Ковалентного связывания антител с целлюлозой дисков бумаги и их применение в видимую невооруженным глазом колориметрические иммуноанализа

Диагностическое исследование пункт-ухода тестирование (POCT) имеет важное значение для разработки новых стратегий для терапии, персонализированной медицины и ухода на дому ^1. Целлюлоза документы широко используются в качестве платформ в иммунологических, так как они являются дешевыми, доступными и привычными для пользователей ^2. Кроме того, пористая структура целлюлозной бумаги обладает силой управлять поток жидкости без дополнительного энергетического воздействия. Записи на бумажной основе биоанализа можно найти еще в 20 - ^м веке, когда бумажная хроматография была впервые изобретен в 1952 году Наиболее распространенным примером является Иммунохроматографические испытания ^3, такие как беременность и тест - полосок диабет. Эти тесты обеспечивают относительно быстрое время этого анализа и недорогой анализ ^4. Из - за своей простоты, эти обычные тесты полоска бумаги широко используются в Poct диагностики ^5.

Методы обнаружения , включая колориметрического ^6, электрохимические ^7, и ⁸ Электрохемилюминесценцию методы были зарегистрированы для измерения целевых показателей в биологических пробах. В дополнение к этим количественным методам, надежным методом иммобилизации антител на бумаге из целлюлозы также имеет важное значение для разработки диагностических устройств. Неспецифической адсорбции является основной стратегией для модификации антител на поверхности бумажных устройств ^{9, 10} , чтобы обеспечить максимальную связывающую способность к их целям после иммобилизации. Тем не менее, предыдущее исследование показали , что антитела , которые адсорбируются на целлюлозной бумаги могут десорбируют из волокон ¹¹ на 40%. Таким образом, прямой адсорбции антител на целлюлозы не может обеспечить воспроизводимые результаты ^12. Ковалентной иммобилизации антител , которые прививают на поверхности бумаги является альтернативным способом разработки эффективных бумажных биоанализа ^13. Различные методы были зарегистрированы для модификации целлюлозы ^{14, 15} 12. Карбонилдиимидазола в сочетании с 1-циано-4-dimethylaminopyridinium тетрафторбората ^16; 1-фтор-2-нитро-4-azidobenzene посредством стратегии активации УФ на основе ^{17, 18;} chemoenzymatic стратегия , основанная на ксилоглюкана модификации ^19; 1,4-phenylenediisothiocyanate связывающий агент ^20; гетерополисахарный окисление ²¹ химия нажмите ^22; и катионные порфирины ²³ были использованы для ковалентно иммобилизации биомолекул на бумаге из целлюлозы. Хитозан модифицированная бумага была использована для разработки immunodevices ^24-26 на бумажной основе , поскольку она богата и биосовместимый ^27. Хитозан является катионным и прочно прилипает к анионным целлюлозы ^27. Антитела захвата иммобилизуют на бумаге через хитозана покрытия и глутаральдегида сшивания. Периодатное окисления является еще одним способом для прививания САРТURE антитела на целлюлозной бумаге ^28. В этом методе, периодата натрия наносили на бумагу, чтобы преобразовать 1,2-дигидроксильного (гликоль) группы в целлюлозе непосредственно в альдегидные группы. Эти альдегидные группы затем используются для формирования ковалентных связей между полисахаридами и антителами ^28. Хотя изготовление проста, трудно полностью промыть периодата натрия. Немытая периодата натрия может вызвать дальнейшее окисление антител, иммобилизованных на бумаге из целлюлозы, влияющих на активность и стабильность антител N -. (3-диметиламинопропил) - N -ethylcarbodiimide гидрохлорид и N -hydroxysuccinimide сшиватели также используются для ковалентно иммобилизации антитела на electrospun поли-L-молочной кислоты и ацетата целлюлозы нановолокон для развития нановолокон на основе анализов ^29.

