Методическая статья

FRET визуализации в трехмерных гидрогелей

DOI:

10.3791/54135

⸱

1 августа 2016 г.

 ,  , 
1Department of Oral Biology, Center for Craniofacial Regeneration, McGowan Institute of Regenerative Medicine, University of Pittsburgh, 2Department of Bioengineering, Center for Craniofacial Regeneration, McGowan Institute of Regenerative Medicine, University of Pittsburgh, 3Laerdal AS

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ферстер резонансный перенос энергии (FRET) визуализация является мощным инструментом для реального времени исследований клеточной биологии. Вот метод для клеток визуализации FRET в физиологичных микросреды трехмерной (3D) гидрогеля с использованием обычного эпифлуоресцентной микроскопии представлена. Анализ для логометрических FRET зондов, что дает линейные коэффициенты в диапазоне активации описана.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Визуализация Форстера резонансного переноса энергии (FRET) является мощным инструментом для изучения клеточной биологии в режиме реального времени. Исследования, использующие FRET обычно используют двумерные (2D) культуры, которая не имитирует трехмерную (3D) клеточный микросреду. Способ для выполнения гасили выбросов FRET изображений с использованием обычных Widefield эпифлуоресцентной микроскопии клеток в 3D-среде гидрогеля представлена. Вот метод анализа для логометрических FRET зондов, что дает линейные коэффициенты по диапазону активации датчика описан. Измерение внутриклеточного циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) уровней проявляется в хондроцитах при форсколина стимуляции с использованием зонда для EPAC1 активации (ICUE1) и способность обнаруживать разницу в цАМФ сигнализации в зависимости от типа материала гидрогеля, описании термин фотосшивки гидрогеля (ПК-гель, полиэтиленгликоль-диметакрилат) и thermoresponsive гидрогель (ТР-гель). По сравнению с методами 2D FRET,этот метод требует немного дополнительной работы. Лаборатории уже использующие визуализацию FRET в 2D может легко принять этот метод для выполнения клеточных исследований в 3D микросреды. Кроме того, он может быть применен к высокопроизводительного скрининга лекарственных средств в сконструированных 3D microtissues. Кроме того, она совместима с другими формами визуализации FRET, таких как измерение анизотропии и времени жизни флуоресценции томографии (FLIM), а также с передовыми микроскопии платформ с помощью конфокальной, импульсный или модулированного освещения.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клеточная сигнализация является сложной и логически вытекающий для многочисленных областях, в том числе фармакологии, тканевой инженерии и регенеративной медицины. Полезные исследуемые инструменты необходимы для более глубокого понимания клеточной биологии и разработать оптимальные материалы для регенерации тканей. Ферстер резонансный перенос энергии (FRET) визуализация является важным инструментом , позволяющим анализ активации рецептора, конформации молекул и супрамолекулярных взаимодействий (например., Белок / ДНК комплексообразования) в живых клетках. FRET представляет собой тип безызлучательной передачи энергии между флуорофоров 1. Он имеет КПД, обратно пропорциональна шестой степени расстояния между донором и акцептором флуорофора флуорофора. Таким образом, он может предоставить информацию о пространственном расстоянии между двумя различными молекулами или между регионами одной молекулы в нанометровом масштабе (обычно 1 - 10 нм) 2. Донора и акцептора флуорофоров могут быть разными мolecule типы (гетеро-FRET), в которой донор имеет более высокую эмиссию энергии (более короткой длиной волны), или одного и того же типа (гомо-FRET). FRET изображений может выполняться на фиксированных или живых клеток, но в целом фиксированные клетки используются для визуализации молекулярных взаимодействий при высокой пространственной разрешающей способностью при высокой скорости конфокальной системы недоступны. Живые клетки используются для изучения взаимодействий и процессов, которые затрудняли или изменёнными фиксации, например, в режиме реального времени внутриклеточный ответ 3 сигнализации.

исследования живых клеток, которые используют FRET Использовать формирования изображения двухмерных (2D) клеточных культур отчасти из-за простоты и нижнего фона (нет выбросов от из плоских клеток). Тем не менее, 2D культуры также изменяют многочисленные клеточные процессы по сравнению с физиологическом микросреды и трехмерной (3D) культуры 4,5. Например, родной клетки к клетке и клетки к внеклеточного матрикса взаимодействий резко изменили в 2D культуре приводит к ЭСПILY наблюдаются изменения в морфологии клеток и полярности 6. Мембранные микродомены (например., Кавеолах и липидные рафты) и передача сигналов рецептора сильно регулируемы средой культуры, отчасти потому , что они связывают цитоскелета компоненты 7.8 и форма элемента и цитоскелета структура сильно регулируемы пространственной культуры среды 9. Механотрансдукция не только под влиянием 3D - матрицы, но более сложных вторичных условий нагружения в порождены 3D средах по сравнению с 2D - культур 10. И, наконец, проницаемость 3D матриц меньше, чем в культуральную среду, в целом с уменьшением диффузии и увеличение связывания клеток сигнальных молекул по сравнению с 2D-культур. С помощью 3D-культур один способен создать и наблюдать микросреду более похожий на физиологическом отношении клея, химических и механических сигналов. Cell для взаимодействия клеток может способствовать и свойства клейкие можно контролировать весIth структура, состав и архитектура (структуризации) 3D - материала 11-13. Механические свойства материала также могут быть адаптированы по составу и структуре 14,15. Культивирование клеток в гидрогели поэтому допускает FRET исследования на первичные клетки , которые в противном случае ослабляющих Дифференцируйся или изменения в фенотип с использованием обычных методов, например., Клетки из суставного хряща. Таким образом, необходим способ для того, чтобы FRET анализы в живых 3D культур.

Гидрогелевые каркасы идеально подходят для исследований, основанных 3D FRET, так как они могут быть сделаны оптически прозрачным и с учетом контроля микросреды и обеспечить клеточные сигналы. Гидрогели из натуральных полимеров , которые были использованы в клеточной культуре в течение многих десятилетий, в том числе желатин и фибрин 16. Более полный контроль над сотовой микроокружения может быть достигнуто при химической модификации этих полимеров и с применением синтетических полимеров 17,18. HydrOGEL механическую жесткость и проницаемость можно регулировать путем изменения их полимерной композиции , и размер ячеек (полимер и плотность сшивок) 19,20. Кроме того, гидрогели могут быть биологически активных путем включения факторов роста и клеточных лигандов. Из - за этих возможностей, развитие гидрогели для биодатчиков, доставки лекарств и тканевой инженерии является очень активной областью исследований 21. 3D печать гидрогели также находятся в стадии разработки для изготовления микро-тканей и -organs 15. Таким образом, лада визуализации клеток в гидрогели не только полезным в качестве средства для аппроксимируют физиологическую клеточного поведения, но и в качестве инструмента для изучения и оптимизации роста сконструированную ткани.

Бинарные логометрических FRET зондов очень полезны при изучении клеточной сигнализации и может быть использовано в гидрогелевых культурах. Для частичного списка опубликованных флуоресцентной и FRET зондов, см Cell веб-сайт консорциума по миграции 22. Наиболее распространенный тип зонда содержит два различных флуорофоров, которые связаны или связаны с элементом распознавания (ов) (аналит чувствительная область). Эти участки подвергаются конформационные изменения, ассоциации, или диссоциацию при обнаружении аналита (например., Связывание иона или молекулы, ферментативное расщепление области) , что приводит к изменению расстояния между флуорофоров и поэтому FRET величины (выше или ниже) 23. Менее распространенный, но полезная тип датчика основан на изменении чувствительного анализируемого вещества в спектральном перекрытия двух флуорофоров, что приводит к изменению величины FRET. "Одноцепочечные" логометрических зонды используют флуорофор пару, связанную с одной молекулой. "Двойная цепь" зонды используют флуорофором пар на отдельные молекулы, но их экспрессия может быть соединена под тем же экспрессионной кассеты 24. В отличие от исследований с выражением одного флуорофора (например., Флюоресцентные слитых белков), исследования с логометрическойFRET зонды не требуют двойного трансфекцию для контроля эффективности трансфекции или жизнеспособности клеток. Логометрический FRET зондов относительно нечувствительны к эффективности трансфекции при выраженной выше минимального порога (концентрации) нечувствительной 23,25. Они нечувствительны к колебаниям источника возбуждения и других факторов внутриклеточной среды (например., РН, ионов) так долго , как оба флуорофоры так же отзывчивыми. Кроме того, их реакция не подлежит транскрипционный задержки, в отличие от люминесцентных и биолюминесцентная промотор-репортер строит 26,27.

Логометрический FRET зонды легко и часто используются в обычных системах микроскопа Widefield эпифлуоресцентной. Широкопольные микроскопов предпочтительнее линии сканирования конфокальной системы для получения изображений живых клеток из-за опасений по поводу стоимости системы, флуорофора отбеливания, а также захвата изменений сигнала с достаточным временным разрешением. Кроме того, единая анальное ячейкализ на большой популяции клеток можно с моторизованным стадии и изображения захвата над несколькими полями зрения. Widefield микроскопия требует интенсивности на основе анализа сигналов зондов гетеро-ладу. Хотя анализ интенсивности не требует сложного оборудования , как и другие методы FRET, больше работы после приобретения требуется для коррекции последствий флуорофором поведения и системы микроскопа / визуализации конфигураций 28. Захваченный интенсивность эмиссии флуорофора является функцией энергии возбуждения, флуорофором квантовый выход, и комбинированный фильтр и камера / детектор спектральной чувствительности и линейности 2. Они могут быть различны для донора и акцептора и требует калибровки для количественного анализа. Кроме того, визуализация эмиссии акцепторного влияют спектрального перекрытия флуорофоров (возбуждение акцептора донорского возбуждающим светом и протечек через изделие излучения донора в спектрах излучения акцептор) 2.4; Одноцепочечные "зонды внутренне нормализуется , потому что их флуорофоры эквимолярная на наноуровне, в то время как флуорофоры" двойной цепью "зонды могут существовать на различных стехиометрии по всей клетке 25,28 Если флуорофоры из." Одноцепочечный " зонды имеют одинаковую яркость (функция коэффициента экстинкции и квантового выхода), эффекты чувствительности нелинейного детектора невелики и только коррекция для фоновой флуоресценции и связанной квантовой чувствительности выход / детектор необходим 23. Таким образом , "одноцепочечный" ратиометрический FRET зонды наиболее легко реализованы в Widefield микроскопии 24.

