Мы представляем простые методы для выделения гигантских транскрипционно активных хромосом lampbrush из живых яйцеклеток лягушек и саламандр. Мы опишем , как соблюдать эти хромосомы "живой" с помощью фазового контраста или дифференциального интерференционного контраста, и как установить их для флуоресцентной гибридизации на месте или иммунофлуоресцентного окрашивания.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение Giant хромосомы типа ламповых щёток из живых ооцитов Лягушки и саламандры
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Описаны методы изучения гигантских транскрипционно активных хромосомы типа ламповых щёток (LBCS), найденный в ооцит или unlaid яйца, лягушек и саламандр. Индивидуальные LBCS может быть до 1 мм в длину, и они находятся в гигантском ядре, сама до 0,5 мм в диаметре. Большой размер хромосом позволяет беспрецедентные наблюдения активных генов с помощью световой оптической микроскопии, но в то же время специальные методы, необходимые для выделения ядра, удаление ядерной оболочки, и распространяя хромосомами на предметное стекло микроскопа. Ядро ооцита, также называется зародышевым пузырьком (GV), выделяют в среде, которая допускает частичное гелеобразование ядерного актина и сохраняет нежную структуру LBCS. Этот шаг выполняется вручную под микроскопом рассекает с помощью щипцов ювелира. Далее, ядерная оболочка удаляется, опять же вручную с помощью пинцета ювелира. Ядерные содержимое быстро переносили в среду, что dispeRSES гель актина и позволяет неповрежденные LBCS обосноваться на предметное стекло микроскопа. На этом этапе LBCS и другие ядерные органеллы могут быть просмотрены с помощью фазового контраста или дифференциального интерференционного контрастного микроскопа, хотя более тонкие детали затемнены броуновским движением. Для высокого разрешения наблюдения микроскопического или молекулярного анализа, весь препарат центрифугируют, чтобы прикрепить тонкие LBCS плотно к каретке. Краткая фиксация в параформальдегида затем следуют иммунофлуоресцентного окрашивания или гибридизация в. LBCS находятся в транскрипционно активном состоянии, и их огромный размер позволяет молекулярный анализ на индивидуальном уровне генов с помощью конфокальной или супер-разрешением микроскопии.
Введение
Большинство позвоночных животных, за исключением сумчатых и плацентарных млекопитающих, производят большие yolky яйца. Несмотря на их иногда огромных размеров, эти яйца отдельные клетки, которые достигают их окончательный размер в то же время в яичнике самки. Яичниковые яйца называются ооциты , и каждый , как правило , содержит одно гигантское ядро, известное с начала 19 - го века как зародышевым пузырьком или просто GV. 1 ооцитов обычных лабораторных лягушек, Xenopus Laevis и Xenopus tropicalis, достигают максимального диаметра 1,2 мм и 0,8 мм соответственно (рис 1). В GVs из зрелых ооцитов этих двух лягушки 0....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Общая информация о лягушках и саламандр, а также источники животных, можно найти на следующих сайтах: Xenbase (http://www.xenbase.org) и Sal-сайта (http://www.ambystoma.org). Этот протокол следует рекомендациям по уходу за животными Департамента эмбриологии Института Карнеги по науке.
1. Решения
- Сделать 10 л "лягушки вода": Добавляют 10 мл 1 М CaCl 2 и 10 мл 1 М раствором NaHCO 3 до 10 л деионизованной или дехлорированная H 2 O при перемешивании.
- Сделать 1 л 20% параформальдегида: заварить 1 л 4 мМ Na 2 CO 3. В химической капот добавить 200 г порошкообразного пара....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Для того, чтобы исследовать гигантские хромосомы типа ламповых щёток один начинается с выделения ооцитов из лягушки или саламандры. На рисунке 1 показана группа зрелых ооцитов в буферном солевом растворе после удаления из яичника лягушки, Xenopus. Такие ооциты остаются в хорошем состоянии в течение нескольких дней при комнатной температуре. Ядро (или зародышевым пузырьком) затем удаляют из ооцита с пинцетом ювелира, либо в солевом растворе (рис 2)
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Первые наблюдения «живых» LBCS из рук-изолированные GvS лягушек и саламандр были сделаны около 80 лет назад американский биолог Уильям Duryee, 19 до введения фазового контраста и ДИК микроскопии перед флуоресцентным иммунным окрашиванием и перед FISH. Преимущества LBCS для исследования деталей структуры хромосом и транскрипции на уровне отдельных генов, необходимого развития техники для прикрепления LBCS к стеклах, чтобы зафиксировать их в реалистичное образом, и применять молекулярные методы, не разрушая их .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Исследование, о котором сообщается в этой публикации, было поддержано Национальным институтом общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения под номером R01 GM33397. Ответственность за содержание лежит исключительно на авторах и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения. J.G.G. является профессором генетики развития Американского онкологического общества.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Параформальдегид (реагентный класс, кристаллический) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Несмотря на предупреждения во многих протоколах, концентрированный раствор может храниться неограниченное время в RT |
| Этил3-аминобензоатметансульфонат | Sigma-Aldrich | A5040-100G | Иногда упоминается как MS-222 |
| Ethicon RB-1 1/2 круг конус 3-0 швов | VWR | 95057-000 | |
| Парапласт (парафин) | Sigma-Aldrich | P3558-1KG | |
| em>p-Фенилендиамин | Sigma-Aldrich | P6001 | |
| Желатин | Продуктовый магазин | Коммерческий Knox желатин работает отлично | |
| ProLong Gold антивыцветающий монтант | ThermoFisher Scientific | P10144 | |
| Защитное стекло Gold Seal 22 x 22 мм #1 1/2 (толщина 0,16 - 0,19 мм) | Электронная микроскопия Sciences | 63786-01 | Эти покровные стекла являются рекомендуемой толщиной для микроскопии сверхвысокого разрешения |
| Щипцы Дюмона #5 | Электронная микроскопия | Sciences 72700-D | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx |
| Парафиновое масло (легкое) | EMD Chemicals | PX0047-1 | Для изоляции GV в масляных |
| адгезивных in situ камерах ПЦР и гибридизации (25 & микро; L) | BioRad | Frame-Seal Slide Chambers #SLF0201 | http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers |
| Силиконовые изоляторы | Grace-Biolabs | выбрать по ссылке каталога | http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html |
| Банки для коплина и посуду для окрашивания | Electron Microscopy Sciences | выбрать по ссылке | каталогаhttp://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx |
Ссылки
- Purkinje, J. E. Symbolae ad ovi avium historiam ante incubationem. , Leopold Vossi. (1830).
- Rückert, J. E. Zur Entwickelungsgeschichte des Ovarialeies bei Selachiern. Anat. Anz. 7, 107-158 (1892).
- Callan, H. G.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Больше статей
Изоляция герминального пузырькаудаление ядерной оболочкифазово-контрастная микроскопияиммунофлуоресцентное окрашиваниегибридизация in situконфокальная микроскопиямикроскопия сверхвысокого разрешенияметод распластывания ядра ооцитаприготовление препаратов методом центрифугирования на предметном стекле
