Методическая статья

Доставки терапевтических миРНК в ЦНС с использованием катионных и анионных липосом

DOI:

10.3791/54106

⸱

23 июля 2016 г.

 ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, and Pathology, College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, Colorado State University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цель этого протокола - использовать катионные/анионные липосомы с нейронацеленным пептидом в качестве системы доставки ЦНС, чтобы позволить миРНК проникать через ГЭБ. Оптимизация системы доставки для лечения, такого как миРНК, позволит расширить возможности лечения прионов и других нейродегенеративных заболеваний.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Прионные заболевания возникают в результате неправильного сворачивания нормального клеточного прионного белка (PrPC) в аномальный устойчивый к протеазе изомер под названием PrPRes. Появление прионных болезней в популяциях диких животных и их растущая угроза здоровью человека привели к активизации усилий по поиску лечения этих заболеваний. Недавние исследования обнаружили множество антиприонных соединений, которые могут либо ингибировать инфекционный изомер PrPRes, либо подавлять нормальный клеточный прионный белок. Тем не менее, большинство из этих соединений не проникают через гематоэнцефалический барьер для эффективного ингибирования образованияPrP Res в тканях мозга, не нацелены специфически на нейрональный PrPC и часто слишком токсичны для использования у животных или людей.

Мы исследовали, является ли миРНК, доставляемая внутрисосудисто и направленная на нейрональный PrPC, более безопасным и эффективным анти-прионным соединением. В этом отчете описан протокол для производства двух липосомальных средств доставки миРНК, а также для упаковки и доставки миРНК PrP в нейрональные клетки. Двумя липосомальными средствами доставки являются: 1) комплексная липосома миРНК с использованием катионных липосом (LSPCs) и 2) инкапсулированная липосома миРНК с использованием катионных или анионных липосом (PALETS). Для LSPC отрицательно заряженная миРНК электростатически связана с катионной липосомой. В комплекс добавляют положительно заряженный пептид (RVG-9r [гликопротеин вируса бешенства]), который специфически нацелен на липосомы-миРНК-пептидные комплексы (LSPCs) через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) к нейронам, экспрессирующим ацетилхолин в центральной нервной системе (ЦНС). Для PALETS (пептидная инкапсулированная липосома терапевтическая миРНК) катионные и анионные липиды регидратировались миРНК PrP. Эта процедура приводит к инкапсуляции миРНК в катионные или анионные липосомы. Опять же, нейропептид RVG-9r связывался с липосомами, нацеливая комплексы миРНК/липосома на ЦНС. Используя эти составы, мы успешно доставили миРНК PrP в нейроны, экспрессирующие AchR, и снизили экспрессию PrPC нейронов в ЦНС.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Прионы тяжелые нейродегенеративные заболевания, которые влияют на центральную нервную систему. Прионные заболевания являются результатом неправильного сворачивания нормального клеточного белка приона, PrP C, инфекционным изомера под названием PrP Res. Эти заболевания влияют на большое разнообразие видов , включая коровьей губчатой ​​энцефалопатии у коров, скрепи у овец, хроническая изнуряющая болезнь в оленевых и болезнь Крейтцфельда-Якоба у человека 1-3. Прионы вызывают нейродегенера-, который начинается с синаптической потери, и переходит к вакуолизации, глиоза, потерю нейронов, а также отложения зубного налета. В конце концов, приводит к смерти животного / индивидуального 4. В течение многих десятилетий, ученые исследовали соединения, предназначенные, чтобы замедлить или остановить прогрессирование заболевания прион. Тем не менее, исследователи не обнаружили ни успешной терапии или эффективное системное средство доставки.