В данной статье описан простой метод для выполнения FRET изображений живых клеток в 3D культуры гидрогеля с использованием обычного Widefield эпифлуоресцентной микроскопа. Она может быть легко принят лабораториями, уже осуществляющих FRET эксперименты в 2D, а также лабораторий, заинтересованных в Интересотовой сигнализации в microtissues. Здесь мы демонстрируем метод с FRET на основе изображений измерения циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) уровней в живых хондроцитов в пределах фотосшивкой (PC-гель, полиэтиленгликоль диметакрилат) и thermoresponsive (TR-гель, Матригель) гидрогелей. Ратиометрический FRET зонд используется на основе EPAC1 (ICUE1) для определения уровней цАМФ в ответ на форсколин, химический агониста для аденилатциклазы, которая катализирует превращение АТФ в цАМФ. цАМФ является одним из главных вторичных мессенджеров, опосредующих G-белком рецептор сигнализации и активирует различные факторы, в том числе ниже по течению белков обмена непосредственно активированных цАМФ (EPACs). Флуорофоры раздвигают на цАМФ связывания с доменом ЕПАК, что приводит к уменьшению FRET. Описываемый здесь подготовка гидрогелевых материалов, трансфекции клеток с зондом ICUE1, и вложение клеток в 3D гидрогелей. Процедура эксперимента 3D FRET и анализа изображений необходимодля оценки активности зонда на клетку объясняются. Мы также обсудим недостатки, присущие анализа FRET в 2D и 3D с помощью микроскопии с широким полем зрения. Техника, представленная здесь является улучшением по сравнению с существующими методами 2D, поскольку он позволяет проводить анализ в более физиологическом контексте, и требует меньшего количества коррекции изображения и калибровки. Большой полезности заключается в том, что многие прозрачные материалы могут быть использованы в то время как клеточные и трансфекция предпочтения могут быть сохранены.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Материалы Подготовка

  1. Готовят полиэтиленгликоль диметакрилат (PEGDM, 4000 МВт) с помощью methacrylating полиэтиленгликоль в соответствии с методами , описанными в Лин-Гибсоном и др. 29. В качестве альтернативы PEGDM могут быть приобретены.
  2. Синтезируют фотоинициатора лития фенил-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP), с помощью двухстадийного процесса, в котором первый диметиловый фенилфосфонит вступает в реакцию с 2,4,6-триметилбензоил choride посредством реакции Михаэлиса-Арбузова, а затем литиевой соли путем добавления бромида лития в 2-бутанон, в соответствии с Majima и др. 30.
    Примечание: В качестве альтернативы, другие фотоинициаторы можно приобрести , но LAP показывает лучшую биосовместимость и эффективность 31 сшиванием.
  3. Функционализации покровные стекла, чтобы обеспечить сцепление гидрогеля к стеклу и тем самым предотвратить движение во время формирования изображения.
    1. В химической капюшон с надлежащей индивидуальной защиты, использования3- (триметоксисилил) пропилметакрилат в соответствии с протоколом производителя для PC-гелей и эпоксидных силанов (3-глицидоксипропилтриметоксисилан) для TR-гелей 31. Примечание: В качестве альтернативы, предварительно покрытые слайды могут быть приобретены. Обратите внимание, что покровное стекло должно быть больше, чем колодец блюдо PDMS в шаге 3.8.

2. Сотовый Трансфекция

  1. В капот культуре ткани и с использованием стерильных методов, оттаивание и пластинчатые желаемых клеток на суб-сплошности (50 - 70%), в настоящем документе бычьих хондроцитов при 15000 клеток / см 2 в 6-луночных необработанными блюда культуры. Примечание: Любой соответствующий тип клеток может быть использована, в том числе якорных независимых ячеек.
    1. Разрешить клеткам восстановиться в течение одного дня в инкубаторе при 37 ° С. Перед тем как последующие стадии, удалить среды, промыть PBS, и добавьте 2 мл фенол- и бессывороточной среды на лунку.
  2. На следующий день за каждую лунку добавляют по 100 мкл и фенол-среде без сыворотки, а также 3мкл реагента для трансфекции к автоклавного стеклянную пробирку. Перемешать, встряхнуть трубку слегка. Инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин. Ограничить любое воздействие света.
  3. Добавить 1 мкг FRET ДНК-зонд и слегка встряхните. Выдержите смесь при комнатной температуре и в защищенном от света в течение 30 мин.
    Примечание: В этом эксперименте ICUE1 плазмиды использовали (любезно Dr. Jin Zhang 33). Флуорофоров в ICUE1 являются голубой флуоресцентный белок (CFP, донор) и желтый флуоресцентный белок (YFP, акцептор). Отношение реагента к трансфекции плазмидной ДНК, будет необходима регулировка для оптимального трансфекции различных типов клеток.
  4. Распределить готовую смесь (~ 104 мкл) по каплям к каждой из 6 лунок, содержащих клетки, плюс 2 мл фенол- и не содержащей сыворотки среде. Не пипеткой вверх и вниз. Аккуратно водоворот пластины для смешивания.
  5. Инкубируют при 37 ° С в течение 48 часов. Примечание: сплошности ингибирует эффективность трансфекции и изменяет эндогенную экспрессию рецепторов.

3. ИзготовлениеPDMS Пресс-формы для литья гидрогеля и культуры

  1. Для того, чтобы подготовить большой стеклянный слайд, чтобы бросить полидиметилсилоксана (PDMS) на, сначала очистить стекло с мылом, ополоснуть с большим количеством воды, а затем насухо изопропанола с последующим воздухом.
    1. Обрабатывают стекло с силиконизации реагентом в соответствии с протоколом производителя, так что ПДМС может быть легко отслаивается после отверждения. Полоскание остаточный реагент от поверхности с помощью толуола над водосборной емкости. Дайте поверхности полностью высохнуть перед или использовать тепло при температуре 100 ° C, чтобы сократить время ожидания.
  2. Выберите высоту гидрогеля (например, 1 мм) и вычислить в 1,2 раза объем PDMS необходимо для покрытия стекло с PDMS этой толщины с использованием размеров предметного стекла и высотой гидрогеля. Примечание: PDMS не дает усадки.
    1. Смешать компоненты комплекта PDMS в соотношении 10: 1 по весу в химическом стакане. После того, как он смешивается хорошо, поместите стакан под вакуумом до Дега. Relieve вакуум, если пузырьки начинают переполнять контейнер и повторите.
      Примечание: Можно использовать другие гидрогелевые толщины, но за счет увеличения фона и увеличение непрозрачности, если центрифугирование (этап 6.2) не используется.
  3. Оберните алюминиевой фольги вокруг основания и по бокам стекла, чтобы содержать PDMS. Осторожно вылить требуемое количество дегазированной PDMS на этот стакан, окруженный фольгой. Измерьте высоту PDMS. Имейте в виду, что высота PDMS будет максимальная высота гидрогеля. Если какие-либо пузырьки создаются при заливке, дегазацию снова или совать их с помощью шпателя или иглы.
  4. Поместите неотвержденная PDMS на ровную поверхность в печи при температуре 100 ° С в течение 2 часов, или оставить при комнатной температуре в течение 24 часов.
  5. Осторожно снимите PDMS с поверхности, как только он затвердеет. Выбивать желаемую форму (например, цилиндрический перфоратор 3 мм) для гидрогелей.
    Примечание: фотосшивающих будет давать более узкое ПК-гель цилиндров, чем диаметр пресс-формы из-зак гашению реакции с помощью молекулярного кислорода в PDMS.
  6. Стерилизовать пробитые PDMS. Для краткосрочных экспериментов, погрузить PDMS в 70% этаноле в течение 1 ч.
  7. Сборка пресс-формы путем подгонки основание стерилизованных PDMS со стерильным покровным стеклом толщиной согласованной с объектива микроскопа коррекции. Отложите для использования в шаге 6.
  8. Изготовить больший PDMS блюдо с использованием методов выше (с хорошо шире и выше, чем гидрогеля), чтобы содержать гидрогель и среду. Приспособить средний объем, по меньшей мере в 10 раз больше, чем гидрогель, чтобы погрузить гидрогель и свести к минимуму разбавление анализируемого вещества.

4. Получение гидрогеля растворов предшественников

  1. В капот культуре ткани и с использованием стерильных методов, готовят гидрогеля растворов предшественников, подходящий для исследования непосредственно перед добавлением клеток. Подготовка PC-гель из предшественника полимера следующим образом.
    1. Смешайте PEGDM порошок в фосфатно-солевом буфере (PBS, рН 7,2) при 10% (вес / объем).
    2. Добавьте фотоинициатор (например, LAP) при конечной концентрации 0,005 - 0,01% (вес / объем) и перемешать с помощью пипетки. Накройте решение с алюминиевой фольгой или щитом от света, как LAP чувствителен к свету.
      Примечание: Здесь ТР-гель уменьшенный фактор роста внеклеточного матрикса используется как поставляемая изготовителем.