В этом исследовании силановый метод св зывани использовали дл прививки аминные функциональные группы на cellulosе бумажные диски. Этот метод позволяет сохранить первоначальный размер пор, впитывания и скорость фильтрации из целлюлозного фильтра бумаг, что позволяет максимальный вертикальный проточные в иммунологических. Методика силановый широко используется в биосенсоров для функционализации поверхностей подложек с вторичными аминогруппами, с последующим дальнейшим использованием модификации биомолекул. Прививка аминных групп на поверхности матрицы включает реакцию конденсации между группами -ОН органофункционального силана агентов и подложкой матрицы ^30. Диски целлюлозной бумаги были функционализированные с аминогруппами силиконовым соединением через 3-аминопропилтриметоксисилана (APS) ^31. За этим последовало ковалентно иммобилизации антител захвата с использованием двух различных методов. Первый метод включает связывание периодатом окисленные антител захвата к аминогруппами целлюлозной бумаги дисков. Второй метод, используемый глутаральдегида в качестве сшивающего агента для прикрепления захвата antibodiэс в амин-функционализированные группы бумажной целлюлозы дисков. Наличие антител захвата было подтверждено кроличьей античеловеческой IgG-изотиоцианат флуоресцеина (FITC), с помощью флуоресцентного молекулярного формирования изображения. Активность связывания кроличьей античеловеческой IgG-FITC с козьими антителами против IgG кролика также оценивали с помощью субстрата пероксидазы. Исследовали влияние различных концентраций периодата натрия, глутаровый альдегид, и захват антител. Испытание применение иммобилизованного антитела захвата была успешно выполнена путем выявления IgG сыворотки.

1. Прививка Амин функциональные группы на целлюлозе бумаги Диски

1. Приготовьте один кусок квадратной бумаги с размером 1 см × 1 см, и 100 бумажных дисков, изготовленных из класса №1, целлюлозной бумаги диаметром 6,0 мм (фильтровальная бумага среднего потока) с использованием дырокола.
2. Для получения -NH ₂ групп на бумажных дисков, смешайте 1 мл APS и 10 мл ацетона в стеклянной бутылке емкостью 50 мл , в вытяжном шкафу. Добавить бумажные диски к свежеприготовленной смеси реагентов АПС, и инкубируют в течение 5 ч при орбитальном перемешивании (200 оборотов в минуту) при комнатной температуре ^32.
   Внимание: Ручка APS и ацетона в вытяжном шкафу.
3. Декантируйте избыток раствора из флакона 50 мл стекла в контейнер органических отходов.
4. Добавить 10 мл ацетона в стеклянной бутылке, хорошо перемешать и переливать полностью удалить непрореагировавшие APS и других примесей. Повторите этот шаг в два раза.
5. Разведите бумажные диски на бумажное полотенце и поместить в C духовке 110 ° в течение 3 ч. Разрешитьбумажных дисков для охлаждения. Храните диски в 50 мл центрифужные пробирки при комнатной температуре.
6. С помощью ИК - фурье - спектроскопии (FTIR) , чтобы проверить , прививкой аминогрупп на целлюлозной бумаги квадратной, как описано ниже (Рисунок 3А).
   1. Включите компьютер и откройте прибор ИК-Фурье спектроскопии.
   2. Открытое программное обеспечение для ИК-Фурье-спектроскопии.
   3. Перейти к папке "Measurement → Initialize '. Прямоугольники для 'BS: KBr', 'Светильник: Инфракрасный' и 'Laser' станет зеленым, когда инициализация завершена.
   4. Выберите 'Data' ниже прямоугольников, и выберите '% пропускаемость', 'Happ-Genzel', '45', '4.0' и 'Мин: 400, Макс: 4000' для 'режим измерения', 'Аподизация', ' Нет. сканирований ',' Разрешение 'и' Range (см-1) '.
   5. Нажмите на кнопку "Мера".
   6. Выберите "файл данных" для фоновых данных. Написатьвниз комментариев.
   7. Нажмите кнопку "BKG", чтобы получить базовую линию для фона.
   8. Зафиксируйте квадратную бумагу на держателе образца пленки.
   9. Выберите "файл данных" для выборки данных. Запишите комментарии.
   10. Нажмите 'Sample', чтобы получить спектры для образца.
   11. Закройте приложение спектроскопии FTIR и выключить компьютер.
7. Повторите описанные выше шаги (шаги 1,1 до 1,6) с получением амина-функционализированного сорта № 113 целлюлозы квадратный бумаги и дисков (фильтровальной бумаги быстро потока), а также получить спектры FTIR для класса № 113 квадратных бумаги (рис 3B).

