Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Сайт Направленный Спин Этикетировочное и ЭПР спектроскопических исследований пентамерной лигандами ионных каналов

10.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54127

⸱

4 июля 2016 г.

 ,  , 
1Department of Physiology and Biophysics, Case Western Reserve University, 2School of Medicine, Case Western Reserve University

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье описываются методы сайт-направленного спинового мечения и восстановления пентамерных лиганд-зависимых каналов для исследований электронного парамагнитного резонанса. Этот протокол может быть адаптирован для любого мембранного белка. Описанный здесь метод восстановления также может быть использован для измерения макроскопических и одноканальных токов в определенной липидной системе.

Аннотация

Гейтинг ионных каналов — это стимул-управляемая оркестрация движений белка, которая приводит к переходам между закрытым, открытым и десенсибилизированным состояниями. Фундаментальной для этих переходов является внутренняя гибкость белка, которая критически модулируется липидным составом мембраны. Чтобы лучше понять структурную основу функции канала, необходимо изучить динамику белка в физиологической мембранной среде. Спектроскопия электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) является важным инструментом для характеристики конформационных переходов между функциональными состояниями. По сравнению с ЯМР и рентгеновской кристаллографией, информация, полученная с помощью ЭПР, по своей природе имеет более низкое разрешение. Однако, в отличие от других методов, в ЭПР нет верхнего предела молекулярной массы белка, требования к образцу значительно ниже, и, что более важно, белок не ограничен силами кристаллической решетки. Таким образом, ЭПР уникально подходит для изучения больших белковых комплексов и белков в восстановленных системах. В этой статье мы обсудим общие протоколы сайт-направленного спин-мечения и восстановления мембраны на примере прокариотического протон-зависимого пентамерного лиганд-зависимого ионного канала (pLGIC) из Gloeobacter violaceus (GLIC). Будет описана комбинация стационарных подходов к непрерывной волне (CW) и импульсной (Double Electron Resonance-DEER) ЭПР, которая позволит полностью количественно охарактеризовать динамику канала.

Введение

За последнее десятилетие, структурное понимание пентамерной лиганд-ионных каналов (pLGIC) вырос в дрожжах, благодаря множеству людей структур высокого разрешения нескольких членов семьи. Ключевые факторы , которые привели к текущим достижениям в этой области включают в себя, открытие прокариотических каналов pLGIC, 1-3 крупных достижений в области эукариотической экспрессии мембранного белка, 4-6 и огромные прорывы в подходах определения структуры. 7 Эти структуры обеспечивают четкий консенсус по общее сохранение трехмерной архитектуры pLGIC. Тем не менее, две основные области, которые, кажется, плестись в хвосте являются функциональные характеристики этих препаратов канала и механистический описание функции канала.

Стробирование конформационные изменения являются сложными и происходят в течение более 60 Расстояние по длине канала и эти переходы широко модулируетсямембранные липиды. В частности, отрицательные липиды, холестерин и фосфолипиды , чтобы модулировать функцию pLGIC 8.11. Хотя точная роль этих липидных компонентов в функции канала остается неизвестным, полный молекулярный понимание стробирования потребует изучения этих каналов в их родной среде. Сайт-направленный Спин Этикетировочное (SDSL) и электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) спектроскопии являются методы выбора для изучения динамики белков в реконструированных системах. ЭПР-спектроскопии не ограничивается размером молекул (как ЯМР) или оптическое свойство образца (как флуоресцентная спектроскопия), и, таким образом, позволяет измерять полнометражных конструктов восстанавливали в нативных условиях липидных. Техника чрезвычайно чувствительна и имеет относительно низкие требования выборки (в пределах пико-моль). Обе эти аспекты делают этот метод хорошо подходит для изучения больших мембранных белков, которые трудно выразить в более миллиграммавеличины.

Использование ЭПР - спектроскопии в сочетании с сайт-направленного спина маркировки была разработана Уэйном Hubbell и его коллегами, и был адаптирован для изучения целого ряда типов протеина. 12-24 ЭПР данные были использованы для исследования вторичных структур, изменения в белке конформации, глубины мембранной вставки, и белок-белок / белок-лиганд взаимодействия.

Способ включает в себя цистеин замену в положениях, представляющих интерес сайт-направленного мутагенеза. Для того, чтобы обеспечить сайт-специфическую маркировку, необходимо заменить родной цистеина с другой аминокислотой (например., Серин) , чтобы создать цистеином менее шаблон. До сих пор самым популярным этикетки спин является тиол конкретным мТл: (1-окси-2,2,5,5-тетраметил-Δ3-пирролин-3-метил) methanethiosulfonate который прикрепляется к белку через мост дисульфидных связей. Благодаря своей высокой специфичности, относительно небольшой размер (чуть больше, чем триптофан) и флексичивости линкерной области, этот спин метка было показано, имеют отличную реакционную способность даже при заглубленный цистеина. Кроме того, чтобы максимизировать реактивность, реакция мечение белка осуществляется в стиральном-растворимой форме. После отделения избытка свободного спин-метки с помощью вытеснительной хроматографии, белок восстанавливают в липосомы или двухслойных имитирующих систем определенного состава липидов. В общем, цистеин мутагенеза хорошо переносится в большинстве частей белка, и относительно небольшой размер спин-зонда вызывает минимальное возмущение на вторичных и третичных структур. Для того, чтобы гарантировать, что модификация сохранила функции дикого типа, меченые и реконструированные каналы могут быть изучены с помощью измерений патч-зажим.

Меченый-функциональный белок затем подвергают спектроскопических измерений, которые по существу обеспечивают три основных вида информации: 12,14,15,20,22,23,25-27 динамику спин-зонде lineshАнализ обезьяну; доступность зонда к парамагнитной релаксации агентов; и расстояние распространения. 27 ЭПР расстояния измеряются с помощью двух различных подходов. Первый основан на непрерывной волны (CW) техники, где спектральное уширение , возникающие из дипольных взаимодействий между спин-метками (в 8 - диапазон расстояний 20 Å). Используется для определения расстояния 28,29 Второй представляет собой импульсный ЭПР- метод измерения расстояния , где может быть продлен до 70 Å. 30-34 в Double Electron Electron Resonance (DEER), колебания амплитуды спинового эха анализируются для определения расстояний и распределения расстояний. Здесь спинового эха модулируется на частоте дипольной взаимодействия. В совокупности эти параметры используются для определения топологии белка, вторичные структурные элементы, а также белок-конформационных изменений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Сайт-направленный мутагенез и Cys Мутации