Эндогенной экспрессии PrP С необходим для развития прионовых заболеваний 5 . Таким образом, уменьшение или устранение экспрессии PrP C может привести к задержке или облегчения заболевания. Несколько групп создали трансгенных мышей с пониженным уровнем PrP C или закачивается lentivectors , выражающих shRNA непосредственно в мышиной ткани головного мозга , чтобы исследовать роль уровней экспрессии PrP C в прионовых болезней. Эти исследователи обнаружили уменьшение количества нейронов PrP C привело к остановке прогрессивного невропатологии прионных заболеваний и продлил жизнь животных 6-9. Мы сообщили , что результаты лечения PrP C миРНК в оформлении PrP Res в клетках нейробластомы мыши 10. Эти исследования показали, что использование методов лечения для снижения уровней экспрессии PrP C, как и малых интерферирующих РНК (киРНК), которая расщепляет мРНК, может достаточно задержать прогрессирование прионовых заболеваний. Тем не менее, большинство методов лечения исследованные для прионных заболеваний были поставлены таким образом, что не будет практичнымв клинических условиях. Поэтому миРНК терапия нуждается в системной систему доставки, которая доставляется внутривенно и ориентированные на ЦНС.

Исследователи изучали применение липосом в качестве средств доставки продуктов генной терапии. Катионные и анионные липиды оба используются в формировании липосом. Катионные липиды более широко, чем анионные липиды, так как разность заряда между катионного липида и ДНК / РНК обеспечивает эффективную упаковку. Еще одним преимуществом катионных липидов является то , что они пересекают клеточную мембрану легче , чем другие липиды 11-14 лет. Тем не менее, катионные липиды являются более иммуногенными , чем анионных липидов 13,14. Таким образом, исследователи начали переходить от использования катионные к анионным липидов в липосомах. Продукты генной терапии может быть эффективно упакованы в анионные липосомы с использованием положительно заряженный пептид протамина сульфата, который конденсирует молекулы ДНК / РНК 15-19 лет. Так как анионного липиDS являются менее иммуногенными , чем катионные липиды , они , возможно, к увеличению времени циркуляции, и может быть более терпимы в моделях на животных 13,14. Липосомы предназначены для конкретных тканей с использованием ориентации пептидов, которые присоединены к липосом. РВГ-9R нейропептид, который связывается с никотиновых рецепторов ацетилхолина, использовался для целевой Серна и липосом в ЦНС 17-20.

В настоящем докладе приводится протокол для получения трех средств доставки миРНК, а также для упаковки и доставки миРНК в нервных клеток (рисунок 1). Липосомы-миРНК-пептидных комплексов (LSPCs) состоят из липосом с миРНК и РВГ-9R нацеливание пептид электростатически прикреплен к внешней поверхности липосом. Пептид на имя липосом инкапсулированный терапевтические миРНК (PALETS) состоят из миРНК и протамина, инкапсулированного в липосомы, с РВГ-9R ковалентно связаны с липидного PEG групп. Используя описанные ниже методы для генерации LSPCs и палетS, PrP C миРНК уменьшает экспрессию PrP C до 90% в нервных клетках, который держит огромное обещание вылечить или существенно задержать начало патологии болезни прион.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все мыши были выведены и поддерживаются в Лаборатории животных ресурсов, аккредитованных Ассоциацией по оценке и аккредитации лаборатории Animal Care International, в соответствии с процедурами, утвержденными по уходу и использованию комитета Institutional животных путем в Университете штата Колорадо.

