлоты

  1. выделения нуклеиновых кислот из кернов льда
    1. Смешайте талой материал из керна льда, осторожно перемешивая мешок (рис 2G).
    2. Налейте размороженного материал в стерильный контейнер с фильтром 0,22 мкм в вакууме для сбора микроорганизмов.
    3. Консерванта удалить фильтр стерильным пинцетом и поместить его в стерильный 2 мл керамический шарик трубки (1,4 мм).
    4. Хранить фильтр при -80 ° С.
  2. выделения нуклеиновых кислот из вечной мерзлоты ядер
    1. Смешайте талой материал из сердцевины вечной мерзлоты, аккуратно замешивать сумку.
    2. После того, как вечная мерзлота была хорошо перемешана, получить подвыборки приблизительно 0,5 г сыпучего грунта со стерильным Кулинарная лопатка и поместить его в взвешенную стерильные 2 мл керамический шарик с завинчивающейся крышкой трубки (1,4 мм), который находится в вертикальном положении на балансе.
    3. Хранить подвыборки при -80 ° С.
    4. Получить гравиметрический содержание воды образцов.
      1. Мера 10 г вечной мерзлоты с Sterilе Кулинарная лопатка и место в тарированный олова на весах. Измерьте влажную массу вечной мерзлоты и олова.
      2. Выдержите вечной мерзлоты в печи при температуре 105 ° С в течение 24 ч. Мера сухой массы вечной мерзлоты и олова.
      3. Рассчитывают гравиметрический содержание воды путем вычитания Влажную массу мерзлоты по сухой массе вечной мерзлоты и деления на сухую массу вечной мерзлоты.
    5. Хранить мерзлота при -80 ° С.

4. Извлечение нуклеиновых кислот из мерзлотоведения и кернов льда

  1. подготовка материала
    1. Подготовка янтарный ампул для хранения растворов путем обработки 0,1% диэтилпирокарбоната (DEPC), инкубирование O / N при 37 ° С, и автоклавирования.
    2. Подготовьте 240 мМ раствор калий-фосфатного буфера. Добавить 2. 5 г одноосновного фосфата калия и 38,7 г двухосновного фосфата калия. Отрегулировать конечный объем до 500 мл добавлением стерильной воды.
    3. Подготовить гексадецилтриметиламмоний бромид (СТАВ) экстракции БУФFER путем растворения 4,1 г хлорида натрия в 80 мл воды и медленно добавляя 10 г СТАВ при нагревании и перемешивании. Отрегулировать конечный объем до 100 мл добавлением стерильной воды.
    4. Добавить равные объемы раствора фосфатного буфера и СТАВ-буфера и фильтр стерилизуют с использованием фильтра 0,22 мкм. Накройте бутылку с алюминиевой фольгой и хранить при комнатной температуре.
    5. Готовят 1,6 М раствор хлорида натрия (NaCl) путем объединения 9,35 г NaCl и 100 мл стерильной воды. Добавьте 10 г полиэтиленгликоль 8000 к раствору и фильтра стерилизуют 1,6 М NaCl. Хранить при температуре 4 ° С.
  2. Выделения нуклеиновых кислот в соответствии с модифицированной версией Гриффитс и др. 22 и Towe и др. 23
    1. Носите легкие костюмы дежурстве, нитриловые перчатки и маски. Чистая лаборатория пространство и пипец с 70% -ным этанолом, ДНК обеззараживание раствором и обеззараживающим раствором РНКазы.
    2. Удалить подвыборки (фильтр из керна льда или вечной мерзлоты образца почвы) в 2 мл керамический шарик винт-цар трубки от -80 ° C морозильника и оттаивания при комнатной температуре.
    3. Добавить 0,5 мл гексадецилтриметиламмония бромида (СТАВ) буфера для экстракции и вихрем кратко.
    4. Добавить 0,5 мл фенола-хлороформа-изоамиловый спирт (25: 24: 1) (рН 8) и встряхните трубки в горизонтальном направлении в течение 10 мин с помощью адаптера с плоской панелью в вихревом.