  1. Клонирование и мутагенеза
    Примечание: СЛС дикого типа (вес) 35 имеет один чужеродные цистеин (С27), который мутирован в серин , чтобы создать цистеином менее фона. Цистеин мутации вводят на цистеином менее фоне с помощью сайт-направленного мутагенеза с использованием праймеров , которые несут цистеин кодон в желаемом положении 36.
    1. Смешайте 5 мкл 10х реакционного буфера, 1 мкл 100 нг / мкл цистеин-менее СЛС ДНК - матрицы 35, 0,5 мкл каждого из 40 мкМ вперед и обратного праймера , 36, 1 мкл дНТФ (100 мМ) и 41 мкл деионизованной воды , Пипетировать образца несколько раз, чтобы смешать его тщательно, спин (6000 оборотов в минуту) и, наконец, добавить 1 мкл ДНК-полимеразы.
    2. Установите термо-циклер к следующему протоколу:
      1. Денатурации при 95 ° С в течение 4 мин.
      2. Денатурация при 95 ° С в течение 30 сек.
      3. отжигатьING при 55 ° С в течение 1 мин.
      4. Относительное удлинение при 68 ° С в течение 10 мин (примерно 1 мин на кб длины плазмиды).
      5. Повторите шаги 1.1.2.2 - 1.1.2.4 в течение 18 циклов.
      6. Окончательное удлинение при 68 ° С в течение 10 мин.
      7. Удержание температуры при 4 ° С
        Примечание: температура отжига рассчитывается на основе праймера Tm.
    3. Добавить 1 мкл ДПНИ к реакционной смеси, тщательно перемешать с помощью пипетки, и спином вниз (6000 оборотов в минуту) в течение 1 мин. Инкубировать в течение 2 ч при 37 ° С.
  2. трансформация
    1. Оттепель Е. палочки компетентные клетки на льду. Аликвоты 30 мкл клеток в 14 мл стерильной трансформации пробирку и добавляют 1 мкл расщепленной ДНК в клетки. Смешать, нажав на стороне трубки. Инкубировать в течение 20 мин на льду.
    2. Поместите пробирку в водяной бане при 42 ºC в течение 45 сек, а затем поместить его обратно на льду в течение 2 мин. Добавить 400 мкл стерильной SOC СМИ и встряхнуть клетки в INCUBator при 37 ° С в течение 1 ч.
    3. Пластина 100 мкл клеток на LB-планшеты, содержащие канамицин (50 мкМ) и 1% глюкозы. Инкубируйте пластин O / N при 37 ° С.
    4. Урожай одну колонию из планшета и прививают в 5 мл / N O культур, содержащих LB / канамицину носитель. Выдержите культуры O / N (~ 16 ч) при 37 ° С в инкубаторе шейкере.
    5. Извлечение ДНК из O / N культуре minipreparation 37. Количественно выход ДНК с помощью спектрофотометра путем измерения оптической плотности при 260 нм. Концентрация должна быть ~ 100 - 200 нг / мкл. Подтвердить наличие мутации при помощи стандартных рекомбинантных стратегий секвенирования ДНК 38,39.