5. клеточной суспензии в гидрогелевые Solutions

  1. В капот культуре ткани и с использованием стерильных методов, аспирацию среды из скважин.
  2. Добавить PBS в лунки, а затем удалить его тщательно промыть прикрепленные монослоев клеток.
  3. Диссоциируют клеток от субстрата культивирования с использованием от 2 до 3 мл на 25 см 2 клеточной диссоциации раствора. Rock мягко, а затем инкубировать при температуре 37 ° С в течение 10 - 20 мин или до диссоциированы. Постукиванием блюдо, если это необходимо, чтобы вытеснять клетки.
    Примечание: Альтернативные решения клеточной диссоциации доступны с выбором ограничивается теми, которые не яMPACT на пути передачи сигналов при анализе отщеплением рецепторов, представляющих интерес.
  4. После того, как клетки отделяют, добавляют 2 мл и фенол среде без сыворотки, приостановить клетки, и подсчет клеток с помощью гемоцитометра. Примечание: Химически определенные безсывороточную среду (например, с добавлением инсулина, трансферрина и селен) , также могут быть использованы.
  5. Алиготе нужное количество ячеек на основе типа клеток в стерильные флаконы и осадок (например, 2,0 х 10 6 клеток на флакон).
  6. Удалить супернатант, добавьте требуемый объем предшественника гидрогеля и суспендирования клеток с помощью пипетки. Используйте объем предшественника , который обеспечит 2 х 10 5 клеток / см 2 в плоскости х , когда визуализируя ось г гидрогеля , как разрушилась (например, 1,0 мл на флакон для толстой гидрогеля 1 мм , содержащую 2 х 10 6 клеток / мл). Заботьтесь, чтобы не произвести пузыри.
    1. Быстро перейти к следующему шагу , чтобы ограничить негативное воздействие на жизнеспособность клеток 34 </ SUP>.

6. Гидрогель Подготовка

  1. В капот культуре ткани и с использованием стерильных методов, добавьте предшественника гидрогеля клеток , содержащих в литейные формы , приготовленной на стадии 3 (например, 7,1 мкл на диаметром 3 мм х 1 мм высотой гниль). Создание дополнительного гидрогель, в соответствии с теми же способами, описанными, использовать для калибровки системы визуализации микроскопа и зонд калибровки (если присущая эффективность зонда неизвестна).
  2. Центрифуга Приготовленный клеток , содержащей предшественник гидрогеля до желатинизации / сшивающий для оптимизации изображений с помощью удерживающего клеток к одной фокальной плоскости , и сведение к минимуму из плоского сигнала (рисунок 1). Настройка времени центрифугирования и силы к типу клеток и вязкости предшественника (400 г в течение 4 мин).
  3. Гель или сшивать решение
    1. Для ПК-гель гидрогеля, облучать клеточную содержащий предшественник с УФ-источником света (λ = 365 нм) в течение времени экспозиции, равного3,2 Дж / ​​см 2 в зависимости от толщины миллиметра до photocrosslink.
      Примечание: Используйте 1 мм минимальную толщину в расчете. Воздействия должны находиться в диапазоне 1-5 мин. Используйте минимальное время экспозиции. Избегайте чрезмерного облучения клеток, как это уменьшит жизнеспособность и отбелить донора CFP. Тем не менее, время экспозиции менее 60 лет не рекомендуется, так как высокая интенсивность облучения приводит к радикальной самотушения и плохой жизнеспособности клеток.
    2. Для ТР-гель гидрогеля, поместите заполненную форму в чашку Петри и перейти в инкубатор для термического желатинирования. Инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин.
  4. После того, как желирующий или сшивать гидрогель, удалите PDMS литейную форму гидрогеля и заменить его на подготовленную большей PDMS блюдо (с шагом 3,5). Нажмите на PDMS вниз на стекло с помощью стерильного шпателя привязывать его.
    1. Поместите это PDMS блюдо с покровным в стерильный контейнер, такой как чашку Петри. Добавьте фенолов в бессывороточной среды или определенного химического меняDIUM (бессывороточной среде с добавлением инсулина, трансферрина и селен (шаг 5.4)) к хорошо создана с блюдом PDMS и покровное, чтобы держать гидрогель погружен в воду. Инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин.
      Примечание: При использовании специализированного блюдо с покровным, затем поместите покровное в том, и точно так же добавить среду.
    2. С другой стороны, выполнить этот шаг за день до визуализации FRET, чтобы зонды для восстановления, как при облучении длинами волн перекрываются со спектром донор возбуждения CFP.

7. 3D FRET изображений

  1. Удалить блюдо PDMS с гидрогеля из чашек Петри, полученного на стадии 6.4, и закрепите его в регулируемом держателе образца для стадии XY микроскопа (рисунок 2). Расположите держатель образца на столике микроскопа. Нанесите масло на цели, если требуется. Используйте цель , по крайней мере , 40Х и высокой числовой апертурой (NA) (т.е. 1,3 NA) , чтобы захватить относительно слабую флуорофорВыбросы е.
  2. Настройка полей зрения (ПЗ) для получения изображения: Выделение ячеек для получения изображений с помощью проходящего света визуализации и проверки трансфекцию с помощью флуоресцентной визуализации. Выберите по крайней мере, 15 различных клеток.
    1. Выделение ячеек, которые не являются ни слишком ярким, ни слишком тусклым (что могло бы привести к зонду перенасыщение или низкой чувствительности) и с отношением FRET между 0,0 и 1,0 (которые в противном случае указывает на повреждение или распад бинарной зонда). Затем выключите свет, чтобы ограничить воздействие.
    2. Выберите ПЗ рядом с центром гидрогеля и с клетками , представляющие интерес в пределах относительно плоской области освещения (см Фигура 3В и Шаг 9.2 ниже).
  3. Настройка параметров камеры для каналов FRET изображения. Вы можете выбрать несколько ячеек вблизи центра FOV для оптимизации "оптических конфигураций" (то есть., Экспозиции и усиления для каждого канала изображения).
    Примечание: Номенклатура ниже варьируется в зависимг на программное обеспечение, используемое для работы микроскопа и камеры. Микроскоп программное обеспечение, NIS-Elements, здесь используется для захвата и анализа изображений.
    1. Для FRET анализа одноцепочечных зондов, выбрать один из двух каналов изображения за FOV: закалку эмиссии (QE), который является донором выбросов при возбуждении донора и акцепторного излучения при возбуждении акцептора (AEM).
      Примечание: Для зонда ICUE1 CFP-YFP, A CFP возбуждения и эмиссионный фильтр пара для QE (418 - 442 ех, 458 - 482 EM) и возбуждения и испускания пары YFP для AEM (490 - 510 ех, 520 - 550 ем) используются.
    2. Установите экспозицию для QE и AEM, чтобы приобрести максимальную интенсивность сигнала без насыщения (и, если используется ПЗС, с минимально возможным коэффициентом усиления), чтобы минимизировать фоновый шум. Держите оптические конфигурации одинакова для обоих флуорофоров и на протяжении всего эксперимента, а также среди экспериментальных групп , чтобы избежать смещения результатов (т.е. мощность возбуждения, ирис размер, экспозиции и усиления камеры) (рисЮр 3A).
    3. Приобретать дополнительные каналы изображения , чтобы обеспечить больше возможностей для анализа после приобретения (например, изображения исправлен сенсибилизированных выбросов (CSE) (см Обсуждение)). Для зонда ICUE1 CFP-YFP, приобретают возбуждения (Ex) и эмиссии (ЕМ) каналы Ex донора - Em донора (QE, выберите CFP-CFP в программном обеспечении микроскопа), Ex донор - акцептор Em (SE, выберите CFP- YFP), Ex акцептор - Em акцептор (Aem, выберите YFP-YFP) и Ex акцептор - донор Em (YFP-CFP) конфигурации (смотри рисунок 3A).
  4. Настройка скорости захвата для получения изображений в заданный промежуток времени.
    1. Уменьшение скорости захвата, если ограничены аппаратными средствами. Для краткосрочных анализов (например, 30 - 60 мин), обозначают около 12 приобретений в минуту для каждого FOV (частота дискретизации 5 сек) для захвата сигнализации кинетики. Используйте минимальную частоту дискретизации, необходимую, чтобы избежать СИГВВПficantly фотообесцвечиванию зонд.
    2. Установите скорость сбора, набрав периодичность захватов в программном обеспечении микроскопа. Для длительных анализов (например., 24 часа в сутки), начинаются с высокой скоростью сбора данных , чтобы захватить первоначальный ответ импульса , а затем переключиться на низкой скорости сбора данных, например, через каждые 5 до 10 мин.
  5. Выберите "Запуск" в программном обеспечении микроскопа для инициирования захвата изображений и захвата изображений в течение 5 мин, чтобы установить базовый уровень для ответа зонда в назначенном ПЗ.
  6. Через 5 мин получения изображения, пипеткой в желаемом агониста или антагониста аналита (например, форсколин при 100 нМ), перемешивают с помощью пипетки, и продолжать визуализацию.