    5. После бусинка избиение, центрифужные пробирки при 16100 мкг в течение 5 мин при 4 ° С.
    6. Удалить водный слой на новый стерильный 1,5 мл трубки и смешивают с равным объемом хлороформа-изоамиловый спирт (24: 1). Центрифуга при 16100 мкг в течение 5 мин при 4 ° С.
    7. Удалить водный слой на новый стерильный 1,5 мл трубки и добавляют два объема 30% полиэтиленгликоля 8000 и 1,6 М NaCl. Инкубировать в течение 2 часов при температуре 4 ° С.
    8. Центрифуга при 16100 мкг в течение 10 мин при 4 ° С.
    9. Промыть гранулу нуклеиновой кислоты с приблизительно 500 мкл охлажденного льдом 70% этанола и центрифугируют при 16100 х г в течение 10 мин при 4 ° C.
    10. Воздух сухой осадок в стерильной biohood в течение 2 часов, Ресуспендируют в 50 мкл ДНКазы / РНКазы ТЕ-буфера (рН 8,0). ДНК готова для последующих применений, таких как ПЦР и КПЦР.
    11. Определить концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра.
    12. Развести ДНК стерильной, ДНК без воды для достижения 20 нг на реакцию.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Представленный метод может быть использован для деконтаминации замороженных образцов, собранных из различных криосферы средах, от ледникового льда вечной мерзлоты. Здесь мы приводим данные , специально собранные от льда и вечной мерзлоты образцов , собранных из инженерного Центра исследований и разработок - в холодных регионах научно-инженерной лаборатории (ERDC-CRREL) мерзлота тоннеля , расположенного в Fox, АК (рис 1А и 1В). Мерзлота тоннель проходит п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Криосфера предлагает доступ к сохранившимся организмов, которые сохранялись при прошлых условиях окружающей среды. Хотя восстановленный таксонов не может представлять собой полное историческое сообщество, те извлекают из анализа ледниковых льдов и вечной мерзлоты образцов может дать ценную историческую информацию о некоторых периодах времени 15-16. Например, значимые биологические данные были взяты из ледяных исследованиях , посвященных анаэробной активности в ледяного покрова Гренландии 20 и мерзл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была профинансирована через Центр инженерных исследований и разработок армии США, Офис программы фундаментальных исследований. Разрешение на публикацию данной информации было предоставлено начальником инженерной службы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Научно-исследовательский институт снега, льда и вечной мерзлоты Auger (SIPRE), Фэрбенкс, AK
70% изопропанолаWalmart551116880
95% этилового спирта (денатурированного) Fisher Scientific, Питтсбург, ПенсильванияA407-4
, DNA AwayMolecular Bio-Products, Inc., Сан-Диего, Калифорния7010
раствор для обеззараживания РНКазы, RNase AwayMolecular Bio-Products, Inc., Сан-Диего, Калифорния;7002
Легкие костюмыKimberly-Clark Professional, Розуэлл, Джорджия10606
Нитриловые перчаткиFisher Scientific, Питтсбург, ПенсильванияFFS-700
Противовирусные маскиCurad, WalgreensCUR3845
Стерильные пакеты для образцов Nasco, Форт Аткинсон, WIB01445
Стальное лезвие для микротома Микронож B-Sharp, Wake Forest,
изготовлена в CRREL, Ганновер, NH
TrayHandy Paint Products, Чанхассен, MN7500-CC
Алюминиевая фольгаWestern Plastics, Темекула, CA
500 мл Бутылка с 0,22  μ m FilterCorning, Corning, штат Нью-Йорк430513
Serratia marcescensATCC, Манассас, Вирджиния17991
Biosafety HoodNuAire, Плимут, МиннесотаNU-425-400