2. СЛС Экспрессия и очистка

  1. трансформация
    1. После операции, описанные в разделе 1.2, преобразование 30 мкл компетентных клеток С43 с 1 мкл (~ 100 - 200 нг / мкл) плазмиды, содержащей ген, кодирующий GLIC вместе с сайтом расщепления протеазы -3C Человеческий риновирус (HRV) (для плазмиды и гена последовательности, относятся к дополнительному тексту) 35 (со стадии 1.2.5).
    2. Пластина 100 мкл клеток на LB-агаром, содержащих 1% глюкозы и 50 мкг / мл канамицина, и инкубируют их O / N (~ 16 ч) при 37 ° С в инкубаторе.
    3. Проверьте визуально для колоний и убедитесь, что они не слишком выращены или показывают наличие спутниковых колоний. Незамедлительно запечатать пластины с парафином и хранить их при температуре 4 ° С.
  2. Настройка O / N-культур и подготовка питательной среды
    1. Выбор одной изолированной колонии с использованием затравочной петли проволоки и переносят в 100 мл стерильной колбе, содержащей 20 мл бульона Луриа (LB), дополненной стерильного 1% глюкозы и 50 мкг / мл канамицина. Выдержите их O / N (~ 16 ч) при 37 ° С в качалке при 250 оборотах в минуту.
    2. Автоклавы 900 мл Потрясающе Бульон (TB) СМИ (См СМИ и буферные композиции) в версии 2.8L Фернбах стеклянные флаконы для бактериальной культуры в паровом цикле при температуре 121 ° С в течение 20 мин.
  3. Настройка больших культур роста
    1. Добавляют 100 мл стерильного калий - фосфатного буфера (см носителя и буферные композиции) для автоклавного СМИ ТБ. Добавить стерильную глюкозу (конечная концентрация 0,2%), канамицин (50 мкг / мл), и 10 мл O / N культуры. Инкубировать при 37 ° С в качалке при 250 оборотах в минуту.
    2. Проверьте оптическую плотность при длине волны 600 нм (OD 600) с использованием денситометра или спектрофотометра каждый час до тех пор , пока не достигнет 0,5 (~ 2 ч). На этом этапе уменьшить скорость до 150 оборотов в минуту и ​​понизить температуру до 18 ° С. Монитор OD 600 каждые 30 мин до тех пор , пока не достигнет 0,8 (~ 1 час).
    3. Добавьте 50 мл глицерина и продолжают встряхивания культуры до OD 600 достигает 1,0 - 1,2 (~ 15 - 30 мин).
      Примечание: В этих условиях, она занимает около часа культуру, чтобы достичь 18 ° С от 37 ° С. Это импortant что глицерин добавляется к культуре после того, как она остынет до 18 ° С.
    4. Индуцируют клетки с 200 мкМ IPTG (изопропил-тио-β-галактозид) и сбросить шейкер обратно до 250 оборотов в минуту и ​​инкубировать еще в течение ~ 16 часов при температуре 18 ° С.
  4. Protein Purification
    1. Убедитесь , что оптическая плотность 600 в конце 16 ч составляет ~ 16 - 18. сбора клеток в 1,0 л центрифужные бутылки центрифугированием при 8500 х г , 4,0 ° С в течение 15 мин. Слейте супернатант и взвесьте бутылку с клеточного осадка. Рассчитывают вес гранул путем вычитания веса пустой бутылки от общего веса.
      Примечание: Ожидаемая масса Клеточный осадок ~ 30 - 35 г / л. Несмотря на то , что следует отметить , что могут быть изменчивость в конечной OD 600 и клеточному осадку массы через мутантов.
    2. Повторное приостановить бактериальных гранул в 150 мл охлажденного льдом буфера А (100 мМ NaCl, 20 мМ Трис, рН 7,4) в 1,0 л культуры. Добавить ДНКазы I (100 мкг / мл) и ProteasИнгибиторы е (фенилметил сульфонил фторид (1 мМ), лейпептин (2,0 мкг / мл), апротинин (2,0 мкг / мл) и пепстатин А (1 мкг / мл)).
    3. Однородный клетки, пропуская их через клетки разрушителя в 4.0 ºC холодном помещении. Повторите этот процесс три раза, так что большинство бактерий лизируют. Центрифуга клеток при 14000 х г в течение 15 мин и пипеткой супернатант, и перенесите в чистую центрифужную пробирку. Выбросите осадок, который содержит не-лизированных клеток и телец включения.
    4. Центрифуга супернатант при 168000 х г в течение 1 часа. Осторожно сливают супернатант, не нарушая осадок мембран.
    5. Из бассейна на мембранный осадок из 1 л культуры и повторно приостанавливать его в буфере А (с добавлением 10% глицерина) до конечного объема 50 мл. Добавить 0,5 г н-Docecyl-бета-D-Maltopyranoside (DDM) к суспензии мембран и качаться в течение 2 ч при 4,0 ° С.
    6. После того, как мембраны солюбилизации удаления клеточного мусора из лизата centrifugвания на 168,000 XG для 1hr. В то же время подготовить амилозы смолу. Передача 3 мл смолы с помощью пипетки в пустой колонке полипропиленовый хроматографии. Промыть смолу путем пропускания 10 объемов слоя воды в 3 раза, а затем 10 объемами сло буфера А, содержащего 0,5 мМ DDM.
    7. После центрифугирования, осторожно возьмите супернатант с помощью пипетки и переносят в чистую 50 мл коническую трубку. Для порционно связывания, добавляют предварительно уравновешенную амилозную смолы в конической трубе. Bind извлеченного белка к амилозы смолы путем нутационное смесь в течение 2 ч при 4,0 ° С.
    8. Пройди всю суспензию через хроматографическую колонку и собирают проточные. Затем пройти весь собранный проточного через смолу во второй раз, чтобы максимизировать связывание.
    9. Pass 10 объемами сло буфера А с использованием 0,5 мМ DDM, 0,5 мМ трис (2-карбоксиэтил) фосфин (ТСЕР) и 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) для удаления несвязанных белков.
    10. Элюции белок ИЦГЛ 10 мл BufFER А, содержащего 40 мМ мальтозы в дополнение к 0,5 мМ DDM и 0,05 мМ TCEP. ТСЕР предотвращает окисление цистеина боковых цепей. Соберите всю элюата.
    11. Концентрат элюированного белка с использованием центробежной Концентратор (молекулярный вес СВЕТОТЕНЕВОЙ = 50 кДа) до 4 - 6 мг / мл и добавляют ВСР-3С протеазы (200 мкг на 10 мг белка) и инкубировать o / n при 4,0 ° С.
      Примечание: Выяснить завершение протеазы пищеварения, запустив образцы на стр гель SDS (см шаг 2.5.5 и рисунок 1).
  5. Сайт-направленный Спин-маркировка
    1. Сделайте около 100 мкл 200 мМ запаса (1-окси-2,2,5,5-тетраметил-Δ3-пирролин-3-метил) мТл 40 в ДМСО и хранить запас при -20 ° С в 25 мкл аликвоты.
    2. С помощью протеазы-переваренной образец для выделения маркировки с мТл. Добавить 10-кратный молярный избыток мТл спин-этикетки (СЛС мономера: мТл в 1:10 молярном соотношении). Инкубируют на льду в течение 1 часа. Добавьте второй выстрел спиновой метки на 5-кратным молярным избыткомотношение и инкубировать в течение еще одного часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для заглубленных позиций (с низкой эффективностью спиновой маркировки, описанных ниже), добавляют в 30 раз молярный избыток спиновой метки и белок инкубируют в течение 6 ч.
    3. Пропускают пробу через быстрый Protein гель-фильтрационной колонке жидкостной хроматографии (FPLC), который предварительно уравновешенную буфером А, и 0,5 мМ DDM, чтобы отделить расщепленный MBP и избыток свободного спин-метки из СЛС пентамеры. Соберите 1 мл фракции в общей сложности 30 мл элюирования. Объединяют фракции , содержащие СЛС пентамеры (рисунок 1). Следуйте инструкциям производителя для запуска FPLC.
    4. Определить концентрацию образца с использованием спектрофотометра путем измерения оптической плотности при 280 нм. Молярный коэффициент поглощения и расчетная молекулярная масса СЛС мономера 49850 М -1 см -1 и 36380 Da соответственно. Концентрат раствора белка с использованием центробежного концентратора (молекулярнаяВес Отсечная = 50 кДа) до конечной концентрации ~ 8-10 мг / мл и поместите его на льду. Образец теперь готов для восстановления.
    5. В качестве дополнительной проверки качества, чтобы гарантировать, что препарат является биохимически гомогенной, запустите восстанавливающий (1,0% β-ME) SDS-PAGE гель.
      ПРИМЕЧАНИЕ: commassie окрашивали гель должен показать одну полосу при ~ 33 кДа , соответствующий мономер СЛС (рисунок 1).
    6. Для спин-меченых мутантов , подозреваемых в выставке дипольное уширение, под маркировать образцы в присутствии диамагнитных этикетки 41. Выдержите элюированного-белок с 0,1-кратным мТл и инкубировать на льду в течение 1,0 ч. Затем добавляют 20-кратный молярный избыток диамагнитному метки (1-ацетокси-2,2,5,5-тетраметил-Δ3-пирролин-3-метил) тиосульфонат метан.
      Примечание: Диамагнитное реагент, используемый здесь изо-Стерический с меткой парамагнитного с идентичной химии маркировки.
    7. Инкубируйте образца на льду в течение 2 ч. Пропускают пробу через СИЗе исключение колоночная хроматография, которая предварительно уравновешенную буфером А, и 0,5 мМ РГМ, как и на шаге 2.5.3.
  6. Эффективность спиновой маркировки
    1. Эффективность отжима маркировка определяется как отношение спиновой концентрации метки к концентрации цистеиновой боковой цепью (СЛС-мономер). Для определения эффективности выделения маркировки образца, интегральная интенсивность образца будет по сравнению с эталоном известной концентрации с использованием калибровочный график. Сделать решения ЭПР стандарта (например, 2,2,6,6-тетраметил-1-piperidinyloxyl: подвижно) в диапазоне концентраций (10 - 250 мкМ) при растворении в воде.
    2. Измерьте сигнал ЭПР для каждого из этих решений и определить площадь под кривой (двойное интегрирование сигнала ЭПР) для каждой концентрации (как описано в шагах 6.1). Генерирование калибровочную кривую, откладывая отслеживаемой области в зависимости от концентрации темпу и фитинг с прямой линией.
      Примечание: естьа при производной сигнала ЭПР является лучшее описание спектральной интенсивности, чем от пика до пика амплитуды. Интегрирование первого производной сигнала ЭПР дает спектр поглощения, второй интегрирование тогда даст площадь под спектром поглощения (который пропорционален концентрации спинов). Обеспечить постоянную базовую линию как в низкополевой и высокой полевой области спектра.
    3. Измерить концентрацию спин-меченого белка в моющем средстве, используя спектрофотометр (как на этапе 2.5.4). Теперь измерить сигнал ЭПР образца, а затем определить область двойного интеграла сигнала ЭПР следующих шагов в разделе 6.1. Используя калибровочный график, определить концентрацию метки, которая соответствует измеренному сигнала ЭПР. Расчет эффективности спиновой маркировке мольного соотношения спиновой метки и концентрации белка.