8. FRET калибровки

  1. Система калибровки: С помощью дополнительной калибровки гидрогель, изготовленную, как описано в шаге 6, чтобы получить AEM изображения, по меньшей мере, 6 представительных клеток с использованием тех же критериев FOV, оптических конфигураций, а также набор камерыTings используется для FRET изображений выше (шаги 7.1, 7.2 и 7.3).
    Примечание: Количественное квантового выхода и спектральной чувствительности (QS) для комбинированного зонда и визуализации микроскопа система необходима для "абсолютного" ладу анализа, но не для "относительной" ладу.
    1. Photobleach акцепторного флюорофора путем выбора 5 мин длительного воздействия света возбуждения при полной интенсивности (возбуждение на канале AEM). Используйте узкую диафрагму, чтобы отбелить только клетки, представляющие интерес. Убедитесь в том, что сигнал Aem составляет по меньшей мере на 10% ниже, чем исходного сигнала путем сравнения интенсивности сигнала гистограммы (окно "LUT") до и после фотообесцвечивания. Продолжить фотообесцвечиванию если потеря сигнала составляет менее 90%.
      Примечание: Убедитесь, что донор флуорофор не отбеливают во время этой процедуры с помощью фильтров возбуждения AEM, которые не перекрываются со спектром донор возбуждения.
    2. Приобретать излучения донора при возбуждении донора с теперь беленой акцепторного флуорофора (DEM) насИНГ ту же оптическую конфигурацию, для QE на этапе 7.3.
    3. Вычислить QS на пиксель, как Dem делится на AEM после коррекции фона, как и в разделе 9 ниже. QS = Dem / Aem
    4. Рассчитывают среднее QS среди клеток из клеточных средних значений.
  2. Оценить эффективность присущую ладу зонда (ЭИ), используя калибровочный образец. Побудить максимальную ладу зонда и вычислить Ei = 1 - QE / AEM (х QS), как и в разделе 9 ниже. С другой стороны, использование Ei = CSE / Aem, или Ei вычисляется с использованием обычного анализа конечной точки для эффективности ладу Ei = 1 - (QE / DEM).
    Примечание: Ei требуется для количественного определения абсолютной доли активированных зондов (FAP, то есть доля зондов связывания анализируемого вещества), но не является необходимым для "относительной" FRET анализа.
    1. Пропитайте отклик зонда, стимулируя культуру с агониста аналита производства / активации для зондов, которые увеличивают в FRET при взаимодействии с анализируемым веществом.
    2. Inhibit зонда interactioN с анализируемым веществом с использованием антагониста сигналов для зондов, которые уменьшение FRET после связывания аналита. Примечание: В случае зонда ICUE1, подавляет уровни цАМФ с ингибиторами аденилатциклазу, таких как 2 ', 5'-дидезоксиаденозин (конкретные) или 3-изобутил-метил-ксантин (неспецифический).

9. FRET Коэффициент Расчет

  1. Draw и назначить одну область интереса (ROI) в FOV вблизи клеток для определения фонового уровня (фигура 3В) в каждом FOV в течение долгого времени, но ограничивает ROI в области относительно однородной освещенности по центру изображения (фиг.4А ). Смотрите обсуждение для объяснения вариантов коррекции фона.
    1. С программным обеспечением микроскопа: Выберите стрелку на "Фон ROI Icon" и выберите "Draw Elliptical фона ROI" (другие формы будут работать). Убедитесь в том, что "Keep Offset Обновление фона" выбрано. Активировать соперничаюткрыло фона ROI, нажав на значок фона ROI. С другой стороны, использовать "ROI Icon" и свойства ROI, отмеченные как "использовать в качестве фона ROI" и "трансформирования различны в каждом многоточка".
    2. С ImageJ: С помощью панели инструментов, чтобы выбрать круговую инструмент для рисования. Затем добавьте форму менеджеру ROI через меню "Анализ → Инструменты → ROI Manager". Установите другой цвет для фона ROI в ROI Manager, если это необходимо.
    3. Для каждого FOV и изображения канала (например, QE и AEM), вычесть среднее значение в фоновом режиме ROI на временной точке для создания откорректированного изображения для каждого канала, например, SQE т, р = QE т, р - BQE т, р где т время приобретения, р является FOV (т.е. ху положение), и BQE и bAem являются скалярные значения сигнала в фоновом режиме ROI. Используйте изображение арифметических функций, доступных в программном обеспечении.
      1. WIth программным обеспечением микроскопа, используйте "ROI фона значок" и выберите "Вычитание фона с помощью ROI". В всплывающем окне выберите "Каждое изображение" под "Вычесть фоне ROI на" и выберите "Все кадры" в разделе "Применить к".
        Примечание: Фон ROI должны быть определены в каждом FOV для этой функции , чтобы работать должным образом (например, функция не правильно вычесть фон для FOV с фоном трансформирования если некоторые FOV имеют неопределенные фон трансформирования.).
      2. С ImageJ, используйте "BG вычитанию из ROI" макро написанной Майклом Cammer (http://microscopynotes.com/imagej/macros/).
    4. Сохраните исправленный временные ряды изображений, выбрав пункт "Сохранить как" для следующих этапов анализа.
  2. Определить ROI вокруг ячейки , используя двоичную маску для каждой ячейки при анализе в каждом FOV (рис 4б). Используйте канал AEM порога изображения каждого FOV на старте Oе эксперимента, определить границы ячеек, и определил трансформирования. Сохраните трансформирования.
    1. С помощью микроскопа программного обеспечения: для каждого кадра (т.е. FOV), сначала используйте меню "Binary → Определение порогового значения" и выберите "Применить к текущему кадру". Настройка нижнего порогового значения для выбора ячеек. Затем используйте функцию "Binary → Закрыть", чтобы заполнить отверстия в двоичном маске, если это необходимо. Далее используйте значок ROI, чтобы выбрать "Копировать двоичных чисел в ROI"; двоичный слой автоматически удаляется.
      1. Append трансформирования для последующих кадров в существующий пул трансформирования. Удалите все паразитные трансформирования. Далее "щелкните правой кнопкой мыши" на трансформирования и убедитесь, что их свойства "Использовать в качестве стандартного ROI" и "трансформирования различны в каждом многоточка".
      2. С ImageJ: Для каждого FOV, сначала используйте меню "Изображение → Настройка → Порог". Затем с помощью "Анализ → Анализ частиц" с Показать набросков и добавить к менеджеру выбранного. использование"Binary → Закрыть" для заполнения "дыр" в двоичной маске, если это необходимо. Удалить паразитный трансформирования. Бесплатные плагины доступны для автоматизации этого процесса.
  3. Вычислить QE на основе соотношения FRET в каждом пикселе, SQE / SAEM для относительного анализа (Шаг 10) и Е QE = SQE / (QS х SAEM) для абсолютного анализа (см Шаг 10) с QS , полученного на стадии 8.1. Используйте точку деления с плавающей изображений. Смотрите раздел для обсуждения для объяснения соотношения выводов.
    1. С программным обеспечением микроскопа: С помощью меню "Изображение Операции → Изображение" и выберите "плавающим точка".
    2. С ImageJ: Используйте либо "Process → Калькулятор изображения" функцию или плагин "Calculator_Plus.java". Примечание: В качестве альтернативы, макро "pH_ratioMacro" .txt "может быть адаптирована для расчета соотношения FRET В нем используется коррекция фона макрокоманду, описанный выше, и доступен.
  4. Экспорт средний коэффициент на клетку (то есть, за ROI) в электронную таблицу и графическое программное обеспечение.
    1. С программным обеспечением микроскопа: Используйте либо кнопку экспорта ND в "ROI статистики" управления анализа или кнопку "Экспорт таблицы" в элементе управления анализа "Время анализа".
    2. С ImageJ: Сначала выберите меню "Analyze → Set Измерения" и убедитесь, что "Среднее значение" и "Стандартное отклонение" выбраны. Затем с помощью ROI диспетчера и нажмите кнопку "Measure". Сохранить сгенерированный окно результатов.