Чашка ПетриFisher Scientific, Питтсбург, ПенсильванияFB0875712
ATCC Agar 181- TryptoneAcros Organics, Нью-Джерси61184-5000
ATCC Агар 181- ГлюкозаFisher Scientific, Питтсбург, ПенсильванияBP381-500
ATCC Агар 181- Дрожжевой экстрактFisher Scientific, Питтсбург, ПенсильванияBP1422-500
ATCC Агар 181- ДикалийфосфатJT Baker, Филлипсбург, Нью-Джерси3252-01
ATCC Агар 181- АгарDifco, Спаркс, MD214530
NanoDrop 2000 УФ-ВИД спектрофотометрThermo Fisher Scientific, Уилмингтон, DE
Lightcycler 480 SystemRoche Molecular Systems, Inc., Индианаполис, IN
Halobacterium salinarumAmerican Type Culture Collection (ATCC), Манассас, VA<
em>Pseudomonas fluorescensAmerican Type Culture Collection (ATCC), Манассас, Вирджиния
Набор для выделения микробной ДНКMoBio Laboratories, Карлсбад, Калифорния12224-50
Защита органов слухаElvexEP-201
Каска
KimwipesKimberly-Clark Professional, Розуэлл, Джорджия34705
СтекловатаPyrex430330
Линейка
Весовое олово Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания08-732-100
Хлорид натрияSigma Aldrich, Сент-Луис, МиссуриS-9625
Хлорид калияJT Baker, Филлипсбург, Нью-Джерси3040-04
Фосфат калия, одноосновнойJT Baker, Филлипсбург, Нью-Джерси; 3246-01
Фосфат калия, двухосновнойJT Baker, Филлипсбург, Нью-Джерси3252-01
Фосфат натрия двухосновный, безводныйFisher Scientific, Питтсбург, ПенсильванияBP332-500
50 мл Центрифужные пробиркиCorning, Corning, Нью-Йорк4558
мл Микроцентрифужные пробиркиMoBio Laboratories, Карлсбад, Калифорния1200-250-T
2 мл Керамические бусины (1.4  mm)MoBio Laboratories, Carlsbad, CA13113-50
ScoopulaThermo Fisher Scientific, Wilmington, DE1437520
BalanceOhaus, Parsippany, NJE12130
Диэтилпирокарбонат (DEPC)Sigma Aldrich, Сент-Луис, MOD5758
Гексадецилтриметиламмонамбромид (CTAB) Acros Organics, NJ22716-5000
Полиэтиленгликоль 8000 Sigma Aldrich, Сент-Луис, МиссуриP5413-1KG
Фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (25:24:1) (pH 8) Fisher Scientific, Питтсбург, PABP1752-400
ЦентрифугаEppendorf, Хауппаг, Нью-Йорк5417R
Хлороформ-изоамиловый спирт (24:1)Sigma Aldrich, Сент-Луис, MOC0549-1PT
TE BufferAmbion (Thermo Fisher), Уилмингтон, DEAM9860
PipetsRainin, Woburn, MAPipet Lite XLS, 2, 10, 200 и 1,000 µ l пипетки
Наконечники для пипетокRainin, Woburn, MARainin LTS предварительно стерилизованные, с низким удержанием, фильтрованные наконечники, 10, 20, 200, 1,000  &микро; l
VortexorScientific Industries, Богемия, Нью-ЙоркG-560
Вихревой адаптерMoBio Laboratories, Карлсбад, Калифорния13000-V1
Прозрачный бутылочныйCorning, Corning, Нью-ЙоркC1395500
Янтарный бутылочныйCorning, Corning, Нью-ЙоркC5135250
Фильтры на крышке бутылки, 0.22  &микро; mCorning, Корнинг, Нью-Йорк430513
60 мл ШприцBecton, Dickenson and Company, Франклин Лейкс, Нью-ДжерсиBD 309653
Millex Шприцевые фильтры, 0,22 μ mEMD Millipore, Биллерика, МассачусетсSLGV033RB
70% этанолFisher Scientific, Питтсбург, ПенсильванияBP2818-500разбавленный и стерилизованный с фильтром
Isotemp 100 л ДуховкаFisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания151030511
разбрасыватель ячеекFisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания08-100-10
Одноразовые петли для инокуляцииFisher Научный, Питтсбург, Пенсильвания22-363-602
Раствор для обеззараживания ДНК металлическая стойка NC 2

Ссылки

  1. Intergovernmental Panel on Climate Change. Climate Change 2007: The Physical Science Basis. Solomon, S., et al. , Cambridge University Press. Cambridge, United Kingdom. (2007).