2. Ковалентная иммобилизация антител на Амин-функционализированных Диски целлюлозной бумаги

Рисунок 1. ковалентной иммобилизации антител двумя различными способами.A. Антитела , иммобилизованные на амин-функционализированные целлюлозных бумажных дисков через периодатном окисления. В углеводных остатков окисляют периодатом натрия для получения альдегидных функциональных групп. Затем окисленные антитела наносили на амин-функционализированные целлюлозных бумажных дисков. B. Затем антитела, иммобилизованного на амин-функционализированные целлюлозной бумаги дисков через глутаровый альдегид. Амин, функционализированный целлюлозные бумажные диски были погружены в 0,05% растворе глутарового альдегида вводить альдегидных групп на бумажных дисков. После промывания антитела наносили на альдегидных функционализированный бумажных дисков. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

1. Зафиксировать антитела на амин-функционализированные целлюлозных бумажных дисков через периодатном окисления (рис 1А).
   1. Смешайте 1 мкл 2,5 мМ perioda натрияТЕ с 2 мкл 0,1 мг / мл кроличьих антител-человеческим IgG-FITC и 7 мкл 100 мМ, рН 5,5 ацетатного буфера в 1,5 мл пробирку, и инкубируют смесь в темноте в течение 30 мин.
      Примечание: Следуйте этому отношение объема для подготовки более окисленных антител, если это необходимо. Изменение объемного соотношения для оптимизации концентрации периодата натрия и кроличьей античеловеческой IgG-FITC.
   2. Развести выше раствор антител с 30 мкл 50 мМ фосфатного буфера физиологический раствор (ЗФР, рН 7,4) до конечного объема 40 мкл.
   3. Подготовьте три аминные-функционализированные фильтра среднего потока бумажных дисков и три аминовых функционализированных быстрого потока бумажных дисков (как описано в разделе 1).
      1. Нагрузка 5 мкл периодата натрия окисляется кроличьей античеловеческой IgG-FITC на каждый носитель потока диска фильтровальной бумаги и 8 мкл на каждую быстропроточного диска фильтровальной бумаги. Храните эти бумажные диски в темноте в течение одного часа при комнатной температуре.
   4. Промыть каждый из бумажного диска с 0,2 мл промывной баффаэр (50 мМ трис-буфера с 0,15 М NaCl и 0,05% поверхностно-активного вещества, рН 7,4). Повторите для стирки три раза.
   5. Сфотографировать флуоресцентные изображения с помощью флуоресцентного молекулярного томографа , чтобы определить наличие антител на каждой целлюлозной бумаги диска ^32. Используйте чистые бумажные диски (обработанных такой же концентрацией антител в отсутствие периодата натрия) в качестве контроля (рис S1 к рисунку S3).
      Примечание: Для экспериментальной оптимизации, приводят к изменению концентрации одного параметра, который должен быть оптимизирован и фиксировать концентрации всех других параметров. Высокой интенсивностью флуоресценции увеличивает количество антител захвата, которые иммобилизованным на бумаге из целлюлозы дисков.