Соотношение Анализ 10. FRET

  1. Вычислить среднее клеточное соотношение FRET с течением времени от средних коэффициентов на клетку (вывозимых на шаге 9.4). Рассмотрим базовый FRET соотношение (соотношение перед введением анализируемого вещества) в этом расчете.
    Примечание: Электронная таблица и графическое программное обеспечение используется здесь для построения базовой линии subtrдействовали средние коэффициенты FRET и их стандартная ошибка среднего (SEM) с использованием линейной регрессии по базовой линии , как на шаге 10.1.2 и 10.1.3 ниже (рисунки 5 и 6).
    1. Сравнительный анализ (величина ответа): Нормализация каждую кривую к общему опорному образца (например, необработанный образец.).
    2. Абсолютный анализ (временной ход ответа): Сдвиг кривых на общую начальную точку путем нормализации каждой кривой с ее базового уровня FRET соотношение.
      1. В электронную таблицу и графическое программное обеспечение, перемежать данные (столбцы средних коэффициентов на одну ячейку) с новыми колоннами, таким образом, что каждая оригинальная колонна в паре с новой колонки, содержащей только данные о соотношении за базовый период (отношения до добавлен аналит). Выберите "Вставить столбец", чтобы вставить пустой столбец после каждого столбца данных. Затем скопируйте исходные данные в спаренных пустых столбцов.
      2. В электронную таблицу и графическое программное обеспечение, выберите "Вставить → Новый анализ → Transfoгт Удалить базовую линию "и затем установите" Selected столбец ", чтобы" любой другой ", выберите" считать базовым является линейным ", и выберите" Разница "в разделе" Расчет ".
      3. Рассчитайте среднее соотношение клеточного и описательная статистика. В электронную таблицу и графическое программное обеспечение, выберите "Вставить → Новый анализ → XY → Анализы Row средства с SD или SEM", а затем выберите "Строка средства с SEM" в всплывающем окне.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все получали гидрогелевые предшественники, клетки, и литейные формы, как описано выше. В нагруженные растворы - предшественники клеток были отлиты в PDMS пресс - форм , а затем центрифугировать до гелеобразования / фотосшивающих для иммобилизации клеток вблизи покровного и облегчения ладу анализа изображений (рисунок 1). Гидрогели с прикрепленными покровные были размещены в подготовленных PDMS визуализации скважин для микроскопических изображений (рис 2). Оптические конфигурации и параметры захвата изображений были затем установить , как показано на фигуре 3А. Захват всех четырех связанных каналов FRET изображения для пар флуорофоров CFP-YFP демонстрируется (см в разделе "Оптическая Conf." На рисунке 3), как это необходимо для небинарных зондов. Однако в этой работе только два изображения необходимы для одиночной цепи двоичного ICUE1 зонда, QE = "CFP CFP" и AEM = "YFP YFP" (эмиссионного возбуждения). Несколько ПЗ (позиция хус) были выбраны , в котором несколько топливных элементов проживали в гомогенной области освещения (рисунок 3б). По истечении времени приобретения покадровой, данные сигнала для зонда была экспортирована. Трансформирования для фоновой коррекции сигналов канала и для клеточного анализа были определены с использованием порогами изображений AEM с самого начала экспериментов (рисунок 4). Клетки были отобраны из пула клеток , как те , которые выражают достаточно (не слишком тусклым), но не слишком высока (слишком яркий) зонд (рис 4В). Коэффициенты QE и SE FRET на пиксель при каждом приобретении были рассчитаны с использованием плавающей точкой разделения фона вычитали каналов изображения. Среднее соотношение FRET на ячейку (т.е. за ROI) рассчитывали, нормированная к исходному сигналу перед стимуляцией (т.е. регрессия по базовой линии вычитали из всех временных точках), и наносили на график с погрешностями как стандартная ошибка означают (SEM). И QE и на основе CSE отношения FRET деTect повышение активности цАМФ в хондроцитах при стимуляции форсколин (100 нМ, рисунок 5). Отношение QE FRET был более чувствителен к коррекции фона, чем отношение CSE FRET, потому что сигнал QE был ниже, из-за низкого базального уровня цАМФ активности в хондроциты, заложенным в гидрогели. Оба типа гидрогеля (TR-гель и PC-гель) показали увеличение соотношения FRET с течением времени (рисунок 6), что указывает на повышенную реакцию передачи сигналов цАМФ добавлением форсколина. Как указывает соотношение QE FRET, хондроциты в ПК-гель гидрогелей показывают большее изменение цАМФ ( на рисунке) и более высокий базальный уровень цАМФ (Е QE = 0,19 в PC-гель против E QE = 0,09 в TR-гель, не показано на базовом вычитают рисунке).

figure-results-1
Рисунок 1: Распределение ячеек в фотоотвержденное гидрогеля (PC-гель) сильный>
А: Предшественник клетка нагруженные гидрогель центрифугировали, чтобы максимально увеличить количество ячеек в фокальной плоскости вблизи покровного стекла. Б: Это увеличивает количество клеток в поле зрения, и сводит к минимуму фоновый сигнал от из плоских клеток. (Шкала бар = 200 мкм) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2: Гидрогель в PDMS Блюдо
Гидрогель был помещен высокий PDMS хорошо (10x объем гидрогеля) с покровным основанием для микроскопических изображений и аналита стимуляции. PC-гель гидрогели прозрачны и соединены с покровным так, чтобы они оставались на месте в течение всего теста. В PDMS хорошо может быть больше, чтобы содержать более 10x среду, чем объем гидрогеля с использованием более широкого трепанобиопсия в дополнение к вhicker PDMS лист. (Шкала бар = 2 мм) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3: Конфигурация Приобретение для FRET изображений
A: Приобретение было сконфигурировано для захвата изображения каждые 7 секунд в нескольких местах. Для расчета коэффициента QE FRET, только два канала изображения необходимы для зонда ICUE1 используется здесь (двоичный одноцепочечный зонд), QE = "CFP CFP" и AEM = "YFP YFP" (эмиссионного возбуждения) под "Optical Conf." столбец в закладке Х программного обеспечения микроскопа. B: ( "ПЗ" XY позиции) были выбраны, в которых несколько ячеек проживали в пределах однородной области освещения. Участок под изображением показывает интенсивность освещения вдоль синей линии со стрелкамичто проходит через центр FOV. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 4: Выбор трансформирования для анализа FRET изображений
A: область интереса (ROI), свободной от клеток была выбрана для коррекции фонового сигнала на каждом канале. Изображение бесклеточной гидрогеля вместо этого может быть использован для вычитания фона, если плотность клеток или миграция высока, или если маска затенения не используется, когда клетки не лежат в однородном поле освещения. B: Клеточные трансформирования были выбраны с помощью пороговую изображения и бинарная маскирование канала AEM. Выбор ROI больше, чем клетки отрицательно скажется на вычисление среднего отношения FRET на клетку за счет включения внеклеточного коэффициентов, полученных от фонового пУАЗы. Расчет коэффициента клеточного FRET, используя среднее значение каждого канала в ячейке не рекомендуется, так как это занижает соотношение. (Шкала бар = 50 мкм) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-5
Рисунок 5: Сравнение коэффициентов FRET в Thermoresponsive гидрогеля (TR-гель)
Оба QE и отношения FRET на основе SE обнаружить повышенную активность цАМФ в хондроцитах при форсколина стимуляции. Forskolin представляет собой аденилатциклазу агонист, который индуцирует продукцию цАМФ. FRET , уменьшается , когда зонд ICUE1 связывает цАМФ, и , таким образом , отношение QE FRET (Е QE = SQE / (SAEM х Qs)) возрастает. С другой стороны , отношение ГП FRET , уменьшается , и, таким образом , на графике как E SE = 1 - CSE / SAEM. В гидрогелевые встроен хондроцитов, то QE Fотношение RET является более чувствительным к коррекции фона, чем отношение SE FRET, поскольку QE сигнала низок из-за низкой активности цАМФ базального. Усы = SEM, п = 25. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-6
Рисунок 6: Сравнение FRET соотношение в различных гидрогелей
Хондроциты в обоих типах гидрогелевых ответили на форсколин стимуляции с увеличением цАМФ активности, о чем свидетельствует увеличением коэффициента QE FRET в течение долгого времени. В типа гидрогель воздействует на клеточный ответ через несколько эффектов, в том числе различия в проницаемости по отношению к форсколина и в базальной активности клеточного циклического аденозинмонофосфата (Е QE = 0,19 в PC-гель против E QE = 0,09 в TR-гель, который не показан). Усы = SEM, п для TR-гель= 25, п для PC-гель = 15. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа показывает, как FRET изображений может быть использован для анализа клеточных сигналов в 3D гидрогелей. В то время как предыдущие исследования показали , FRET визуализации клеток , посеянных на гидрогелевых субстратов 35-37, внеклеточных взаимодействий с гидрогелей 38, и молекул , захваченных в гидрогели 39-41, это первая публикация для описания формирования изображения на FRET , основанный внутриклеточный анализ клеток , внедренных в 3D гидрогели. Работа решает несколько вопросов реализации при переводе изображений FRET из 2D в 3D. Во-первых, высокие цели числовой апертуры необходимы для визуализации FRET, чтобы собрать достаточное количество сигнала эмиссии, но они ограничивают глубину резкости. Клетки здесь разрешается слегка оседать через центрифугирование, чтобы увеличить число клеток в фокальной плоскости вблизи стекла, чтобы компенсировать это. Во-вторых, 3D каркасы гидрогелевые могут дрейфовать через поле зрения во время съемки, что затрудняет анализ. Гидрогели здесь соединены с соуerslip, так что они остаются неизменными на протяжении всего эксперимента. В-третьих, выбор соответствующих гидрогелевых композиций для 3D FRET имеет важное значение, так как гидрогели может препятствовать визуализации клеток. Здесь используются прозрачные гидрогели PC-геля и TR-гель. Тем не менее, сбор клеток с центрифугированием в фокальной плоскости вблизи покровного стекла могут быть использованы для клеток изображений в гидрогели с более diffraction.The выбор гидрогеля зависит от условий микроокружения , которые должны моделироваться, которые можно найти в обзоре на гидрогелей 42 , В- четвертых, альтернативный расчет используется здесь для отношения ладу ICUE1 зонда одноцепочечной (то есть Е = QE QE / КАМ) , чтобы свести к минимуму количество каналов изображения , необходимые для анализа и тем самым свести к минимуму фотообесцвечивание. Среднее отношение FRET на ячейку вычисляется как среднее значение коэффициентов на пиксель в пределах ячейки, чтобы свести к минимуму недооценке фактического коэффициента разъедать. Наконец, линейный ратиометрический анализ и средствавычислить активированную фракцию одноцепочечных бинарных зондов описывается.