  2. Marchenko, S., Romanovsky, V., Tipenko, G. Numerical Modeling of Spatial Permafrost Dynamics in Alaska. Proc. Ninth Int. Conferen. Permafr. University of Alaska Fairbanks, 29, 1125-1130 (2008).
  3. Intergovernmental Panel on Climate Change. Climate Change 2014: Synthesis Report. Contributions of Working Groups I, II, and III to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. Pachauri, R. K., Meyer, L. A. , Intergovernmental Panel on Climate Change. Geneva, Switzerland. (2007).
  4. Osterkamp, T. E., Romanovsky, V. E. Evidence for warming and thawing of discontinuous permafrost in Alaska. Permafr. Periglac. Process. 10 (1), 17-37 (1999).
  5. Wolken, J. M., et al. Evidence and implications of recent and projected climate change in Alaska's forest ecosystems. Ecosphere. 2 (11), 1-35 (2011).
  6. Hinzman, L. D., Kane, D. L., Gieck, R. E., Everett, K. R. Hydrologic and thermal properties of the active layer in the Alaskan Arctic. Cold Reg. Sci. Technol. 19 (2), 95-110 (1991).
  7. Hinzman, L. D., Goering, D. J., Kane, D. L. A distributed thermal model for calculating temperature profiles and depth of thaw in permafrost regions. J. Geophys. Res.: Atmos. 103 (D22), 28975-28991 (1998).
  8. Osterkamp, T. E., Jorgenson, J. C. Warming of Permafrost in the Arctic National Wildlife Refuge. Alaska. Permafr. Periglac. Process. 17, 65-69 (2006).
  9. Petrone, K. C., Jones, J. B., Hinzman, L. D., Boone, R. D. Seasonal export of carbon, nitrogen, and major solutes from Alaskan catchments with discontinuous permafrost. J. Geophys. Res. 111, G02020(2006).
  10. Guo, L., Ping, C. -L., Macdonald, R. W. Mobilization pathways of organic carbon from permafrost to arctic rivers in a changing climate. Geophys. Res. Lett. 34 (13), L13603(2007).
  11. Katayama, T., et al. Phylogenetic analysis of bacteria preserved in a permafrost ice wedge for 25,000 years. Appl. Environ. Microbiol. 73 (7), 2360-2363 (2007).
  12. Katayama, T., et al. Glaciibacter superstes gen. nov., sp. nov., a novel member of the family Microbacteriaceae isolated from a permafrost ice wedge. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 59, 482-486 (2009).
  13. Waldrop, M. P., White, R., Douglas, T. A. Isolation and identification of cold-adapted fungi in the Fox Permafrost Tunnel, Alaska. Proc. Ninth Int. Conferen. Permafr. , 1887-1891 (2008).
  14. Douglas, T. A., et al. Biogeochemical and geocryological characteristics of wedge and thermokarst-cave ice in the CRREL Permafrost Tunnel. Alaska Permafr. Periglac. Process. 21 (2), 120-128 (2011).
  15. Willerslev, E., et al. Diverse plant and animal genetic records from Holocene and Pleistocene sediments. Science. 300 (5620), 791-795 (2003).
  16. Bellemain, E., et al. Fungal palaeodiversity revealed using high-throughput metabarcoding of ancient DNA from Arctic permafrost. Environ. Microbiol. 15 (4), 1176-1189 (2013).
  17. Steven, B., Pollard, W. H., Greer, C. W., Whyte, L. G. Microbial diversity and activity through a permafrost/ground ice core profile from the Canadian high Arctic. Environ. Microbiol. 10 (12), 3388-3403 (2008).
  18. Lorenzen, E. D., et al. Species-specific responses of Late Quaternary megafauna to climate and humans. Nature. 479 (7373), 359-364 (2011).
  19. Wilhelm, R. C., Radtke, K., Mykytczuk, N. C. S., Greer, C. W., Whyte, L. G. Life at the wedge: The activity and diversity of Arctic ice wedge microbial communities. Astrobiol. 12 (4), 347-360 (2012).