3. СЛС Воссоздание в Asolectin мембранах

  1. липосом Получение
    1. Промыть чистую 25 - мл круглодонную колбу с 5 мл хлороформа и высушить колбу в потоке N 2 газа в вытяжном шкафу. Передача 10 мг asolectin (соевый полярная экстракт 25 мг / мл хлороформа в акции) в колбу и высушить липиды при непрерывном потоке N 2 газа.
      Примечание: Выбор липидов для восстановления основан на результатах экспериментов, в разделе 4.
    2. Когда хлороформ испарилась, колбу помещают в вакууме в течение 1 ч, чтобы обеспечить полное высыхание. Добавить 1 мл буфера А восстанавливающей к высушенного липида и вихревые колбу энергично, чтобы получить липидную осадок в суспензию.
    3. Для приготовления небольших однослойных везикул, разрушать ультразвуком липидной суспензии в холодной ванне ультразвуковом пока раствор пузырек не станет более или менее прозрачным и не наблюдаются сгустки (примерно 10 - 15 мин). К этой смеси добавляют DDM до конечной концентрации 4 мМ и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин.
  2. Воссоздание
    1. Добавьте очищенный белок из стадии 2.5.4 к липидной смеси.
      Примечание: Соотношение белка к липидной зависит от типа эксперимента. Для макроскопических измерений тока, 1: используется соотношение 10000. Для исследования ЭПР, восстановление делается на более высоком белка в соотношении липида (1: 2500), чтобы максимально увеличить сигнал. Ранее было показано , что при этих концентрациях, не боковой агрегации не наблюдается 42.
      Примечание: Типичный рабочий объем СЛС для ЭПР составляет ~ 1 мг, хотя на основе позиции зондировали, более низкие суммы будут работать.
    2. Инкубируйте образца при температуре 4 ° С в течение 1 ч при осторожном вращении затем разбавить образец до 15 мл буфером А.
      Примечание: Этот шаг приближает концентрацию моющего средства ниже критической концентрации мицеллярной (CMC).
    3. Удаления остаточного моющего средства в суспензии путем добавления гранул полистирола (с гидрофобными порами, которые улавливают моющее средство). Добавить 80 мг чистой бисера и инкубировать liposОме подвеска O / N на nutator при 4 ° С .
      1. Для приготовления бусинки для использования, вес ~ 100 мг и передавать их в 50 мл коническую пробирку. Добавьте 10 мл метанола, энергично встряхивают, спином вниз шарики при 8000 мкг в течение 2 мин и сливают метанола. Повторите этот процесс метанола мыть три раза. Повторите тот же процесс с 30 мл деионизированной воды, трехкратной промывки.
    4. На следующий день, передача липосом в ультрацентрифуге трубки 25 мл с использованием колонки с фильтром для удаления бусинки и дальнейшего разбавления пробы до 25 мл. Центрифуга образцов при 168000 х г в течение 2 часов. Слейте супернатант и повторно приостанавливать осадок в 100 мкл буфера В.

4. Определение оптимального липидного состава для разведения по FRET

  1. С помощью флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) основе анализа для определения состава мембраны, которая сохраняет белок монодисперсных.
  2. очищают мас СЛС (с родной цистеина, C27), выполнив действия, описанные в разделе 2. Этикетка белок в 10: 1 (метка / мономер) молярное соотношение с либо флуоресцеин-малеимид или тетраметилродамин-малеимид, используя действия, описанные в разделе 2.5.
  3. После действия , описанные в разделе 3.2 , для восстановления, подготовить трех различных образцов для каждого липида испытуемой композиции, Во- первых, меченных флуоресцеином СЛС в мольном соотношении 1:. 1500 (пентамера: липид) Во- вторых, родамин-меченого СЛС в мольном соотношении 1: 1500 (пентамера: липид). В-третьих, смешайте моющее средство солюбилизации флуоресцеин и родамин меченый СЛС (1: 1 мольное отношение). Развести эту смесь в соотношении 1: 750 (пентамера: липидный) соотношение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали три липидные системы: asolectin, POPC: POPG (3: 1 мольное отношение), и E. полярная палочка экстракт. Соотношение белка восстановление липид в эксперименте FRET выше, чем используется для ЭПР измерений (1: 750, по сравнению с 1: 1500 используются для исследований ЭПР).
  4. разбавлятьсуспензию липосом (для уменьшения светового сигнала рассеяния; ~ 5 мкл в 995 мкл буфера А), затем пипеткой пробу в кварцевую кювету и поместите его в флуориметре.
  5. Установите длину волны возбуждения при 490 (что соответствует максимумам поглощения для донора: флуоресцеина). Используя инструкции производителя, записывать спектры излучения от 500 нм до 660 нм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для флуоресцентную метку СЛС образца, вы увидите пик при 518 нм (что соответствует флуоресцеина эмиссии) без пика при 572 нм (что соответствует эмиссии родамина). Для родамина меченных СЛС образца, вы не увидите пик при 518 нм, но вместо того, чтобы при 572 нм, вытекающие из прямого возбуждения родамина при 490 нм. Для получения образца, содержащего оба флуоресцеин и родамин этикетки, уменьшение интенсивности пика флуоресцеина и соответствующее увеличение пика родамина является FRET сигнал, который, вероятно, является показателем боковой агрегации белка на мембране.
  6. следить заАмплитуда излучения родамина при 572 нм через различные интервалы времени (от 0 - 24 ч) записи в каждый час в течение первых 6 часов , а затем после того, как O / N инкубации (Рисунок 2). Для каждого интервала, измерения интенсивности флуоресценции при 572 нм (для родамина: Ia) и при 518 нм (для флуоресцеина: Id). Вычтите вклад прямой активации родамина (образец 2 в шаге 4.3) из Ia (IAC). Определить отношение FRET как Iac / (IAC + Ib). Сравните FRET в различные временные интервалы и в различных липидных композиций.
    Примечание: В качестве контроля выполнения шага 4.5 и 4.6 для моющего средства солюбилизироваться образцов и сравнить спектры излучения для тех из реконструированных липосом. С помощью эквимолярной смеси меченого белка в моющем средстве (описано в пункте 4.3) и разбавляют в буфере А с добавлением 0,5 мМ DDM. Ожидается, что образцы моющими покажет минимальный сигнал разъедать.