1. Получение LSPCs

  1. Используйте 1: 1 DOTAP (1,2-диолеоил-3-триметиламмоний-пропан): соотношение холестерина для LSPCs. Для 4 нмоль приготовления липосом, смешать 2 нмоль ДОТАП и 2 нмоль холестерина в 10 мл 1: 1 хлороформ: метанол раствор в колбе.
  2. Выпаривают 9 мл хлороформ: метанол раствора с использованием N 2 газа в вытяжном шкафу. Упаривают Последние 1 мл растворителя в вытяжном шкафу в течение ночи без газа. Обратите внимание тонкой липидной пленки на дне колбы.
  3. Тепло 10 мл 10% раствора сахарозы до 55 ° С.
  4. Налейте нагретого 10% раствора сахарозы на тонкой липидной пленки медленно, т.е. 1 мл / мин, в то время как Геntly взбалтывая колбу. Поддерживают 10% сахарозы и колбу с липидами при 55 ° С, так что липидные молекулы остаются в гелевой фазе-жидкость. Результаты Регидратационные в везикул формирования многопластинчатой ​​(MLV).
  5. Разрешить липиды регидрировать при 55 ° С в течение по меньшей мере одного часа до того размера липосом.
  6. Собрать экструдер в соответствии с инструкциями изготовителя с фильтрами 1,0 мкм или использовать шприцевые фильтры 1,0 мкм для проклейки.
  7. Добавить 1 мл суспензии липосом, нагретой до одной из шприцев на экструдере, и передать приостановку между двумя шприцами 11 раз. Убедитесь, что подвеска в противоположном шприц, чем исходный шприца после 11 проходов.
  8. Размер липосом снова через 0,45 мкм затем 0,2 мкм фильтры для генерации больших однослойных везикул (БУВ). Хранить суспензию липосом с подогревом для облегчения калибровки.
  9. Выдержите 20 мкл 4 нмоль суспензии липосом (200 мкм) с 200 мкл 20 мкМ (4нмоль всего) запас миРНК раствор в течение 10 мин при комнатной температуре.
  10. Инкубируют 80 мкл 500 мкМ (40 нмоль всего) маточного раствора РВГ-9R с раствором / липосом миРНК в течение 10 мин при комнатной температуре. LSPCs следует использовать как можно скорее, но может использоваться до нескольких часов после приготовления. Храните LSPCs при 4 ° С в течение нескольких часов после приготовления.

2. Получение PALETS

  1. Используйте 55: молярное соотношение 5 либо DspE (1,2-дистеароил-зп-глицеро-3-фосфоэтаноламин):: 40 холестерина: DspE-ПЭГ или DOTAP: холестерин: DspE-PEG для PALETS. Для 4 нмоль приготовления липосом, смешайте 2,2 нмоль либо DspE или ДОТАП, 1,6 нмоль холестерина и 0,2 нмоль ДСФЭ-ПЭГ в 10 мл 2: 1 хлороформ: метанол раствор в колбе.
  2. Приготовьте суспензию липосом в точности, как описано в шаге 1.1 и 1.2 выше. Увлажняет DspE липосом в 10 мл 1x PBS нагревали до 75 ° С, при добавлении 1 мл / мин. Разрешить липиды регидрировать при 75 ° С в течение поне менее 1 ч перед определением.
  3. Размер суспензию липосом точно так, как описано в шаге 1,6-1,8.
  4. Пипеткой 20 мкл каждого из 4 нмоль (200 мкМ) липосомных суспензий в отдельных аликвот после использования DOTAP и DspE Липосомы размера, и лиофилизации в течение 30 мин с помощью сублимационной сушки настольном (Рисунок 2).
  5. Инкубируют 200 мкл 20 мкМ (4 нмоль) общего исходного раствора киРНК с 1,4 мкл 26,6 мкМ раствора сульфата протамина в течение 10 мин при комнатной температуре миРНК, который должен быть воплощен в DSPE PALETS липосом.
  6. Увлажняет липосом ДОТАП PALETS с 200 мкл 4 нмоль исходного раствора киРНК или регидратации DSPE PALETS липосом с 201,4 мкл раствора / протамин-миРНК. Выдержите раствора липосом / миРНК в течение 10 мин при комнатной температуре.
  7. Добавьте 10 мкл (3-диметиламинопропил) карбодиимида (EDC) раствор 3--1-этил-60 мМ к раствору липосом / миРНК для обоих ДОТАП и ДСФЭ PALETS.
  8. Добавляют 10 мкл раствора 150 мМ N-hydroxysulfosuccinimide (сульфо-NHS) к раствору липосом / миРНК для обоих ДОТАП и ДСФЭ PALETS.
  9. Выдержите EDC и сульфо-NHS ​​с / суспензии липосом миРНК в течение 2 ч при комнатной температуре.
  10. Инкубируют 80 мкл 500 мкМ (40 нмоль всего) маточного раствора РВГ-9R с миРНК / липосом раствор в течение 10 мин при комнатной температуре сшивание.
    ПРИМЕЧАНИЕ: EDC / сульфо-NHS ​​позволяет RVG-9R ковалентно связываться с липидами ПЭГ. Используйте PALETS в течение нескольких часов после приготовления. Храните PALETS при 4 ° С в течение нескольких часов после приготовления.
  11. Для определения эффективности миРНК инкапсуляции PALETS:
    1. Измерить концентрацию миРНК до и после добавления протамина и липосом с использованием спектрофотометра установки при длине волны 260 нм.
    2. Фильтр неинкапсулированной миРНК из липосом / инкапсулированного миРНК суспензии с использованием 50 кДа центробежных фильтров. Центрифуга при 1000 х г в течение 20 мин.
    3. Измерьте концентрациюнекапсулированного миРНК в фильтрате и концентрация инкапсулированного миРНК в концентрате с использованием спектрофотометра при длине волны 260 нм.