2. Зафиксировать антитела на аминогруппами целлюлозной бумаги дисков через глутаральдегид (рис 1B).
   1. Добавьте три APS обрабатывают среднего потока фильтровальной бумаги дисков и три быстрых потоков диски фильтровальной бумаги (дезсываются в разделе 1), в 2 мл 50 мМ ЗФР (рН 7,4), содержащего 0,05% глутаральдегида в течение 1 ч, при орбитальном перемешивании при комнатной температуре.
      Внимание: Ручка глутаральдегид в вытяжном шкафу.
   2. Поместите три диска каждый из двух 1,5 мл центрифужные пробирки. Добавить 1 мл деионизованной (ДИ) воды в каждую пробирку и встряхните пробирки в течение 10 сек. Удалите воду отсасыванием с пипеткой. Повторите еще два раза, чтобы удалить непрореагировавший глутаральдегид.
   3. Нагрузка 5 мкл 25 мкг / мл кроличьих антител против человеческого IgG-FITC (захват антител) на каждый альдегид функционализированных среднего потока диска фильтровальной бумаги и добавить 8 мкл на каждый альдегид-функционализированного быстропроточного диска фильтровальной бумаги. Инкубируют в темноте в течение примерно 20 мин при комнатной температуре. Затем добавляют 10 мкл 50 мМ PBS (рН 7,4) в каждый бумажный диск без удаления антител и инкубировать в течение 40 мин для реакции амина альдегидом.
   4. Промыть бумажные диски с 0,2 мл буфера для промывки на верхней части бумажного полотенца. Повторитьмыть два раза.
   5. Сфотографировать флуоресцентные изображения с помощью флуоресцентного молекулярного томографа , чтобы проверить наличие антител на каждой целлюлозной бумаги диска ^33. Используйте чистые бумажные диски в качестве контроля.
      Примечание: На рисунке 4, '0' означает чистый лист бумаги диска , который был обработан с такой же концентрацией FITC-антител при отсутствии глутаровый альдегид; на фиг.5А, пустые бумажные диски были обработаны с помощью глутаральдегида, но не FITC-антитела не были загружены на бумажные диски.
3. Сухие бумажные диски (из разделов 2.1 и 2.2) при 37 ° С в течение 10 мин.
4. Блок бумажных дисков с 15 мкл блокирующего буфера (10% сухого обезжиренного молока в 50 мМ трис-буфера, рН 7,4, 0,15 М NaCl) в течение 10 мин при комнатной температуре.
5. Нагрузка 5 мкл и 8 мкл конъюгированного с пероксидазой козьего анти-кроличьего IgG в PBS (1: 10000) на средней потока и быстропроточных дисков фильтровальной бумаги соответственно. Инкубировать30 мин в темноте при комнатной температуре.
6. Промыть бумажные диски с 0,2 мл буфера для промывки на верхней части бумажного полотенца. Повторите для стирки три раза.
   Примечание: Не обязательно, чтобы удалить промывочный буфер, поскольку результаты не зависят от буфера.
7. Нагрузка 10 мкл смеси 3,3 ', 5,5'-тетраметилбензидина (ТМВ) и раствора перекиси водорода на каждый диск.
8. Возьмите образы бумажных дисков с цифровой камеры или смартфона через 5 мин инкубации.
   Примечание: На фигуре 5В, '0' означает бумажные диски , которые были обработаны с помощью глутаральдегида, а затем загружая антитело-HRP (пероксидаза хрена) конъюгат в отсутствии FITC-антитела.