Есть несколько важных аспектов проведения успешных экспериментов с использованием FRET Widefield микроскопии. Что касается аппаратного обеспечения, камера должна быть достаточно чувствительным, чтобы устранить небольшие изменения сигнала, в результате чего новые научные камеры CMOS и электронного умножителя CCDs лучше подходит, чем обычные CCDs. Чтобы лучше проанализировать пространственное распределение отношения FRET, камера должна обладать как минимум в два раза пространственное разрешение функции рассеяния точки объектива (критерий Найквиста). Это делает двойного вида систем меньше подходят для выполнения этой задачи. Более важным является, чтобы выбрать подходящую скорость получения экспозиции и изображения для данной пары FRET таким образом, чтобы свести к минимуму фотообесцвечивания флуорофоров. Пониженная скорость сбора данных рекомендуется как продолжительность эксперимента увеличивается. Использование быстрых фильтров колес увеличивает частоту дискретизации и количество для анализа ПЗ в то время как избегайтеИНГ регистрационные изображения проблемы с двойным видом и башенки фильтра кубов. Поле неоднородное освещение затрудняет коррекцию фоновой флуоресценции, которая возникает из образца автофлюоресценции и системы камеры шума. Некоторые гидрогели, особенно те ​​, которые содержат коллагеновые белки являются весьма autofluorescent 43,44. Коэффициенты FRET занижены без коррекции фона. Здесь мы используем простой фон метод коррекции , которая опирается на относительно плоской области освещения , которые часто могут быть сконфигурированы с эпи-флуоресцентного освещения над центром изображения (рис 3B, шаг 7.2). Таким образом, этот метод ограничивает клетки, представляющие интерес для тех, кто в этой области освещения. Коррекция фона, описанный здесь не учитывает клеточного автофлюоресценции в длинах волн для чтения для бинарного зонда. В таком случае, немаркированные клетки (не показан датчик с трансфекцией) должны быть отображены в тех же условиях и фона вычитаются. АмIX меченых и немеченых клеток могут быть использованы и немаркированные клетки выбраны для фона ROI. Альтернативные методы, которые обеспечивают для анализа клеток по всему полю изображения включают в себя использование маски затенения, несколько фоновых трансформирования или идентичных образцов без клеток и протокол предоставляется по запросу.

Характерные для визуализации 3D FRET, тестовый ответ очень чувствителен к проницаемости гидрогеля к анализируемым веществом (рисунок 6). Поэтому те же самые гидрогелевые регионы сравниваются по экспериментальным лечения, предпочтительно в точке симметрии геометрии, например, возле центра скэффолду, используемого здесь. В качестве альтернативы, микрофлюидальные камеры / биореакторы могут быть использованы для быстро и равномерно заливать гидрогель с аналит раствором 45. Сигнал FRET может быть не обнаружено (отношение сигнал-шум является слишком низкой), когда аутофлуоресценция гидрогеля слишком высока; следует использовать более тонкий гидрогель или иной датчик (разные флуорофоры).Что касается визуализации 3D FRET в фотоотвержденное гидрогели, рекомендуется использование минимального воздействия облучения и длин волн за пределами возбуждения спектров зонда флуорофоров. LAP может быть использован с видимым источником света при 405 нм , чтобы в дальнейшем свести к минимуму потенциальные повреждения клеток 31,46. Тем не менее, используя LAP с длиной волны 365 нм облучения рекомендуется, так как это сводит к минимуму обесцвечивание зонда. 365 нм лежит в хвостовой части спектра возбуждения CFP-донора, в то время как 405 нм лежит на пике возбуждения. В качестве альтернативы, выражение зонд может быть позволено восстановить в течение одного дня. Применение бинарных зондов сводит к минимуму проблемы чувствительности к различиям в уровнях экспрессии и в области молекулярной диффузии донора и акцептора флуорофоров. Небинарных зонды могут быть использованы, но с SE вместо QE визуализации и дополнительной коррекции для спектральной проступание возбуждения и излучения (см. Ниже) Кроме того, низкая коммерческая доступность и сложность при проектировании FRET зондовможет быть помехой. Наиболее важным фактором для успешных экспериментов остается правильной коррекции и анализа сигналов флуоресценции.

Альтернативный расчет соотношения FRET используется несколько дополнительных причин помимо минимизации фотообесцвечивания. Для бинарных одноцепочечных зондов обычно сообщают отношение эмиссии акцепторного при возбуждении донора (сенсибилизированная излучение, SE) для излучения донора при возбуждении донора (гас излучение, QE), т.е. FRET отношение = SE / QE 25,47,48. SE / QE является нелинейным по отношению к изменениям в эффективности FRET 21,22,47. А именно, отношение имеет экспоненциально нелинейное отношение к присущей эффективности FRET зонда (ЭИ) (Donius, АЕ, Taboas, Дж.М. неопубликованные. (2015)), с отношением большей линейной для Ei меньше , чем приблизительно 15%. SE / QE будет также занижает долю активированных зондов (FAP, то есть доля зондов связывания анализируемого вещества). Therefoповторно, анализ SE / QE требует громоздкого равновесной дозы исследования реакции и подбора кривой. К счастью, отношения SE или QE к эмиссии акцепторного под акцептора возбуждения (AEM) являются линейными относительно Ei и FAP, т.е. лада отношения SE / AEM и QE / AEM. SE / Aem часто используется для бинарных зондов и только требует калибровки конечной точки (на нет датчика активности и полной активности зонда), но базальный клеточный сигнальный делает это трудно. Для того, чтобы устранить необходимость калибровки конечной точки, SE может быть исправлена ​​(CSE) для спектрального перекрытия донора и акцептора возбуждения и излучения спектров (спектральное проступание) и квантового выхода и спектральной чувствительности (QS) комбинированных флуорофоров зонда и микроскопом система формирования изображения. Скорректированный коэффициент SE FRET на основе CSE определяет наблюдаемую эффективность FRET зондов в пределах каждого пикселя изображения, т.е. E SE = CSE / AEM. Коммерческое и бесплатное программное обеспечение доступно для исправления SE для этих эффектов иотсылаем читателя к работе Chen и Periasamy 2006 для детального описания методов 50. Однако вычисления E SE требует захвата трех каналов изображения на временной точке (SE, QE, Aem). Поэтому в данной работе мы также используем альтернативный коэффициент FRET Е QE = 1 - QE / КАМ, которая требует захвата только двух каналов изображения (QE и AEM). Расчет E QE из этих каналов требует только коррекции AEM для QS (КАМ = Aem х QS). QS = Dem / Aem легко оценивается с использованием двух изображений из одного образца калибровки, где Dem является донором выбросов при возбуждении донора с акцепторной отбеленной. FAP в любой момент времени может быть рассчитана путем сравнения E SE или E QE к Ei зонда.

В конечном счете, выбор соотношения FRET (E SE = CSE / Aem против Е QE = QE / КАМ) должна основываться на рассмотрении типа зонда и каналов с лучшим сигналом. Обаpproaches включают коррекцию фона шума изображений в кадре, как описано выше для учета изменений в автофлюоресценции с течением времени. Они не берут на себя перекрытие AEM возбуждающего света в Демодулятора спектра возбуждения, которое часто происходит из-за зонда конфигурации фильтра проектирования и микроскопа. Одноцепочечные зонды могут использовать либо и выбор основан на лучший сигнал зонда (яркость) к шуму камеры и фонового сигнала на SE и QE каналов. Для зонда ICUE1 и экспериментальных условиях, используемых здесь (клеточные и гидрогелевые типов), SE имеет более сильный сигнал, чем QE. Двойные цепи зондов требуют использования E SE в связи с неуплатой эквимолярного распределения донора и акцептора флуорофоров. Для зондов , что уменьшение FRET при связывании анализируемого вещества , такие как ICUE1, лада эффективность может быть "перевернутой" представить положительное изменение сигнализации при связывании анализируемого вещества , как мы делаем здесь, с E SE = 1 - CSE / AEM или Е QE = QE / (Aem х QS).

Анализ йе FAP чувствителен к правильной коррекции соотношения FRET и к оценке Ei. Его можно оценить с той же калибровочного образца , используемого для QS и обычной конечной точки FRET анализа эффективности , как Ei = 1- (QE / DEM) (QE изображение с последующим акцепторного фотообесцвечивания и Dem изображения) 28, но необходимо соблюдать осторожность , чтобы свести к минимуму случайное отбеливание донора. Описан модифицированный вариант , где оценка Демодулятор основана на AEM с поправкой на QS является замещенным, т.е. Ei = 1 - (QE / AEM (х СМО)). С другой стороны, Ei = CSE / Aem могут быть использованы. Оценка Ei в живых клетках требует, чтобы все зонды быть доведен до полной ладу. Это трудно реализовать на практике для зондов, таких как ICUE1, что уменьшение FRET после связывания аналита. В пробирке на основе расчета Ei с использованием клеточных лизатов и очищенного анализируемого вещества лучше, но выходит за рамки данной работы. Здесь мы рекомендуем использовать 2 ', 5'-дидезоксиаденозин для уменьшения цАМФ в клетках. Тем не менее, относительная FAP может бе рассчитывается с использованием оценки Ei, производный от базового уровня сигнализации. По этим причинам, исследования наиболее часто сообщают соотношение FRET (как это было сделано здесь) или относительную FAP, основанную на конечной точке калибровки, где сигнализацию базовой линии перед добавлением агонист нижней границы и сигнал после добавления второго агонист, который насыщает сигнализации верхняя связанным. Форсколин часто используется в качестве контрольного агониста насыщать сигнала цАМФ. С другой стороны, аналог цАМФ может быть использован, такой как 8-Bromoadenosine 3 ', 5'-циклического монофосфата. Рекомендуется использовать положительные элементы управления, используемые при завершении исследований с целью выявления потенциальных изменений в сигнальном пути среди экспериментальных методов лечения.