5. Функциональные Измерения с помощью патч-зажим Recordings

  1. Подготовить прoteoliposomes для измерения патч-зажим точно так же, как и для ЭПР исследований (раздел 3.1).
    Примечание: Тем не менее, отрегулировать белок: липид соотношение в зависимости от типа измерения делаются (одноканальный против макроскопических записей). Флэш-не замораживать Протеолипосомы в жидком азоте и хранят при -80 ° С до использования. Как правило, воссоздавать СЛС в соотношении 1: 10000 белок: липид (мольное отношение) для макроскопических токов и 1: 50000 молярного соотношения для записей одноканальных.
  2. Оттепель липосом на льду. Ополосните чистой стекло с водой и этанолом и полностью высохнуть. Поместите каплю 10 мкл proteoliposome по центру слайда и сухого O / N в эксикаторе при 4 ° С в вакууме.
  3. Регидрировать высушенные протеолипосомах путем добавления 20 мкл буфера В (150 мМ NaCl, 10 мМ HEPES, рН 7,0) и поместить стекло в petriplate поверх влажной фильтровальной бумагой. Закройте планшет и позволяют регидратации протекать в течение приблизительно 2 часов.
    Примечание: Этот процесс YieLDS гигантские мульти-пластинчатые липосомы, которые способствуют заплатку.
  4. Извлечь патч пипетки из тонкостенных боросиликатного стекла капилляров (~ 1 - мкм диаметр наконечника 2) с использованием рекомендованная производителем настройки на пипетки съемника. Тепло-польский с помощью пожарно-подделать к сопротивлению 1,5 - 2мОм при заполнении буфера B.
  5. Заполните записи камеры с буфером B с помощью пипетки и прикрепите заземляющий электрод Ag / AgCl. С помощью 2 мкл пипетки, осторожно выбивать липосом от края и передачи 1 мкл суспензии на записи камеры. Подождите несколько минут, чтобы липосом оседают на дно.
  6. Заполните патч-пипетки с буфером B с использованием неметаллического иглы шприца и смонтировать его на усилитель головной стадии. Определить единый изолированный пузырек залатать. Нанесите небольшое положительное давление, чтобы предотвратить патч-пипетку от засорения, а затем вставьте наконечник в записи камеры.
  7. Применение тестовых импульсов для измерения пипеток resistaсть и компенсировать напряжения смещения пипетки. Подойдите к пузырек, и при контакте, нанесите небольшое отрицательное давление, чтобы мягко тянуть пузырек против патч пипетку, чтобы сформировать gigaohm уплотнение.
  8. Монитор сопротивление пипеткой в ​​течение всего процесса. После того, как gigaohm уплотнение образуется, снять пипеткой тщательно от липосом, чтобы сформировать наизнанку патч. Выключите тестовый импульс.
  9. Установить удерживающий потенциал до -100 мВ, а также применять импульс рН. Низкий уровень рН получали с использованием 10 мМ цитрат натрия буфером С (150 мМ NaCl, 10 мМ цитрата, рН 3,0). (Рисунок 3)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Записи выполняются с частотой дискретизации 10 кГц для макроскопических и 40 кГц для одиночных измерений канала.