3. Инъекционное Мыши с LSPCs или PALETS

  1. Expose мышей в течение 5-10 мин до тепла лампы, чтобы расширить сосудистую сеть.
  2. Обезболить мышь с 2-3% изофлуораном / кислород потока 5-10 мин до инъекции, а также во время инъекции. Подтверждение не обезболивание, когда животное уже не передвигающихся и дыханий замедлилось, делая ног крайнем случае. Поместите мышь на спине или на боку, чтобы получить доступ к хвостовой вены. Используйте ветеринара мазь на глаза мыши, чтобы предотвратить высыхание в то время как под наркозом.
  3. Wipe / спрей хвост с 70% этанола и вводят 300 мкл LSPCs или PALETS на хвостовую вену мыши с помощью 26 G инсулиновый шприц. Начало инъекции дистально в хвостовую вену и двигаться в проксимальном направлении, если вены разрушается или разрывается.
  4. Поместите мышь в чистой клетке, пока она не поддерживает грудины лежачее. Не оставляйте моиспользовать с другими клетке товарищей, пока не будет полностью восстановлена. Мыши должны восстанавливаться в 5 до 15 мин. Они могут быть размещены на грелку или под лампой тепло для поддержания температуры тела, если восстановление занимает больше времени. Мыши следует пристально следить для защиты от перегрева.
  5. Наблюдение за несколько часов после инъекции животных, чтобы обеспечить обезболивание смягчается, и нет никаких болезненных эффектов лечения. Разрешить LSPCs или PALETS циркулировать в течение по крайней мере 24 часов.