3. Бумага на основе ELISA для обнаружения IgG

Рисунок 2. Схематическое изображение на бумажной основе ELISA Foг IgG обнаружения. Захват антител были ковалентно иммобилизованы на альдегид функционализированных бумажной целлюлозы дисков через глутаральдегид. Диски целлюлозной бумаги блокировали блокирующим буфером. Целевой IgG, затем добавляли к дискам, а затем загрузку HRP-конъюгированные антитела сигнала. Наконец, раствор ТМВ и перекись водорода смесь загружали на каждый бумажный диск для цвета считывания. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

1. Добавляют 5 мл 0,05% -ного раствора глутарового альдегида (полученного в 50 мМ PBS буфере, рН 7,4) в стеклянной бутылке 20 мл. Погружают 15 аминные функционализованных среднего потока фильтра бумажных дисков в этом растворе, и держать в течение 1 часа при встряхивании при комнатной температуре.
   1. Одновременно с этим, повторите шаг 3.1 подготовить еще 15 альдегидных функционализированные быстропроточного фильтровальной бумаги дисков.
      Внимание: Ручка глутаральдегид в дымукапот.
2. Для того, чтобы удалить непрореагировавший глутаральдегид из бумажных дисков, место 15 среднего потока фильтра бумажных дисков в центрифужные пробирки объемом 15 мл, и 15 быстропроточных диски фильтровальной бумаги в другой 15 мл центрифужную пробирку. Добавьте 5 мл дистиллированной воды в каждую пробирку и встряхните пробирки в течение 10 сек. Удалите воду отсасыванием с пипеткой. Повторите два раза для удаления любого количества непрореагировавшего глутаральдегида.
3. Сухие бумажные диски в 37 ° C духовке.
4. Добавьте 5 мкл и 8 мкл 0,025 мг / мл фрагментов антител мыши IgG-Fc к каждому из среднего потока и фильтровальной бумаги быстро потока дисков, соответственно, и инкубировать в течение 20 мин.
5. Добавляют 10 мкл 50 мМ PBS (рН 7,4) в каждый бумажный диск без удаления антител и инкубировать в течение 40 мин для реакции амина альдегидом.
6. Промыть бумажные диски с 0,2 мл буфера для промывки на верхней части бумажного полотенца. Повторите для стирки три раза.
7. Сухие бумажные диски в сушильном шкафу при температуре 37 ° С.
8. Блок бумажных дисков WIth 15 мкл блокирующего буфера в течение 10 мин при комнатной температуре.
9. Промыть каждый бумажный диск с 0,2 мл буфера для промывки на верхней части бумажного полотенца. Повторите для стирки три раза.
10. Выполнить стандарты IgG.
    1. Нагрузка 10 мкл различных концентраций IgG (например, 0, 10, 125, 250, и 500 нг / мл в PBS) , на каждый диск в трех экземплярах. Инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре.
11. Промыть бумажные диски с 0,2 мл буфера для промывки на верхней части бумажного полотенца. Повторите для стирки три раза.
12. Нагрузка 10 мкл фрагмента антител с пероксидазой хрена конъюгированная мышь IgG-Fc (1: 10000, 10 мМ PBS, рН 7,4), и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре.
13. Промыть бумажные диски с 0,2 мл буфера для промывки на верхней части бумажного полотенца. Повторите для стирки три раза.
    Примечание: Не обязательно, чтобы удалить промывочный буфер, поскольку результаты не зависят от наличия буфера.
14. Нагрузка 10 мкл смеси ТМВ и перекиси водорода на каждый диск.
15. Tобразы готовит в всех бумажных дисков с цифровой камеры или смартфона через 5 минут инкубации.
    Примечание: на фиг.6А, '0' означает бумажных дисков , обработанных иммобилизации антител захвата, и раствор антитела-HRP / ТМВ без IgG сыворотки.
16. Анализ интенсивности каждого бумажного диска в изображения в прямом направлении J.
    1. Преобразование изображения, полученные на шаге 3.15 в формате «.tif».
    2. Открытое программное обеспечение "Image J '.
    3. Перейти к папке "Файл → Открыть", выберите изображение для анализа.
    4. Выберите кнопку формы "Овал".
    5. Перейти к 'Изображение → Type → 32 бит'.
    6. Перейти к 'Edit → Invert'.
    7. Перейти к "Анализ → Измерить '.
    8. Копирование и анализировать данные в электронной таблице.