6. Измерения ЭПР

  1. Непрерывный ЭПР - спектроскопии
    1. Перенесите суспензию липосом с шага 3.2 в 200 мкл пробирку и осадить образцов с помощью центрифуги. Откажитесь от supernataнт и образец готов для ЭПР измерений.
      Примечание: Для измерений ЭПР, важно, чтобы удалить как можно больше буфера из образца липосом, как это возможно. Так как водные образцы поглощают электрическую часть микроволновой печи, что приводит к нагрева и потери чувствительности.
    2. Для того, чтобы осуществить замену буфера, передать 20 мкл липосом гранул с помощью пипетки в пробирке. Добавьте 180 мкл буфера D (100 мМ NaCl, 10 мМ цитрата, рН 3,0) и инкубируют при 42 ºC водяной бане в течение 5 мин. Центрифуга образец, удалить супернатант с помощью пипетки и повторить процесс трижды, чтобы гарантировать полный обмен буфера.
      Примечание: В качестве альтернативы, обмен буфер может быть сделано путем воздействия на образцы для многократных циклов замораживания / оттаивания.
    3. Газопроницаемый пластиковые капилляры подходят для измерений как спектральных линий-форм и доступности растворителя. Нажмите на капилляр осажденной proteoliposome нарисовать образец внутри и запечатать конец с костным воском.
      НЕE: Типичные объемы образцов составляют ~ 5 мкл и желательной концентрации спина составляет 150 мкМ. Если цель состоит в том, чтобы измерить формы линий в одиночку, можно использовать 0,4 мм OD кварцевые капиллярные трубки. При необходимости пипетка может быть использован для наполнения пробы внутри капилляра.
    4. Эксплуатировать спектрометр
      1. Провести измерения CW-ЭПР при комнатной температуре (292 - 297 К) на Х-диапазона спектрометра, оснащенного диэлектрического резонатора в соответствии с инструкцией по эксплуатации завода-изготовителя.
      2. Включите охладитель воды, источника питания и консоли СВЧ-моста. Дайте системе термически уравновешиваться в течение примерно 30 мин перед записью. Открытое программное обеспечение сбора данных.
      3. Вставьте пробирку / капилляр в резонатор, чтобы убедиться, что часть трубки, заполненной образца находится в центре резонатора. Настройтесь резонатор в соответствии с инструкцией по инструкции спектрометра.
      4. Запись первой производной спектра поглощения по полю развертки припроисшествие СВЧ-мощность 1,0 мВт, частота модуляции 100 кГц и шириной развертки 100 G. Определение оптимальной мощности для эксперимента путем проведения прогрессивную эксперимента мощность насыщения, где высота пика до пика первой производной CW ЭПР сигнала измеряется как функция квадратного корня из падающей СВЧ-мощности.
        Примечание: При более низких мощностях СВЧ, интенсивность сигнала возрастает пропорционально квадратному корню из власти до тех пор, равновесная населенность спиновых состояний не влияет. Тем не менее, если питание дополнительно увеличивается, спин-решеточной релаксации больше не может поддерживать разницу равновесие населения двух спиновых состояний и амплитуда сигнала начинает плато или «насытить». За этой точкой, амплитуда сигнала может фактически уменьшаться с увеличением мощности наблюдать за счет инверсии населенности спиновых насыщает. Кроме того, для уширенных спектров с обширными крыльями, где четко определенная плоская исходная информация не является VIможные, расширить ширину развертки до 150 - 200 G, чтобы предотвратить потерю площади.
      5. Начните с использованием амплитудной модуляции 1,0 G.
        Примечание: Это значение выборки зависит и регулируется для уменьшения низкочастотного шума в сигнале. Если используется слишком большое значение, оно может привести к искажению или расширить сигнал.
      6. Установите постоянную времени и преобразования времени 20,48 мс, время развертки до 20.97 сек и разрешением до 1024 точек.
        Примечание: Постоянная времени также основан на образце и корректируется, чтобы отфильтровать высокочастотный шум.
      7. После первого сканирования установите поле центром в центре сигнала ЭПР и выбрать ширину развертки таким образом, что след включает сигнал и достаточную базовую линию по обе стороны.
        Примечание: Кроме того, чтобы улучшить отношение сигнал / шум, увеличить количество сканирований, основанных на силе сигнала ЭПР. Включите ширину развертки и число точек
      8. Мера доступности спиновой метки к Столкновительная отдыхаете агентов O 2 или ethylenediaminediacetic кислоты (NiEDDA) с использованием мощности насыщения протоколов 27 описано в шаге 6.1.4.4.
        Примечание: Подготовка NiEDDA , как описано выше 26.
      9. Сначала заливать образец в полости с N 2 в течение 5 мин (для промывки O 2). Измерение спектров для каждого СВЧ-мощности от 5 - 35 дБ с шагом 3 дБ при ширине развертки 30 G.
      10. Затем заливать образец в полости воздуха в течение 10 мин и измерения спектров при различных мощностях СВЧ (5 - 35 дБ с шагом 3 дБ), как на этапе 6.1.4.9.
      11. Инкубируют 20 мкл липосом осадку 180 мкл 50 мМ NiEDDA (в буфере B или буфер D) в 42 ºC водяной бане в течение 5 мин. Центрифуга образца и удалить супернатант с помощью пипетки. Загрузите образец в капилляр и поместить его в резонаторе. Повторите шаг 6.1.4.9.
        Примечание: Принцип эксперимента является то, что взаимодействие с парамагнитного релаксинаг агентов через Гейзенберга спинового обмена бы предотвратить насыщение сигнала и инверсной населенности. Водорастворимый NiEDDA и жирорастворимых молекулярного O 2 используются в качестве репортеров для воды (как навалом и intraprotein прихожих) и мембраны подвергаются позиции на белка, соответственно.
  2. Анализ данных:
    Примечание: Анализ данных ЭПР включает в себя следующие этапы: 14,22,23,25-27
    1. Вычислить подвижность спинового зонда (H O -1), как обратная величина ширины центральной линии первой производной спектра поглощения. & Dgr ; H O -1 является отражением двигательной свободы или динамики зонда.
    2. Вычислить параметр доступности (П), который является оценкой доступности зонда к другим парамагнитных столкновительными расслабляющих агентов, используя шаги, описанные ниже.
      Примечание: Взаимодействие спин-зонда с парамагнитными отдыхаете агентовувеличивает скорость спин-решеточной релаксации (T 1) нитроксила Гейзенберга спинового обмена. 27
      1. Расчетный параметр доступности (П) из экспериментов насыщения мощности (6.1.4.8) , в котором вертикальная амплитуда от пика до пика центральной линии первой производной спектра ЭПР измеряется при различной мощности СВЧ. 25 Plot амплитуду сигнала как функции квадратного корня из СВЧ - мощности и подходят со следующим уравнением 27.
        figure-protocol-1
        Примечание: в случае когда амплитуда сигнала, является мерой однородности насыщения резонансной линии (обычно от 0,5 до 1,5), I является коэффициент масштабирования, Р мощность падающего, и представляет собой значение, при котором первая производная амплитуда равна половине ее ненасыщенного значения.
  3. Вычислить ΔP 1/2 как разность P 1/2 значения в присутствии (O 2 или NiEDDA) и отсутствии (перфузию N 2) парамагнитных отдыха агентов. Вычислить параметр доступности (П) с помощью уравнения:
    figure-protocol-2
    Примечание: Где P 1/2 справка и & Dgr ; H O ссылка являются половину максимального значения насыщения мощность и ширина центральной линии, соответственно, для эталонного стандарта (например, ДФПГ (2,2-дифенил-1-пикрилгидразила)) 27.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Биохимический характеристика спин-меченых СЛС Мутанты

После описанного выше протокола, как правило, дают СЛС-МОБ слитого белка в диапазоне от 10 - 12 мг / л культуры. Хотя это значение может изменяться в различных мутантов, в частности, для позиций, захороненных в белке, выход может быть значительно нарушена. В этих случаях объемы культуры может потребовать расширения. Расщепление слитой конструкции по HRV3C п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

ЭПР-спектроскопии оказалось беспрецедентным структурный подход при количественной оценке конформационные изменения мембранных белков в почти родной среде. Такой подход позволяет нам заглянуть в молекулярные детали динамики белков, которые затемнены в структурах с высокой разрешающей способностью от рентгеновской кристаллографии и крио-электронной микроскопии. Тем не менее, важно учитывать технические ограничения такого подхода, которые могут повлиять на общую применимость к другим системам, а также иметь в виду потенциа...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы очень благодарны нынешних и бывших членов лаборатории Чакрапани для критического чтения и замечания по рукописи. Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения (грант 1R01GM108921) и Американской ассоциации сердца (НКРЗ ученый развития Грант 12SDG12070069) и СК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Сайт-направленный мутагенез и мутации
10x PfuUltra HF реакционный буферAgilent Technologies600380-52
dNTPSNew England BioLabs Inc‎N0447L10 мМ каждый dNTP
pfu Ультра ДНК-полимеразаAgilent Technologies600380-512,5 мкл
DPNINew England BioLabs Inc‎R0176S20 000 ед/мл
XL10 GOLDAgilent Technologies200314
SOC mediaNew England BioLabs Inc‎B9020S
KanamycinFisher ScientficBP905
LB медиаInvitrogen127957084
Miniprep kitQIAGEN27106
C43 компетентные клеткиLucigen60446
Экспрессия и очистка
глюкозыFisher ScientficD16
ТриптонФишер БиореагентыBP1421-500
Дрожжевой экстрактAmrescoJ850
ГлицеринБиореагентыФишера BP229
K2HPO4Amresco0705
K2HPO4Amresco0781
IPTG (изопропил-тио-&бета;-галактозид)Gold BiotechnologyI2481C25
основание тризмыSigma Life ScienceT1503
NaClSigma-AldrichS7653
DNase ISigma Life ScienceDN25
PMSFAmrescoM145
LeupeptineAmrescoJ580
ПепстатинAmrescoJ583
DDM (n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside)AnatraceD310S
Амилоза смолаNew England BioLabs Inc‎E8021L
TCEPAmrescoK831
EDTAFisher ScientficBP118
МальтозаAcros Organics329915000
Superdex 200GL GE Healthcare17-5175-01
Пустая полипропиленовая хроматографическая колонкаBioRad731-1550
Site-Directed Spin Labeling
MTSL (1-оксил-2,2,5,5-тетраметил-3-пирролин-3-метил) МетантиосульфонатToronto Reaserch chemicals IncO873900
(1-ацетокси-2,2,5,5-тетраметил-&дельта; 3-пирролин-3-метил) метанитиосульфонатToronto Reaserch chemicals IncA167900
DMSOJ.T. Baker9224-01
Восстановление
Асолентиновый липидAvanti полярные липиды Inc541602C
Биошарики (полистириновые шарики)Bio Rad152-3920
МетанолFisher химикатыA413
FRET
Флуоресцеин-малеимидThermoFisher ScientificF-150
тетраметилродамин-малеимидThermoFisher ScientificT-6027
POPCAvanti полярные липиды Inc850457C
POPGAvanti полярные липиды Inc840457C
E.coli экстракт полярныхлипидов Avanti polar lipids Inc100600C
HEPESSigma Life ScienceH3375
EPR измерение
TPX пластиковые капиллярыBrukerER221
EDDA (этилендиамин-N, N'-диацетовая кислота)Aldrich158186
Ni(OH)2Олдрич283622
Cys