  20. Sheriden, P. P., Miteva, V. I., Brenchley, J. E. Phylogenetic analysis of anaerobic psychrophilic enrichment cultures obtained from a Greenland glacier ice core. Appl. Environ. Microbiol. 69 (4), 2153-2160 (2003).
  21. Rivkina, E., et al. Biogeochemistry of methane and methanogenic archaea in permafrost. FEMS Microbiol. Ecol. 61 (1), 1-15 (2007).
  22. Juck, D. F., et al. Utilization of fluorescent microspheres and a green fluorescent protein-marked strain for assessment of microbiological contamination of permafrost and ground ice core samples from the Canadian High Arctic. Appl. Environ. Microbiol. 71 (2), 1035-1041 (2005).
  23. Griffiths, R. I., Whiteley, A. S., O'Donnell, A. G., Bailey, M. J. Rapid method for coextraction of DNA and RNA from natural environments for analysis of ribosomal DNA- and rRNA-based microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 66 (12), 5488-5491 (2000).
  24. Töwe, S., et al. Improved protocol for the simultaneous extraction and column-based separation of DNA and RNA from different soils. J. Microbiol. Methods. 84 (3), 406-412 (2011).
  25. Nadkarni, M. A., Martin, F. E., Jacques, N. A., Hunter, N. Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad range (universal) probe and primers set. Microbiol. 148, 257-266 (2002).
  26. Takai, K., Horikoshi, K. Rapid detection and quantification of members of the archaeal community by quantitative PCR using fluorogenic probes. Appl. Environ. Microbiol. 66 (11), 5066-5072 (2000).
  27. Fogel, G. B., Collins, C. R., Brunk, C. F. Prokaryotic genome size and SSU rDNA copy number: Estimation of microbial relative abundance from a mixed population. Microb. Ecol. 38, 93-113 (1999).
  28. Bodilis, J., Nsigue-Meilo, S., Besaury, L., Quillet, L. Variable copy number, intra-genomic heterogeneities and later transfers of the 16S rRNA gene in Pseudomonas. PLOS One. 7, e35647(2012).
  29. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
  30. Sellmann, P. V. Geology of the USA CRREL permafrost tunnel, Fairbanks, Alaska. US Army Cold Reg. Res. Eng. Lab. Technical Rep. 199. , New Hampshire. (1967).
  31. Sellmann, P. V. Additional information on the geology and properties of materials exposed in the USA CRREL permafrost tunnel. US Army CRREL Special Rep. , (1972).
  32. Christner, B. C., Mikucki, J. A., Foreman, C. M., Denson, J., Priscu, J. C. Glacial ice cores: A model system for developing extraterrestrial decontamination protocols. Icarus. 174 (2), 572-584 (2005).
  33. Mackelprang, R., et al. Metagenomic analysis of a permafrost microbial community reveals a rapid response to thaw. Nature. 480 (7377), 368-371 (2011).
  34. Champlot, S., et al. An efficient multistrategy DNA decontamination of PCR reagents for hyper sensitive PCR applications. PLoS One. 5 (9), e13042(2010).
  35. Yergeau, E., Hogues, H., Whyte, L. G., Greer, C. W. The functional potential of high Arctic permafrost revealed by metagenomic sequencing, qPCR, and microarray analyses. The ISME J. 4 (9), 1206-1214 (2010).
  36. Welzl, G., Schloter, M. Bacterial community structure in soils of the Tibetan Plateau affected by discontinuous permafrost or seasonal freezing. Biol. Fertil. Soils. 50 (3), 555-559 (2014).
  37. Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol. Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
  38. Wagner, D., Kobabe, S., Liebner, S. Bacterial community structure and carbon turnover in permafrost-affected soils of the Lena Delta, northeastern Siberia. Can. J. Microbiol. 55 (1), 73-83 (2009).
  39. Jiang, N., et al. Characteristic microbial communities in the continuous permafrost beside the bitumen in Qinghai-Tibetan Plateau. Environ. Earth Sci. 74, 1343-1352 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Serratia marcescens16S

Похожие статьи