Рисунок 3. ИК - фурье (FTIR) спектры необработанной и APS обработанного фильтром среднего потока квадратного бумаги (A) и фильтр быстрого потока квадратной бумаги (B). A. Спектры для необработанной фильтра среднего потока квадратной бумаги был похож на APS лечение фильтра среднего потока квадратного бумаги. Увеличение интенсивности в полосах 902-1,170 см -1 и 1,210-1,500 см -1 для АПС-обработанной квадратной бумаги принадлежали к Si-O-целлюлозе и СН деформаций SIOC-H групп, соответственно. Прирост полос на 1,650 см -1 и 2885 см -1 принадлежит к изгибу -NH 2 и CH 2 колебаний от солевого раствора пропилового фрагмента соответственно. B. Характерные пики в 972 до 1,180 см -1 диапазона были отнесены к Si-O-Si и SO-Cellulose облигации. Пик при 1003 см -1 была вызвана перекрытием связи Si-O-Si и СО , простирающейся целлюлозы. Все результаты показывают , что APS был успешно привит на квадратные целлюлозной бумаги. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Присутствие аминных функциональных групп на целлюлозных квадратных работ определялись FTIR. На рисунке 3 приведены спектры FTIR неочищенных, модифицированного, среднего потока и быстрого потока фильтра квадратных бумаги. Были три шага, участвующих в химической модификации аминоалкильные группы, использующие APS на поверхностях целлюлозы. Первый шаг включал гидролиз APS, чтобы обеспечить производное силанола АФС. Шаг второй участвуют адсорбцию гидролизованного производного APS на волокна целлюлозы через водородные связи ОН-групп от чydrolyzed APS производного и волокна целлюлозы. Шаг третий включал конденсацию адсорбированного производной APS, что привело к прививке производной APS на поверхность целлюлозного волокна через Si-OC связей и формирования Si-O-Si силоксановых мостиков 34. Как показано на рисунке 3А, приращение полосы на 1,650 см -1 была приписана к изгибу NH 2 групп и приращение полосы при 2885 см -1 , соответствующие CH 2 колебания силана пропильного фрагмента. Для оригинального фильтра среднего потока квадратной бумаги, полосы при 902-1,170 см -1 и 1,210-1,500 см -1 соответствует колебаниям КОК связей гликозидных мостов и CH валентных колебаний. После обработки квадратной бумаги с APS, увеличение интенсивности в этих двух ширин зон указывает на то, что они принадлежат к Si-O-целлюлозы и CH деформаций SIOC-H групп, соответственно. Подобно средней флвл фильтр квадратный бумаги, спектры для модифицированного фильтра квадратной бумаги быстропроточного также повышенной интенсивности на 1,650 см -1 для -NH 2, из - за химической модификации с APS (фиг.3В). Сильные характерные пики в 972 до 1,180 см -1 диапазона были отнесены к Si-O-Si и SO-целлюлозные связи; самый высокий пик был в 1003 см -1 в связи с перекрытием связи Si-O-Si и СО , простирающейся целлюлозы 34. Характерные связи в диапазоне длин волн между 1188 и 1510 см -1 для APS обработанных квадратных бумаги обусловлены колебаниями COC связей гликозидных мостов и CH валентных колебаний. CH 2 валентного колебания связи были показаны на 2,800-2,980 см -1 и самый высокий пик был в 2932 см -1 для APS обрабатывают квадратную бумагу. В заключение, APS может быть ковалентно привиты к № 1 и № 113 квадратных фильтр бумаги.

Рисунок 5. Ответ флюоресценции (А) и колориметрические результат (В) различных концентраций IgG-FITC на IgG-FITC-иммобилизованной среднего потока и быстропроточных фильтров бумажных дисков (метод В) Установки для флуоресцентного молекулярного формирования изображения:. Возбуждение , 488 нм, эмиссия, 530 нм, разрешение 100 микрометров. # 1 представляет собой сорт № 1, среднего потока диска фильтровальной бумаги, и # 113 представляет комплектация № 113 быстропроточного диска фильтровальной бумаги. APS-модифицированные бумажные диски обрабатывали 0,05% глутаровым альдегидом в первую очередь. Затем, различные концентрации IgG-FITC были загружены на глутаральдегида модифицирована бумажных дисков. Повышение концентрации Загрузку IgG-FITC увеличилось количество иммобилизованного IgG-FITC на бумажных дисков. Тем не менее, увеличение концентрации иммобилизованным IgG-FITC не улучшает способность к связыванию с антигеном. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Последовательность работы для ковалентной иммобилизации антител на амин-функционализированные целлюлозных бумажных дисков показан на рисунке 1. Кроличьи антитела к человеческим IgG-FITC , ковалентно иммобилизованным на бумаге из целлюлозы дисков. Флуоресценция из бумажных дисков указывает на иммобилизацию антител к бумажных дисков, а интенсивность флуоресценции была прямо пропорциональна концентрации иммобилизованных антител. Конъюгированного с пероксидазой козьим антителом против кроличьих IgG, был затем применен для определения связывания способность иммобилизованных антител. Вторичные аминные группы и альдегидные группы могут вступать в реакцию друг с другом с образованием основания Шиффа, который был использован в биоконъюгации 35. Они также были использованы здесь для ковалентной иммобилизации захватаантитела. В способе А (рис 1А), -NH 2 был введен в бумажные диски целлюлозы и -CHO была получена из кролика против человеческого IgG-FITC окислением Fc область антитела периодатом натрия. Таким же образом, были также проанализированы эффекты различных концентраций периодата натрия и IgG-FITC антител. Как показано на рисунке S1 и рис S2, периодата натрия с концентрацией от 0 до 1 мМ и кролика против человеческого IgG-FITC от 0,016 до 0,16 мг / мл оказывает незначительное влияние на окисление 0,08 мг / мл кроличьих антител против человеческого IgG -FITC. Количество антител , которые были ковалентно связаны с бумажных дисков увеличивается с увеличением концентрации антител захвата от 0 до 0,075 мг / мл (рис S3A).

