Методическая статья

Фенотипическая и функционального анализа активированных регуляторных Т-клеток, выделенных из хронического лимфоцитарного хореоменингита инфицированных вирусом мышей

DOI:

10.3791/54138

⸱

22 июня 2016 г.

 ,  , 
1Department of Biochemistry, College of Life Science & Biotechnology, Yonsei University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем протокол для анализа фенотипа регуляторных клеток T (T-reg), выделенных у наивных и хронических мышей, инфицированных вирусом лимфоцитарного хориоменингита. Кроме того, мы предлагаем процесс оценки подавляющей активностиТ-рег-клеток.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Регуляторные Т (Т р) клетки, которые выражают Foxp3 как транскрипционный фактор, являются подмножествами CD4 + Т - клеток. Т - клетки играют Reg критическую роль в иммунной толерантности и поддержания гомеостаза путем регуляции иммунного ответа. Основная роль клеток Т рег является подавление пролиферации эффекторных Т (Т эфф) клеток и выработку цитокинов , таких как IFN-gamma, TNF-alpha и IL-2. Было показано , что способность Т Reg клеток к ингибировать функцию Т - клеток эфф усиливается во время хронической инфекции патогеном и развития рака. Для уточнения функции клеток Т рег под покоящихся или воспаленных условиях, разнообразие лабораторных анализов подавления в с помощью мыши или человека Т - клетки REG были изобретены. Основной целью данного исследования является разработка метода для сравнения различий в фенотип и супрессивной функции между отдыхавших и активированные Т регклетки. Для выделения активированные Reg Т - клеток, мышей инфицировали вирусом лимфоцитарного хореоменингита (LCMV) клона 13 (CL13), хроническое напряжение LCMV. Клетки Т рег , выделенные из селезенки LCMV CL13-инфицированных мышей обнаруживалось как активированный фенотип и повышенную активность по сравнению с супрессивной покоящихся клеток Т - Reg , выделенных из нативных мышей. Здесь мы опишем базовый протокол для анализа экс естественных условиях фенотипа , чтобы отличить активированные клетки Т - REG от покоя Т рег клеток. Кроме того, мы опишем протокол для измерения подавляющей активности полностью активированных клеток Т рег.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Регуляторные Т (Т р) клетки экспрессируют Forkhead коробки P3 (FOXP3) в качестве фактора транскрипции для их развития и функции 1. Кроме того, клетки Т - Reg выражают различные другие молекулы , такие как CD25 , 2, ген-лимфоцитами активации 3 (LAG-3) 3, индуцированной глюкокортикоидами фактор некроза опухоли рецепторов 4, и цитотоксические Т-лимфоцит-ассоциированный белок 4 (CTLA-4) 5 на их поверхности, или внутриклеточной области. При хронической инфекции с различными видами патогенов , таких как вирусы, бактерии 6,7 8,9 и паразитов 10-12, или в процессе развития рака 13,14, клетки Т рег дифференцируются в активированных клетках, демонстрируя повышенную функцию подавляющий нацеливание эффекторных CD4 + и CD8 + Т - клеток. Ряд работ предположили , что расширенные и активированные Т - клетки рег способствуют обесцененных RESPONS CD8 + Т - клетоке во друга ретровируса (FV) инфекции 15-17. FV-индуцированных Т рег клетки ингибируют IFN-gamma или экспрессию гранзимом и цитотоксическую реактивность CD8 + Т - клеток 15-17. Кроме того, в модели вирусной инфекции простого герпеса, сообщалось , что истощение клеток CD4 + CD25 + Т рег привело к расширению вирус-специфических CD8 + Т - клеток и повреждения тяжелой ткани за счет инфильтрации immunopathogenic CD4 + Т - клеток 18-20.