4. Анализ экспрессии белка с помощью проточной цитометрии

  1. Эвтаназии мышей с 20% скорости потока СО 2 в течение 15 мин.
  2. Рассеките из половину полушарие мозга путем срезания кожи и череп мыши с помощью ножниц. Отслаиваться половину полушарие мозга от черепа с помощью щипчиков или конец пары ножниц.
  3. Нажмите половину полушарие мозга от каждой мыши через сито меш ячейки 40 мкм с использованием 2,5 мл буфера FACS (1x; PBS, 1% фетальной бычьей сыворотки, 10 мМ ЭДТА) в чашке Петри с поршнем шприца.
  4. Промыть фильтр грубой очистки клеток и чашки Петри с дополнительными 2,5 мл буфера FACS. Помещенный одноклеточной суспензии в конической трубе 15 мл на льду.
  5. Пипеткой 100 мкл 5 мл суспензии отдельных клеток в 1,5 мл микроцентрифужных трубки и центрифуге в течение 5 мин при 350 х г. Выбросите осадок клеток супернатант и ресуспендируют в 1 мл буфера FACS. Спин при 350 мкг в течение 5 мин. Повторите с другой 1 мл буфера FACS. Держите клеточной суспензии на льду.
  6. Инкубируйте клетки в 100 мкл 1: 100 разбавление 0,5 мг / мл анти-мышиных Fc блока в буфере FACS в течение 30-60 мин на льду. Гранул и промыть клетки, как в шаге 4.5. Держите клеточной суспензии на льду.
  7. Инкубацию клеток в 100 мкл 20 мкг / мл флюоресцирующих антител против мышиного PrP С в 7% мышиной сыворотки в буфере FACS на льду в течение 30-60 мин. Гранул и промыть клетки, как в шаге 4.5. Держите клеточной суспензиина льду.
  8. Пелле и вновь приостановить клеток в 1 мл буфера для лизиса эритроцитов (1x PBS, 155 мМ NH 4 Cl, 12 мМ NaHCO 3, 0,1 мМ ЭДТА) в течение 1 мин. Гранула, как на стадии 4.5, и клетки вновь суспендируют в 1 мл буфера FACS. Держите клеточной суспензии на льду.
  9. Анализ экспрессии PrP C с использованием проточного цитометра как описано выше 10. Ворота живые клетки от общей популяции клеток. Ворота PrP C + клеток из популяции живых клеток для определения MFI (медиана интенсивности флуоресценции).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для повышения эффективности киРНК герметизацию в анионных PALETS, киРНК смешивали с протамина. Для определения наилучшей концентрации протамина для миРНК, киРНК смешивали с различными концентрациями протамина, от 1: 1 до 2: 1 (фиг.3А). Был 60-65% миРНК Эффективность инкапсулирования в анионных липосом без использования протамина. Образцы с протамина: миРНК молярные соотношения от 1: 1 до 1,5: 1 (133-266 нМ) была 80-90% миРНК инкапсуляцию. Молярные отношения выше 1,5: 1 п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот отчет описывает протокол для создания двух целевых систем доставки, которые эффективно транспортирует миРНК в ЦНС. Предыдущие способы доставки миРНК в ЦНС включены инъекционные векторы миРНК / shRNA непосредственно в мозг, внутривенные инъекции целевого миРНК или внутривенной инъекцией нецелевых липосом-миРНК комплексов. Инъекция миРНК / shRNA векторов в ЦНС действительно вызывает снижение уровня экспрессии белка-мишени. Тем не менее, миРНК / shRNA не свободно диффундировать через ЦНС. Кроме того, эти инъекции прив...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы отметить следующие источники финансирования: Учебная программа трансляционных исследований в области инфекционных заболеваний CSU (ID:TRTP) и программа исследовательских грантов NIH (R01 NS075214-01A1). Мы хотели бы поблагодарить лабораторию Telling за использование их моноклонального антитела PRC5. Мы также хотели бы поблагодарить лабораторию Dow за липосомы DOTAP и за то, что они поделились своим опытом в создании липосом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DOTAP липидыAvanti Липиды890890
ХолестеринAvanti Липиды700000
DSPEAvanti Липиды850715
DSPE-PEGAvanti Липиды880125
хлороформомFisher ScientificAC268320010
метанолEMD Millipore113351
N2 GasAirGas
SucroseFisher ScientificS5-500
ExtruderAvanti Lipids610023
1,0, 0,4 и 0,2 μ m фильтрыAvanti Lipids610010, 610007, 610006
PBSLife Technologies70011-044
Сульфат протаминаFisher ScientificICN10275205
EDCThermo Scientific22980Аликвотируется для одноразового использования
Sulfo-NHSThermo Scientific24510Аликвотируется для одноразового использования
40 μ m Сетчатое фильтрдля клеток Fisher Scientific08-771-1
Крыса антимышиный CD16/CD32 Fc-блокBD Pharmigen553141
антитела против PrP (PRC5)Запатентованный - PRC