Ссылки

  1. Tasneem, A., Iyer, L. M., Jakobsson, E., Aravind, L. Identification of the prokaryotic ligand-gated ion channels and their implications for the mechanisms and origins of animal Cys-loop ion channels. Genome Biol. 6, 4(2005).
  2. Hilf, R. J., Dutzler, R. X-ray structure of a prokaryotic pentameric ligand-gated ion channel. Nature. 452 (7185), 375-379 (2008).
  3. Bocquet, N., et al. X-ray structure of a pentameric ligand-gated ion channel in an apparently open conformation. Nature. 457 (7225), 111-114 (2009).
  4. Hibbs, R. E., Gouaux, E. Principles of activation and permeation in an anion-selective Cys-loop receptor. Nature. 474 (7349), 54-60 (2011).
  5. Miller, P. S., Aricescu, A. R. Crystal structure of a human GABAA receptor. Nature. 512 (7514), 270-275 (2014).
  6. Hassaine, G., et al. X-ray structure of the mouse serotonin 5-HT3 receptor. Nature. 512 (7514), 276-281 (2014).
  7. Du, J., Lu, W., Wu, S., Cheng, Y., Gouaux, E. Glycine receptor mechanism elucidated by electron cryo-microscopy. Nature. , (2015).
  8. Sunshine, C., McNamee, M. G. Lipid modulation of nicotinic acetylcholine receptor function: the role of neutral and negatively charged lipids. Biochim Biophys Acta. 1108, 240-246 (1992).
  9. Fong, T. M., McNamee, M. G. Correlation between acetylcholine receptor function and structural properties of membranes. Biochemistry. 25 (4), 830-840 (1986).
  10. daCosta, C. J., Baenziger, J. E. A lipid-dependent uncoupled conformation of the acetylcholine receptor. J Biol Chem. 284 (26), 17819-17825 (2009).
  11. Criado, M., Eibl, H., Barrantes, F. J. Functional properties of the acetylcholine receptor incorporated in model lipid membranes. Differential effects of chain length and head group of phospholipids on receptor affinity states and receptor-mediated ion translocation. J Biol Chem. 259 (14), 9188-9198 (1984).
  12. Hubbell, W. L., Lopez, C. J., Altenbach, C., Yang, Z. Technological advances in site-directed spin labeling of proteins. Curr Opin Struct Biol. 23 (5), 725-733 (2013).
  13. Columbus, L., Hubbell, W. L. A new spin on protein dynamics. Trends Biochem Sci. 27 (6), 288-295 (2002).
  14. Hubbell, W. L., Cafiso, D. S., Altenbach, C. Identifying conformational changes with site-directed spin labeling. Nat Struct Biol. 7 (9), 735-739 (2000).
  15. McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy. Structure. 19 (11), 1549-1561 (2011).
  16. Bordignon, E. Site-directed spin labeling of membrane proteins. Top Curr Chem. 321, 121-157 (2012).
  17. Klare, J. P., Steinhoff, H. J. Spin labeling EPR. Photosynth Res. 102 (2-3), 377-390 (2009).
  18. Drescher, M. EPR in protein science : intrinsically disordered proteins. Top Curr Chem. 321, 91-119 (2012).
  19. Perozo, E., Cuello, L. G., Cortes, D. M., Liu, Y. S., Sompornpisut, P. EPR approaches to ion channel structure and function. Novartis Found Symp. 245, 146-158 (2002).
  20. Fanucci, G. E., Cafiso, D. S. Recent advances and applications of site-directed spin labeling. Curr Opin Struct Biol. 16 (5), 644-653 (2006).
  21. Sahu, I. D., McCarrick, R. M., Lorigan, G. A. Use of electron paramagnetic resonance to solve biochemical problems. Biochemistry. 52 (35), 5967-5984 (2013).
  22. Hubbell, W. L., McHaourab, H. S., Altenbach, C., Lietzow, M. A. Watching proteins move using site-directed spin labeling. Structure. 4 (7), 779-783 (1996).
  23. Altenbach, C., Marti, T., Khorana, H. G., Hubbell, W. L. Transmembrane protein structure: spin labeling of bacteriorhodopsin mutants. Science. 248 (4959), 1088-1092 (1990).
  24. McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics. Biochemistry. 35 (24), 7692-7704 (1996).
  25. Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin. Photochem Photobiol. 56 (6), 1019-1033 (1992).
  26. Altenbach, C., Greenhalgh, D. A., Khorana, H. G., Hubbell, W. L. A collision gradient method to determine the immersion depth of nitroxides in lipid bilayers: application to spin-labeled mutants of bacteriorhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (5), 1667-1671 (1994).
  27. Altenbach, C., Froncisz, W., Hemker, R., McHaourab, H., Hubbell, W. L. Accessibility of nitroxide side chains: absolute Heisenberg exchange rates from power saturation EPR. Biophys J. 89 (3), 2103-2112 (2005).
  28. Rabenstein, M. D., Shin, Y. K. Determination of the distance between two spin labels attached to a macromolecule. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (18), 8239-8243 (1995).
  29. Altenbach, C., Oh, K. J., Trabanino, R. J., Hideg, K., Hubbell, W. L. Estimation of inter-residue distances in spin labeled proteins at physiological temperatures: experimental strategies and practical limitations. Biochemistry. 40 (51), 15471-15482 (2001).
  30. Borbat, P. P., McHaourab, H. S., Freed, J. H. Protein structure determination using long-distance constraints from double-quantum coherence ESR: study of T4 lysozyme. J Am Chem Soc. 124 (19), 5304-5314 (2002).
  31. Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization. J Magn Reson. 172 (2), 279-295 (2005).
  32. Jeschke, G. DEER distance measurements on proteins. Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).
  33. Jeschke, G., Polyhach, Y. Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance. Phys Chem Chem Phys. 9 (16), 1895-1910 (2007).
  34. Jeschke, G., Wegener, C., Nietschke, M., Jung, H., Steinhoff, H. J. Interresidual distance determination by four-pulse double electron-electron resonance in an integral membrane protein: the Na+/proline transporter PutP of Escherichia coli. Biophys J. 86 (4), 2551-2557 (2004).
  35. Hilf, R. J., Dutzler, R. Structure of a potentially open state of a proton-activated pentameric ligand-gated ion channel. Nature. 457 (7225), 115-118 (2009).