Расчет среднего ответа сигнализации на клетку необходимо учитывать несколько факторов. Во- первых, среднее соотношение FRET , должно быть рассчитано как среднее значение коэффициентов в каждом пикселе в пределах соты, то есть, (Σ (QE/cAem)) / (количество пикселей), вместо раTiO среднего QE и AEM в клетке, то есть, (ΣQE) / (ΣcAem). Хотя последний не требует тщательной маскировки, как фоновый шум низкий, сильно недооценивает истинное среднее соотношение ладу. Тем не менее, отношения пикселов требуют вычисления с плавающей запятой и тщательной двоичную маскирование площади ячейки для определения трансформирования и избежать включения паразитных коэффициентов, полученных от фонового шума вне клетки. Вся площадь клетки должна быть определена количественно, чтобы избежать смещения, результаты по форме клеток. Маскирующий возможно, должны быть переопределены с течением времени в зависимости от изменений в форме и миграции клеток. С другой стороны, ROIS больше, чем клетки могут быть использованы, если критерии исключения определяются для удаления попиксельные из QE и сигналов AEM, которые падают значительно ниже уровней клеточного и находятся вблизи уровней фона. Описанные методы анализа подробно описываются основные шаги, используемые в данной работе для анализа FRET без специализированных программ / плагинов. производители микроскопов и другие производители продают дополнительный модульs для их микроскопа программное обеспечение, которое поддерживает автоматизированный логометрической и ладу анализ. Аналогично, ImageJ программного обеспечения публичного домена имеет несколько плагинов, доступных для частиц и анализа FRET, такие как RiFRET. Во-вторых, средний коэффициент FRET основе пикселей занижает истинное среднее отношение 3D-клеточной структуры, так как используется 2D-изображение. 2D-сигналы представляют и среднее вдоль оси. Расчет пространственного распределения 3D коэффициентов FRET в живых клетках невозможно без высокой скорости 3D визуализации (например., Используя вращающийся диск конфокальной микроскопии). Это является проблемой для 2D и 3D культур, но имеет больший эффект в 3D, как более клеточной структуры существует вне плоскости. Это вызывает большое беспокойство для зондов, которые локализуются в клеточных структурах, таких как плазма мембраны EPAC1 зонда PM-МЦОУ. См Spiering и др. 2013 для предложений для корректировки толщины ячейки воздействия на соотношение расчетов 24. Анализ распределения AEM может быть использован дляобнаружить, если зонд накапливается в регионах клеток и формирования изображения плоскости корректировалась. Это также поможет интерпретировать пространственное распределение коэффициентов FRET и устранить ложные результаты, например., Определение насыщения зонда (т.е. низкий Aem регион будет иметь низкую концентрацию зонда и может проявлять насыщение зонда и высокое соотношение FRET). В-третьих, различные FRET базовые уровни могут указывать на разницу в эффективности трансфекции, зондировать экспрессию или базальный сигналов между экспериментальными группами. "Сравнительный анализ" (этап 10.1.1) помогает устранить дрейф в соотношении FRET с течением времени, если присутствует. Это облегчает сравнение относительной величины реакций между образцами, но затрудняет сравнение с временной ход реакции для эталонного образца (контрольный участок является плоская линия). "Абсолютный анализ" (этап 10.1.2) облегчает сравнение скорости реакции через образцы, но затрудняет сравнение величины ответа, потому что каждая строка масштабируется с помощью dissimИлар константа. Исследования часто используют линейную регрессию по базовой линии для коррекции дрейфа в соотношении FRET в течение долгого времени.

Описанный метод 3D FRET является полезным и практичным способом изготовить и выполнять замедленную съемку клеток, нагруженных 3D гидрогелей, которые могут быть применены к другим пробников и методов визуализации. Другая система FRET, к тому же одноцепочечных бинарных зондов потребует более сложной коррекции сигналов интенсивности на основе, как описано выше. С другой стороны, время жизни флуоресценции визуализации FRET (FLIM-FRET) могут быть использованы для расчета эффективности FRET за счет изменения времени жизни испускания донора зонда. В отличие от интенсивности на основе FRET, FLIM-FRET нечувствительна к фоновому шуму, спектрального проступание, квантовой эффективности и детектора спектральной чувствительности 2. Тем не менее, FLIM системы являются дорогостоящими, сложными и редко, и лучше всего работают с флуорофоров с одного распада показателем и не FLIM стекания 49. Описанный способ также может быть использован с моповторно продвинутых микроскопов платформ (например., FRET-TIRF, анизотропии флуоресценции, и спектральная корреляция FRET). Применяя этот метод к 3D визуализации с высокоскоростным конфокальной и многофотонной микроскопии облегчит анализ распределения субклеточном передачи сигналов ответа и повышение точности сигнализации анализа. Этот метод 3D FRET позволит передовые исследования в области клеточной биологии смоделированных 3D клеточных микросреды. Как таковой, он может быть легко применен к области фармакологии и регенеративных потребностей в лекарственных средствах, в том числе изучение межклеточную передачу сигналов и скрининга лекарств в ответ сконструированных гидрогель на основе microtissues.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет никаких противоречий.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы признают финансовую поддержку школы зубоврачебной медицины в Университете Питтсбурга, Национальных институтов здравоохранения премии K01 AR062598 и грант P30 DE030740. Авторы также благодарят доктора Jin Zhang для плазмиды ICUE1, Уэйн Расбанд для разработки ImageJ и Майкл Cammer для макроса ImageJ.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Полидиметилсилоксан (PDMS) [Набор эластомеров Sylgard 184]Fisher Scientific (Ellsworth Adhesives)NC0162601Реагенты
Диметакрилат полиэтиленгликоля (PEGDM)Получен по Lin-Gibson с ПЭГ из Sigma Aldrich95904Реагенты
3-(Триметоксисилил)пропилметакрилатSigma AldrichM6514Реагенты
3- глицидоксипропилтриметоксисиланСигма Олдрич440167Реагенты
ДиметилфенилфосфонитСигма Олдрич149470-5гРеагенты
2,4,6-триметилбензоил хлоридFisher ScientificAC244280100Реагенты
2-бутанонFisher ScientificAC149670010Реагенты
Бромид литияFisher ScientificAC199871000Реагенты
ИзопропанолСигма Олдрич190764Реагенты
Сигмакот (силиконизирующий реагент)Сигма ОлдричSL2Реагенты
Толуол Fisher ScientificAC36441-0010Реагенты
Фосфатный буферный физиологический раствор (PBS)ГиклонSH3025601Реагенты
Opti-MEM Восстановленная сывороточная среда, без фенола красного (среда без фенола и сыворотки)Life Technologies11058-021Реагенты
FuGENE HD Реагент для трансфекции (реагент для трансфекции)PromegaE2311Реагенты
Cellstripper (клетка раствор диссоциации)Corning25-056-CIРеагенты
Фактор роста Сниженный Матригель, Фенол СвободныйCorning356231Реагенты
ForskolinSigma AldrichF6886Реагенты
Наконечники для пипеток (10,200,1,000; l) Fisher Scientific02-707-474, 02-707-478, 02-707-480Одноразовое лабораторное оборудование
Неопудренные смотровые перчаткиFisherScientific 19-149-863BОдноразовое лабораторное оборудование
Алюминиевая фольгаFisherScientific 01-213-100Одноразовое лабораторное оборудование
Биопсийный перфоратор (3 мм)Miltex3332Одноразовое лабораторное оборудование
Стеклянные покровные стеклаFisher Scientific12-544CОдноразовое лабораторное оборудование
Стеклозащитные стекла с предварительно нанесенным покрытием (эпоксисилан)ArrayitCCSLОдноразовое лабораторное оборудование
Стеклянное стеклоFisher Scientific12550DОдноразовое лабораторное оборудование
Стерильные флаконы (15 мл, 50 мл конические)Fisher Scientific14-959-70C, 14-959-49AОдноразовое лабораторное оборудование
Чашка для клеточных культур (6- ну)Falcon351146Одноразовое лабораторное оборудование
Эпифлуоресцентный микроскоп с моторизованным столикомNikonMEA53100 (Eclipse TiE Inverted)Большое/одноразовое лабораторное оборудование
Регулируемый держатель образца для XY StageNikon77011393Одноразовое лабораторное оборудование
60X (1.3 NA) объектив (CFI Plan Apochromat 60XH Lamda)NikonMRD01605Одноразовое лабораторное оборудование
CFP/YFP источники света и держатели фильтров возбуждения/излучения (источник света Lambda и колесо, система фильтрации излучения Lambda)Nikon(реселлер Sutter Instrument)77016231, 77016088Одноразовое лабораторное оборудование
Набор фильтров CYF/YFP Nikon(Chroma Technology Corp)77014928Одноразовое лабораторное оборудование
Фотоаппарат (ORCA Flash 4.0 v1)Nikon (Hamamatsu) реселлер)77054076Одноразовое лабораторное оборудование
NIS-Elements 40.20.02 программное обеспечение для микроскопа)NikonMQS31100 Одноразовое лабораторное оборудование
Prism (программное обеспечение для работы с электронными таблицами и графиками)GraphPad Software, IncVersion 6Одноразовое лабораторное оборудование
OmniCure S1000 UV Spot Tempering Lamp System с фильтром 365 нм или другим источником света (λ = 365 или 405)OmniCureS1000Большое/одноразовое лабораторное оборудование
Pipette Aid Друммонд Сайентиал Ко. DP-100Одноразовое лабораторное оборудование
ГемацитометрHausser ScientificReichert Bright-Line 1475Одноразовое лабораторное оборудование
Вакуумная адсорбционная камера/дегазатор Любоекрупное/одноразовое лабораторное оборудование
Капюшон для культуры тканей ЛюбоеБольшое/одноразовое лабораторное оборудование
Химический вытяжной шкаф ЛюбоеБольшое/неодноразовое лабораторное оборудование
ПечьЛюбоеБольшое/неодноразовое лабораторное оборудование
ШпательЛюбоеодноразовое лабораторное оборудование
СтаканЛюбоеодноразовое лабораторное оборудование
Инкубатор Любоекрупное/одноразовое лабораторное оборудование