Мыши инфицированных хронически штаммом вируса лимфоцитарного хориоменингита клон 13 (LCMV CL13) 21-24 широко используются для характеристики фенотипа и функции эффекторных Т - клеток (Т EFF) и Т - клеток рег при хронической вирусной инфекции. Во время хронической инфекции LCMV, вирус-специфические Т эфф клетки постепенно теряют свою функцию эффекторной и разрядиться T (T л.д.) клетки. С другой стороны, Tрег клетки усиливают их способность подавлять реакцию вирус-специфических Т - клеток 25. Снижение в функционировании емкости ЕФФ Т - клеток можно объяснить несколькими факторами , такими как повышающей регуляции ингибиторных рецепторов на эфф Т - клеток, измененную функцию антиген-представляющих клеток, продукции иммунорегуляторных цитокинов и увеличение частоты или расширенной функции Т рег 26 клетки. Среди факторов , участвующих в подавлении Т - клеток, программируемая гибель клеток белок-1 (ПД-1) -expressing клетки EXH Т и Т - клетки , Reg широко рассматривается в качестве признаков антигена персистенции и ингибирующее среды. Недавно было сообщено о том, что блокада PD-1 и пути абляции клеток Т рег приводить к усилению функции Т - клеток и снижение вирусной нагрузки во время LCMV хронической инфекции 27. Кроме того, клетки Т рег активируются при хронической инфекции мышей с LCMV 23,25 и их подавляющая функция усиливается 25. PD-1 сильно экспрессируется на Т рег клеток, а также Т - клетки EXH, а уровень PD-1 , выраженное рег Т - клеток коррелирует с силой , подавляющей функции ингибировать пролиферацию Т - клеток на 25.

Здесь мы опишем метод для сравнения характеристик активированных Т - клеток , выделенных из рег мышей , инфицированных LCMV CL13 и клеток покоящихся Т рег , выделенных из наивных мышей. Кроме того, мы объясняем ряд процессов , чтобы отделить активированные клетки Т - REG и проверяет их ех естественных фенотипа, а также измерить их подавляющую активность в пробирке.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании мышей содержали в определенной патогена объекта животного научно-исследовательского центра Йонсейского Лаборатория Йонсей. Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами корейской пищевых продуктов и медикаментов с использованием протоколов, утвержденных Международной уходу и использованию животных комитета научно-исследовательского центра Йонсейского лабораторных животных в Йонсей путем.

1. Приготовление растворов

  1. Приготовьте 2% RPMI носитель путем разбавления эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) до 2% и пенициллин-стрептомицина до 1% в RPMI
  2. Подготовка полной среды RPMI. Для RPMI СМИ добавляют 10% FBS, 1% пенициллина-стрептомицина, 1% L-глутамина и 50 мкМ 2-меркаптоэтанола.
  3. Подготовить флуоресценции активированного сортировки клеток (FACS) буфер. Для этого, добавка забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) с 2% FBS.
  4. Приготовьте T буфер выделения клеток. Для этого дополнения PBS с 2% FBS и 2 мМ ethylenediaminetetraacetic кислоты.

2. Выделение лимфоцитов селезенки

  1. Удалить селезенке из наивных или LCMV CL13-инфицированных мышей , как описано выше 19 и поместить их в 60 мм х 15 мм чашки Петри , содержащие 10 мл 2% RPMI СМИ.
    Примечание: В данном исследовании экспериментов, от 5 до 6 - недельного возраста C57B1L / 6J самок мышей получали 2 × 10 6 бляшкообразующих единиц (БОЕ) из LCMV CL13 через внутривенные инъекции через хвостовую вену. Жертвоприношение мышей на 16 день после инфицирования (16 d Pi) 25. Анализ GE-совпадающая наивные мыши были в тот же день.
  2. Поместите клеточный фильтр в 50 мл пробирку и промыть его с 2 мл 2% RPMI сред. Поместите селезенку на клеточный фильтр 70 мкм и растереть, используя поршень шприца. Промыть фильтр грубой очистки клеток с 2 мл 2% RPMI СМИ и удалить его из 50 мл трубки.
  3. Заполните трубку с помощью 2% RPMI сред и центрифуге при 300 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Удалите супернатант и ресуспендируютОсадок клеток в 1 мл ACK лизирующего буфера. Инкубируйте образцы при комнатной температуре (КТ) в течение 5 мин.
    Примечание: Объем ACK лизирующего буфера было указано выше для одного селезенки. Расширить объем соответственно для объединенных пробах селезенки.
  4. Заполните трубку с помощью 2% RPMI сред и центрифуге при 300 мкг в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Жидкость над осадком сливают и клетки вновь суспендируют при плотности 1 х 10 7 клеток / мл в полной среды RPMI.
    Примечание: Для подсчета живых клеток, пятно клеток с трипановым синим и рассчитывать только живые клетки, которые не окрашивали с использованием гемоцитометра.

3. Фенотипирование селезеночной обычных Т (Т конв) клетки и Т - клеток рег

Примечание: Перед изоляции Т рег клеток, исследовать фенотип лимфоцитов селезенки , выделенных из нативных или инфицированных мышей путем окрашивания клеток с различными антителами и анализировать их с помощью проточной цитометрии.