Слабое изменение цвета наблюдалось, когда способность связывания определяли с помощью анализа пероксидазы. Это может быть связано с использованиемИзбыток периодата натрия, который реагирует с антителами захвата и приводит к потере активности связывания. Вполне вероятно, что периодата натрия не может быть полностью смыты от бумажных дисков. Это было подтверждено, что простой принцип периодата натрия решение обеспечивает желтый цвет при смешивании с purpald раствором. Таким образом, периодатом окисленные антитела наносили на бумажные диски и инкубировали в течение 1 часа. Бумажные диски были три раза промывали PBS (содержащий 0,05% твина-20), а затем purpald раствор добавляли к этим дискам. Бумажные диски показали фиолетовый цвет сразу, что указывает на наличие альдегидных групп из окисленного периодатом антител. Этот фиолетовый цвет изменяется на желтый в течение 10 минут, который подтвердил наличие периодата натрия на бумажных дисков.

В качестве альтернативы, глутаровый альдегид сшивания метод (метод Б, рисунок 1В) использовали для соединения амина Гроупс от APS обработанных бумажных дисков и антител. Оптимизированы концентрации глутаральдегида (рисунок 4) и кролика против человеческого IgG-FITC (рис 5А) , которые были загружены на бумажные диски целлюлозы. Как показано на рисунке 4, интенсивность флуоресценции достигла максимума 0,05% глутарового альдегида, что означает , что загрузка кроличьей античеловеческой IgG-FITC насыщается на бумаге из целлюлозы диска при данной концентрации; увеличение концентрации глутарового альдегида до 2,5% не показали увеличение количества кроличьей античеловеческой IgG-FITC на бумаге из целлюлозы дисков (рис S4). Интенсивность флуоресценции также увеличивается с увеличением концентрации кроличьего анти-человеческим IgG-FITC , которые были погружены на бумажные диски (Рисунок 5А). Синий цвет разработан сразу же после добавления раствора субстрата и перекиси водорода смесь ТМВ в бумажных дисков, который содержал peroxidasе конъюгированные антитела обнаружения (рис. 5б) Кроме того, блокирующий буфер , который содержал 10% обезжиренное сухое молоко было показано , чтобы сохранить блокирующий эффективность после 15 промывок (рис S5). Метод B был выбран, чтобы проверить применение иммобилизованных антител, как это имеют повышенную активность связывания с его мишенью. Следовательно, 0.025 мг концентрация / мл антител захвата использовали для обнаружения IgG.

Рисунок 6. Кривые калибровки для определения IgG методом бумажной основе ELISA. # 1 представляет собой сорт № 1, среднего потока диска фильтровальной бумаги, и # 113 представляет комплектация № 113 быстропроточного диска фильтровальной бумаги. Верхняя панель А представляет цветовой индикатор положения для среднего потока (# 1) и быстрого потока (# 113) целлюлозной бумаги диски с различной концентрацией IgG. Нижняя панельB представляет результат ELISA для разных концентраций IgG. Утраивает были использованы для определения стандартного отклонения (SD). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Козье антитело против мышиных IgG-Fc-фрагмент антитела захвата, IgG в сыворотке крови, и козье антитело против мышиных IgG-Fc-фрагмент антитела, конъюгированного с пероксидазой хрена, были использованы для сэндвич-анализа. Как показано на фиг.6 , и на рисунке s6, концентрации IgG сыворотки от 0 до 500 нг / мл имел линейную зависимость с колориметрическим интенсивностью , когда каждый шаг инкубировали в течение 1 часа. На рисунке S6, изменение цвета с различными концентрациями IgG было очевидно в течение 1 часа инкубации. Тем не менее, результаты 10-минутной инкубации не показали очевидное изменение интенсивности цвета с различными концентрациями IgG. Таким образом, Сенсitivity этой бумаги на основе ELISA был пригоден для разработки практического тестирования на месте оказания медицинской помощи.