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. Imaging molecular interactions in living cells by FRET microscopy. Curr. Opin. Chem. Biol. 10 (5), 409-416 (2006).
  2. Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr. Opin. Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).
  3. Lohse, M. J., Nuber, S., Hoffmann, C. Fluorescence/bioluminescence resonance energy transfer techniques to study G-protein-coupled receptor activation and signaling. Pharmacol Rev. 64 (2), 299-336 (2012).
  4. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J. Cell Sci. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  5. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
  6. Mseka, T., Bamburg, J. R., Cramer, L. P. ADF/cofilin family proteins control formation of oriented actin-filament bundles in the cell body to trigger fibroblast polarization. J. Cell Sci. 120 (24), 4332-4344 (2007).
  7. Holowka, D., Sheets, E. D., Baird, B. Interactions between Fc(epsilon)RI and lipid raft components are regulated by the actin cytoskeleton. J. Cell Sci. 113 (Pt 6), 1009-1019 (2000).
  8. Alenghat, F. J., Ingber, D. E. Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix, and integrins. Sci Signaling. (119), (2002).
  9. Guilak, F., et al. Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix. Cell stem cell. 5 (1), 17-26 (2009).
  10. Polacheck, W. J., Li, R., Uzel, S. G., Kamm, R. D. Microfluidic platforms for mechanobiology. Lab Chip. 13 (12), 2252-2267 (2013).
  11. Burdick, J. A., Anseth, K. S. Photoencapsulation of osteoblasts in injectable RGD-modified PEG hydrogels for bone tissue engineering. Biomaterials. 23 (22), 4315-4323 (2002).
  12. Benoit, D. S. W., Schwartz, M. P., Durney, A. R., Anseth, K. S. Small functional groups for controlled differentiation of hydrogel-encapsulated human mesenchymal stem cells. Nat. Mater. 7 (10), 816-823 (2008).
  13. Tsang, V. L., et al. Fabrication of 3D hepatic tissues by additive photopatterning of cellular hydrogels. FASEB J. 21 (3), 790-801 (2007).
  14. Zhu, J., Marchant, R. E. Design properties of hydrogel tissue-engineering scaffolds. Expert Rev. Med. Devices. 8 (5), 607-626 (2011).
  15. Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33 (26), 6020-6041 (2012).
  16. Kumbar, S. G., Laurencin, C. T., Deng, M. Natural and Synthetic Biomedical Polymers. , Elsevier. (2014).
  17. Kirschner, C. M., Anseth, K. S. Hydrogels in Healthcare: From Static to Dynamic Material Microenvironments. Acta Mater. 61 (3), 931-944 (2013).
  18. Guvendiren, M., Burdick, J. A. Engineering synthetic hydrogel microenvironments to instruct stem cells. Curr Opin Biotechnol. 24 (5), 841-846 (2013).
  19. Gulrez, S. K. H., Al-Assaf, S., Phillips, G. O. Progress in Molecular and Environmental Bioengineering - From Analysis and Modeling to Technology Applications, Ch. 5. Capri, A. , InTech. Europe. 117-149 (2011).
  20. Iza, M., Stoianovici, G., Viora, L., Grossiord, J. L., Couarraze, G. Hydrogels of poly(ethylene glycol): mechanical characterization and release of a model drug. J. Controlled Release. 52 (1-2), 41-51 (1998).
  21. Deligkaris, K., Tadele, T. S., Olthuis, W., van den Berg, A. Hydrogel-based devices for biomedical applications. Sens. Actuators, B. 147 (2), 765-774 (2010).
  22. Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophys. J. 16 (9), 1055-1069 (1976).
  23. Yuan, L., Lin, W., Zheng, K., Zhu, S. FRET-Based Small-Molecule Fluorescent Probes: Rational Design and Bioimaging Applications. Acc. Chem. Res. 46 (7), 1462-1473 (2013).
  24. Spiering, D., Bravo-Cordero, J. J., Moshfegh, Y., Miskolci, V., Hodgson, L. Quantitative ratiometric imaging of FRET-biosensors in living cells. Methods Cell Biol. 114, 593-609 (2013).
  25. Kikuchi, K. Ch 42, Nano/Micro Biotechnology. Advances in Biochemical Engineering Biotechnology. Nagamune, I. E. 119, Springer. Berlin Heidelberg. 63-78 (2010).
  26. Van Dyk, T. K., et al. Rapid and sensitive pollutant detection by induction of heat shock gene-bioluminescence gene fusions. Appl Environ Microbiol. 60 (5), 1414-1420 (1994).
  27. Park, M., Tsai, S. L., Chen, W. Microbial biosensors: engineered microorganisms as the sensing machinery. Sensors. 13 (5), 5777-5795 (2013).
  28. Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32 (9), 407-414 (2007).
  29. Lin-Gibson, S., et al. Synthesis and characterization of PEG dimethacrylates and their hydrogels. Biomacromolecules. 5 (4), 1280-1287 (2004).
  30. Majima, T., Schnabel, W., Weber, W. Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinates as Water-Soluble Photoinitiators - Generation and Reactivity of O=P(C6h5)(O-) Radical-Anions. Makromol Chem. 192 (10), 2307-2315 (1991).
  31. Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
  32. Zhou, J., Ellis, A. V., Voelcker, N. H. Recent developments in PDMS surface modification for microfluidic devices. Electrophoresis. 31 (1), 2-16 (2010).
  33. DiPilato, L. M., Cheng, X., Zhang, J. Fluorescent indicators of cAMP and Epac activation reveal differential dynamics of cAMP signaling within discrete subcellular compartments. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (47), 16513-16518 (2004).
  34. Occhetta, P., et al. Fabrication of 3D cell-laden hydrogel microstructures through photo-mold patterning. Biofabrication. 5 (3), 035002(2013).
  35. Kubow, K. E., et al. Crosslinking of cell-derived 3D scaffolds up-regulates the stretching and unfolding of new extracellular matrix assembled by reseeded cells. Integr. Biol. 1 (11-12), 635-648 (2009).
  36. Legant, W. R., Chen, C. S., Vogel, V. Force-induced fibronectin assembly and matrix remodeling in a 3D microtissue model of tissue morphogenesis. Integr. Biol. 4 (10), 1164-1174 (2012).
  37. Cameron, A. R., Frith, J. E., Gomez, G. A., Yap, A. S., Cooper-White, J. J. The effect of time-dependent deformation of viscoelastic hydrogels on myogenic induction and Rac1 activity in mesenchymal stem cells. Biomaterials. 35 (6), 1857-1868 (2014).
  38. Kong, H. J., Polte, T. R., Alsberg, E., Mooney, D. J. FRET measurements of cell-traction forces and nano-scale clustering of adhesion ligands varied by substrate stiffness. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (12), 4300-4305 (2005).
  39. Poehler, E., et al. Microchamber arrays with an integrated long luminescence lifetime pH sensor. Anal. Biochem. , 1-9 (2015).
  40. Son, K. J., Shin, D. S., Kwa, T., Gao, Y., Revzin, A. Micropatterned Sensing Hydrogels Integrated with Reconfigurable Microfluidics for Detecting Protease Release from Cells. Anal. Chem. 85 (24), 11893-11901 (2013).
  41. Aimetti, A. A., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Human Neutrophil Elastase Responsive Delivery from Poly(ethylene glycol) Hydrogels. Biomacromolecules. 10 (6), 1484-1489 (2009).
  42. Grieshaber, S. E., Jha, A. K., Farran, A. J. E., Jia, X. Biomaterials for Tissue Engineering Applications: A Review of the Past and Future Trends, Ch 2. Burdick, J. A., Mauck, R. L. , Springer-Verlag. 9-46 (2011).
  43. Chiu, Y. C., Brey, E., Pérez-Luna, V. A Study of the Intrinsic Autofluorescence of Poly (ethylene glycol)-co (L -Lactic acid) Diacrylate. J. Fluoresc. 22 (3), 907-913 (2012).
  44. Dewitt, D. D., Kaszuba, S. N., Thompson, D. M., Stegemann, J. P. Collagen I-Matrigel Scaffolds for Enhanced Schwann Cell Survival and Control of Three-Dimensional Cell Morphology. Tissue Eng., Part A. 15 (10), 2785-2793 (2009).
  45. Taboas, J. M., Tuan, R. S., Hudson, S. D. Bioreactor device, and method and system for fabricating tissues in the bioreactor device. United States patent. , PCT/US2006/028417 (2014).
  46. Fedorovich, N. E., et al. The effect of photopolymerization on stem cells embedded in hydrogels. Biomaterials. 30 (3), 344-353 (2009).
  47. Vandame, P., et al. Optimization of ERK activity biosensors for both ratiometric and lifetime FRET measurements. Sensors. 14 (1), 1140-1154 (2013).
  48. Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO Rep. 5 (12), 1176-1180 (2004).
  49. Klarenbeek, J. B., Goedhart, J., Hink, M. A., Gadella, T. W., Jalink, K. A mTurquoise-based cAMP sensor for both FLIM and ratiometric read-out has improved dynamic range. PLoS ONE. 6 (4), e19170(2011).
  50. Chen, Y., Periasamy, A. Intensity range based quantitative FRET data analysis to localize protein molecules in live cell nuclei. J. Fluoresc. 16 (1), 95-104 (2006).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Widefield MicroscopyCyclic AMP SignalingChondrocyte CellsPhotocrosslinking HydrogelThermoresponsive HydrogelRatiometric FRET ProbesQuenched Emission FRETBackground Subtraction

Похожие статьи