  1. Передача 50 мкл клеток(5 х 10 5 клеток) среди общего количества лимфоцитов селезенки в каждую лунку нового U-дном 96-луночного планшета и добавляют 150 мкл буфера FACS в каждую лунку. Центрифуга при 300 мкг в течение 2 мин при температуре 4 ° С.
  2. Удалите супернатант. Перемешайте осадок клеток и добавляют 200 мкл буфера FACS в каждую лунку. Центрифуга при 300 мкг в течение 2 мин при температуре 4 ° С (2 раза).
  3. Готовят смесь антител для окрашивания маркеров клеточной поверхности в 50 мкл буфера FACS на лунку со следующими антителами и реагентами. Анти-CD4 фиолетовый краситель, анти-CD25-зеленый краситель, анти-PD-1-фиолетовый краситель, анти-CD8 PerCP-Cy5.5 реагент обнаружения жизнеспособность красителя и клеток в ближней инфракрасной (ИК) люминесцентная реактивный краситель.
    Примечание: Для дальнейшего анализа фенотип активированных Т - клеток рег, анти-CD103 23,25 могут быть добавлены для клеточной поверхности габаритного окрашивания.
  4. Ресуспендируют осадок клеток с 50 мкл коктейля антител на лунку. Инкубировать в течение 20 мин в темноте при температуре 4 ° С. Вымойте клетки дваждыFACS-буфер путем центрифугирования при 300 мкг в течение 2 мин при температуре 4 ° С.
  5. После заключительной стадии промывки, сливают надосадочную жидкость и фиксации клеток в течение 20 мин в темноте при 4 ° С со 100 мкл буфера для фиксации, полученных в соответствии с протоколом производителя.
  6. Вымойте клетки дважды с пермеабилизации промывочного буфера (полученного в соответствии с протоколом производителя) центрифугированием при 300 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С.
  7. Готовят раствор антител к внутриклеточным Foxp3 окрашивания, и ресуспендируют осадок клеток с 50 мкл раствора антител против Foxp3.
    Примечание: Для дальнейшего анализа фенотипы Т конв и Т - клеток Reg, анти-CTLA могут быть добавлены на данном этапе.
  8. Инкубировать в течение 20 минут в темноте при 4 ° С и повторите шаг 3.6. После заключительной стадии промывки, ресуспендируют осадок клеток в 200 мкл буфера FACS и исследовать фенотип клеток с помощью проточной цитометрии 25.
  9. Ворота клетка насе живойции. Для анализа фенотипов T CONV клеток во время LCMV CL13 инфекции, изучить частоту Foxp3 - PD-1 + клеток среди CD4 + или CD8 + Т - клеток.
    Примечание: На основании экспериментальных результатов, процент Foxp3 - PD-1 + более чем на 50% в популяции как CD4 + и CD8 + Т - клеток в 16 г пи с LCMV CL13.
    1. Для анализа частоты и фенотипы клеток Т рег, исследовать частоты Foxp3 + или Foxp3 + PD-1 + клеток среди CD4 + Т - клеток.
      Примечание: На основании экспериментальных результатов, процент Foxp3 + или + PD-1 + клеток Foxp3 составляет более 20% в популяции CD4 + Т - клеток, соответственно.

4. Выделение клеток рег CD4 + CD25 + Т

Примечание: Объемы всех реагентов указаны ниже длястартовый номер ячейки 1 х 10 7 общих спленоцитов.