Рисунок S1. Флуоресцентные ответы на различные концентрации периодата натрия (способ A). Концентрации варьировании периодата натрия смешивают с кроличьей античеловеческой IgG-FITC в концентрации 0,016 мг / мл и использовали для изучения активности окисления антител. За счет увеличения концентрации периодата натрия, загружаемое количество IgG-FITC увеличилось и достигало максимума в 0,25 мм. Было отмечено, что концентрации периодата натрия, которые были выше, чем это не увеличивает количество иммобилизованного IgG-FITC. Утраивает были использованы для определения стандартного отклонения (SD). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.

Рисунок S2. ответ флуоресценцияс до различных концентраций кроличьей античеловеческой IgG-FITC (метод А). Концентрация периодата натрия составляла 0,25 мМ в растворе для исследования активности окисления антитела, и конечная концентрация кроличьей античеловеческой IgG-FITC на каждом диске составила 0,016 мг / мл. Когда концентрация периодата натрия была установлена, концентрация IgG-FITC оказывает незначительное влияние на окисление IgG-FITC. Утраивает были использованы для определения стандартного отклонения (SD). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.

Рисунок S3. Были использованы ответ флюоресценции и колориметрический результат от загрузки различных концентраций окисленных кролика против человеческого IgG-FITC на бумажных дисков (метод А). Для окисления периодатом натрия, 0,08 мг / мл IgG-FITC и 0,25 мМ периодата натрия. Разбавление, конъюгированным с пероксидазой анти-кроличьего IgG был1: 50000. Повышение концентрации погрузки IgG-FITC на бумажных дисков целлюлозы увеличилось количество иммобилизованным IgG-FITC, но не оказало влияния на цели связывания. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.

Рисунок S4. Ответ флуоресцентный высокой концентрации глутарового альдегида в иммобилизации IgG-FITC на бумаге из целлюлозы дисков (метод В). Концентрация IgG-FITC на каждом диске был 0,01 мг / мл. Концентрации глутаральдегид , которые были выше , чем 0,25% не увеличивает количество иммобилизованного IgG-FITC на бумаге целлюлозы дисков. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.

Рисунок S5. Влияние числа временистирки. A: было. повесят три раза B: промывание 15 раз. Захват антител , иммобилизованных на квадратный целлюлозной бумаги все еще имели хорошую связывающую способность к их целям, даже несмотря на то квадрат бумаги встряхивали 15 раз. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.

Рисунок S6. Бумага на основе ELISA , результаты для IgG. Для концентрации IgG от 0 до 500 нг / мл, результаты одного часа инкубации лучше , чем результаты от 10 минут инкубации. Для получения высоких концентраций IgG, 10 минут достаточно времени для инкубации. Утраивает были использованы для определения стандартного отклонения (SD). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.

Рисунок S7. Сканирующая электронная микроскопия (С.Е.M) изображения фильтровальной бумаги среднего потока при различных увеличениях. A: 85X и B: 20,000X. Область сканирования эмиссии электронной микроскопии (FE-SEM), работающих при 5 кВ использовали для определения морфологии частиц. Волокна целлюлозы являются случайным образом сшитый. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.

Рисунок S8. СЭМ изображения фильтровальной бумаги быстро потока при различных увеличениях. A: 100X и B: 20,000X. Область сканирования эмиссии электронной микроскопии (FE-SEM), работающих при 5 кВ использовали для определения морфологии частиц. Волокна целлюлозы являются случайным образом сшитый. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.

Авторам нечего раскрывать.