  36. Velisetty, P., Chalamalasetti, S. V., Chakrapani, S. Conformational transitions underlying pore opening and desensitization in membrane-embedded Gloeobacter violaceus ligand-gated ion channel (GLIC). J Biol Chem. 287 (44), 36864-36872 (2012).
  37. Birnboim, H. C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).
  38. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  39. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
  40. McHaourab, H. S., Kalai, T., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme: effect of side chain structure. Biochemistry. 38 (10), 2947-2955 (1999).
  41. Gross, A., Columbus, L., Hideg, K., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Structure of the KcsA potassium channel from Streptomyces lividans: a site-directed spin labeling study of the second transmembrane segment. Biochemistry. 38 (32), 10324-10335 (1999).
  42. Velisetty, P., Chakrapani, S. Desensitization mechanism in a Prokaryotic ligand-gated ion channel. J Biol Chem. 287 (22), (2012).
  43. Velisetty, P., Chakrapani, S. Desensitization mechanism in prokaryotic ligand-gated ion channel. J Biol Chem. 287 (22), 18467-18477 (2012).
  44. Chakrapani, S., Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Structural dynamics of an isolated voltage-sensor domain in a lipid bilayer. Structure. 16 (3), 398-409 (2008).
  45. Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Structural dynamics of the KvAP pore domain lacking the voltage sensing domain. Biophysical Journal. 88 (1), 19-20 (2005).
  46. Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating. Science. 285 (5424), 73-78 (1999).
  47. Chakrapani, S., Sompornpisut, P., Intharathep, P., Roux, B., Perozo, E. The activated state of a sodium channel voltage sensor in a membrane environment. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (12), 5435-5440 (2010).
  48. Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers. Science. 321 (5893), 1210-1214 (2008).
  49. Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418 (6901), 942-948 (2002).
  50. Kim, M., Xu, Q., Murray, D., Cafiso, D. S. Solutes alter the conformation of the ligand binding loops in outer membrane transporters. Biochemistry. 47 (2), 670-679 (2008).
  51. Kazmier, K., Sharma, S., Islam, S. M., Roux, B., McHaourab, H. S. Conformational cycle and ion-coupling mechanism of the Na+/hydantoin transporter Mhp1. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), 14752-14757 (2014).
  52. Durr, K. L., et al. Structure and dynamics of AMPA receptor GluA2 in resting, pre-open, and desensitized states. Cell. 158 (4), 778-792 (2014).
  53. Borbat, P. P., et al. Conformational motion of the ABC transporter MsbA induced by ATP hydrolysis. PLoS Biol. 5 (10), e271(2007).
  54. Zou, P., McHaourab, H. S. Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers. Biophys J. 98 (6), 18-20 (2010).
  55. Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins. J Magn Reson. 142 (2), 331-340 (2000).
  56. Jeschke, G., et al. DeerAnalysis2006-a comprehensive software package for analyzing pulsed ELDOR data. Applied Magnetic Resonance. 30 (3-4), 473-498 (2006).
  57. Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422 (6928), 180-185 (2003).
  58. Velisetty, P., Chalamalasetti, S. V., Chakrapani, S. Structural basis for allosteric coupling at the membrane-protein interface in Gloeobacter violaceus ligand-gated ion channel (GLIC). J Biol Chem. 289 (5), 3013-3025 (2014).
  59. Dellisanti, C. D., et al. Site-directed spin labeling reveals pentameric ligand-gated ion channel gating motions. PLoS Biol. 11 (11), e1001714(2013).
  60. Labriola, J. M., et al. Structural sensitivity of a prokaryotic pentameric ligand-gated ion channel to its membrane environment. J Biol Chem. 288 (16), 11294-11303 (2013).
  61. Kinde, M. N., et al. Conformational Changes Underlying Desensitization of the Pentameric Ligand-Gated Ion Channel ELIC. Structure. 23 (6), 995-1004 (2015).
  62. Vasquez, V., Cortes, D. M., Furukawa, H., Perozo, E. An optimized purification and reconstitution method for the MscS channel: strategies for spectroscopical analysis. Biochemistry. 46 (23), 6766-6773 (2007).
  63. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane protein assembly into Nanodiscs. FEBS Lett. 584 (9), 1721-1727 (2010).
  64. Hanson, S. M., Francis, D. J., Vishnivetskiy, S. A., Klug, C. S., Gurevich, V. V. Visual arrestin binding to microtubules involves a distinct conformational change. J Biol Chem. 281 (14), 9765-9772 (2006).
  65. McCoy, J., Hubbell, W. L. High-pressure EPR reveals conformational equilibria and volumetric properties of spin-labeled proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (4), 1331-1336 (2011).
  66. Mobius, K., et al. Combining high-field EPR with site-directed spin labeling reveals unique information on proteins in action. Magn Reson Chem. 43, Spec no. 4-19 (2005).
  67. Lopez, C. J., Oga, S., Hubbell, W. L. Mapping Molecular Flexibility of Proteins with Site-Directed Spin Labeling: A Case Study of Myoglobin. Biochemistry. 51 (33), 6568-6583 (2012).
  68. Fleissner, M. R., et al. Site-directed spin labeling of a genetically encoded unnatural amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (51), 21637-21642 (2009).
  69. Lorenzi, M., et al. Tyrosine-targeted spin labeling and EPR spectroscopy: an alternative strategy for studying structural transitions in proteins. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (39), 9108-9111 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Сайт Направленный Спин Этикетировочное и ЭПР спектроскопических исследований пентамерной лигандами ионных каналов
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.