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bolton, D. C., Mckinley, M. P., Prusiner, S. B. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. Science. 218 (4579), 1309-1311 (1982).
  2. McKinley, M. P., Bolton, D. C., Pruisner, S. B. A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion. Cell. 35 (1), 57-62 (1983).
  3. Pruisner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
  4. Jeffrey, M., McGovern, G., Sisò, S., González, L. Cellular and sub-cellular pathology of prion diseases: relationship between morphological changes, accumulation of abnormal prion protein and clinical disease. Acta Neuropathologica. 121 (1), 113-134 (2011).
  5. Büeler, H., et al. Mice devoid of PrP are resistant to scrapie. Cell. 73 (7), 1339-1347 (1993).
  6. Pfeifer, A., et al. Lentivector-mediated RNAi efficiently suppresses prion protein and prolongs survival of scrapie-infected mice. J Clin Invest. 116 (12), 3204-3210 (2006).
  7. White, M., Farmer, M., Mirabile, I., Brandner, S., Collinge, J., Mallucci, G. Single treatment with RNAi against prion protein rescues early neuronal dysfunction and prolongs survival in mice. Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10238-10243 (2008).
  8. Gallozzi, M., et al. Prnp knockdown in transgenic mice using RNA interference. Transgenic Research. 17 (5), 783-791 (2008).
  9. Mallucci, G., et al. Targeting cellular prion protein reverses early cognitive deficits and neurophysiological dysfunction in prion-infected mice. Neuron. 53 (3), 325-335 (2007).
  10. Pulford, B., et al. Liposome-siRNA-peptide complexes cross the blood-brain barrier and significantly decrease PrPC on neuronal cells PrPRes in infected cultures. PLoS One. 5 (6), (2010).
  11. Malone, R. W., Felgner, P. L., Verma, I. M. Cationic liposome-mediated RNA transfection. Proc Natl Acad Sci. 86, 6077-6081 (1989).
  12. Liu, Y., et al. Factors influencing the efficiency of cationic liposome-mediated intravenous gene delivery. Nat Biotechnol. 15, 167-173 (1997).
  13. Freimark, B. D., et al. Cationic lipids enhance cytokine and cell influx levels in the lung following administration of plasmid: cationic lipid complexes. J Immunol. 160 (9), 4580-4586 (1998).
  14. Balzas, D. A., Godbey, W. T. Liposomes for use in gene delivery. J Drug Deliv. , (2011).
  15. Srinivasan, C., Burgess, D. J. Optimization and characterization of anionic lipoplexes for gene delivery. J Control Release. 136 (1), 62-70 (2009).
  16. Lakkaruju, A., Dubinsky, J. M., Low, W. C., Rahman, Y. Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes. J Biol Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).
  17. Tao, Y., Han, J., Dou, H. Brain-targeting gene delivery using a rabies virus glycoprotein peptide modulated hollow liposomes: bio-behavioral study. J Mater Chem. 22, 11808-11815 (2012).
  18. Li, S., Huang, L. In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes. Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).
  19. Li, S., Rizzo, M. A., Bhattacharya, S., Huang, L. Characterization of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes for intravenous gene delivery. Gene Ther. 5 (7), 930-937 (1998).
  20. Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39-43 (2007).
  21. Voinea, M., Simionescu, M. Designing of 'intelligent' liposomes for efficient delivery of drugs. J Cell Mol Med. 6 (4), 465-474 (2002).
  22. Lakkaraju, A., et al. Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes. J. Biol. Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).
  23. Li, S., Huang, L. In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes. Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).
  24. Büeler, H., et al. Normal development and behaviour of mice lacking the neuronal cell-surface PrP protein. Nature. 356 (6370), 577-582 (1992).
  25. Dykxhoorn, D., Novina, C., Sharp, P. Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression. Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (6), 457-467 (2003).
  26. Graham, A., Ray, M., Perry, E., Jaros, E. Differential nicotinic acetylcholine receptor subunit expression in the human hippocampus. J Chem Neuroanat. 25 (2), 97-113 (2003).
  27. Kretzschmar, H. A., Prusiner, S. B., Stowring, L. E. Scrapie prion proteins are synthesized in neurons. Am J Pathol. 122 (1), 1-5 (1986).
  28. Moser, M., Colello, R., Pott, U., Oesch, B. Developmental expression of the prion protein gene in glial cells. Neuron. 14 (3), 509-517 (1995).
  29. Cronier, S., Laude, H., Peyrin, J. M. Prions can infect primary cultured neurons and astrocytes and promote neuronal cell death. Proc Natl Acad Sci. 101 (33), 12271-12276 (2004).
  30. Diedrich, J., Bendheim, P., Kim, Y. Scrapie-associated prion protein accumulates in astrocytes during scrapie infection. Proc Natl Acad Sci. 88 (2), 375-379 (1991).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

siRNARVG 9rsiRNA PrP

Похожие статьи