  1. Подготовьте клетки, как описано в разделе 2, используя наивные и LCMV хронически инфицированных мышей. Промывают клетки путем добавления 10 мл Т буфера выделения клеток. Центрифуга при 300 мкг в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Удалите супернатант полностью и ресуспендируют осадок клеток в 40 мкл буфера.
  2. Для обогащения CD4 + Т - клеток с использованием системы магнитного разделения клеток, добавляют 10 мкл биотин-антитело коктейлем и хорошо перемешать. Инкубировать в течение 10 мин при температуре 4 ° С.
  3. Добавьте 30 мкл буфера 20 мкл анти-биотин микро шарики для маркировки не-CD4 + Т - клеток и 10 мкл CD25-PE антитела для флуоресцентного мечения CD25 + клеток. Хорошо перемешать и инкубировать в течение 15 мин в темноте.
  4. Добавляют 2 мл буфера и передать клетки через 40 мкм клеточный фильтр с в новый 50 мл трубку для удаления остатков клеток. Промыть клетки центрифугированием при 300 х г в течение 10 мин при 4 ° C.Жидкость над осадком сливают полностью и ресуспендируют осадок клеток в 500 мкл буфера при плотности до 1,25 х 10 8 клеток.
  5. Применение клеток на колонку и собирают немеченых клеток, которые проходят через колонку. Промывают колонку добавлением 2 мл буфера и центрифугируют при 300 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Жидкость над осадком сливают полностью и ресуспендирования изолированных CD4 + Т - клеток в 90 мкл буфера.
  6. Для магнитной маркировки CD25 + клеток, добавляют 10 мкл анти-PE микрошариков, хорошо перемешать и инкубировать в течение 15 мин в темноте при 4 ° С.
  7. Добавляют 2 мл буфера и промыть клетки центрифугированием при 300 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Жидкость над осадком сливают полностью и ресуспендируют осадок клеток в 500 мкл буфера при плотности до 1 х 10 8 клеток.
  8. Для того, чтобы обогатить клетки CD4 + CD25 + Т рег, нанесите клетки на колонку для положительного отбора, и мыть Columп добавлением 2 мл буфера. Повторите для стирки три раза.
  9. Когда колонна пуст после последней стадии промывки, добавляют 1 мл буфера на колонку, и вымывать магнитно помечены CD4 + CD25 + клеток , используя поршень.
  10. Повторите шаги 4,8-4,9 для повышения чистоты выделенных клеток CD4 + CD25 + Т рег. Промывают клетки с буфером FACS центрифугированием при 300 х г в течение 10 мин при 4 ° C. Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют изолированных клеток CD4 + CD25 + Т - Reg в концентрации 2 х 10 6 клеток / мл в полной среды RPMI.
  11. Чтобы проверить чистоту клеток изолированной CD4 + CD25 + Т рег, с помощью 2 х 10 5 клеток от общего числа клеток , изолированных-CD4 + CD25 + Т рег. Пятно клеток с 50 мкл буфера FACS, содержащего анти-CD4 FITC и жизнеспособность клеток обнаружения реагента ближней ИК флуоресцентного реакционноспособного красителя.
    Примечание: CD25 уже метят PE во время изоляции.
  12. Инкубировать в течение 20 мин в темноте при температуре 4 ° С. Промывают клетки с буфером FACS центрифугированием при 300 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С. После промывки, ресуспендируют осадок клеток в 100 мкл буфера FACS и проверить чистоту с помощью проточной цитометрии.
  13. Ворота население живых клеток. Для анализа чистоты клеток Т - Reg, подтверждают , процент CD4 + CD25 + клеток.
    Примечание: На основании экспериментальных результатов, процент CD4 + CD25 + клеток среди очищенных клеток составляет более 80%.

5. Выделение CD8 + Т - клеток и этикетирование CD8 + Т - клеток

Примечание: Объемы всех реагентов указаны ниже для исходного числа клеток 1 × 10 7 спленоцитов общего.

  1. Приготовьте клетки, как описано в разделе 2 с помощью наивных мышей. Вымойте клеток путем добавления 10 мл изоляции Т-клеток нагишомэ. Центрифуга при 300 мкг в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Удалите супернатант полностью, и ресуспендируют осадок клеток в 40 мкл буфера.
  2. Для выделения CD8 + Т - клеток с использованием системы магнитного разделения клеток, добавляют 10 мкл биотин-антитело коктейль для маркировки не-CD8 + Т - клеток и хорошо перемешать. Выдержите в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
  3. Добавьте 30 мкл буфера и 20 мкл анти-биотин микрогранул. Хорошо перемешать и инкубировать в течение 10 мин при 4 ° C.
  4. Применение клеток на колонку и собирают немеченых клеток, которые проходят через колонку. Промывают колонку добавлением 2 мл буфера, в три раза.
  5. Центрифуга при 300 мкг в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Жидкость над осадком сливают полностью и ресуспендирования изолированных CD8 + Т - клеток в 2 мл буфера.
  6. Для проверки чистоты выделенных клеток, готовят 50 мкл раствора антител в буфере FACS. Ресуспендируют 2 х 10 5 клеток среди изолированных CD8 + Т - CELLs в 50 мкл раствора антител.
    Примечание: Для приготовления раствора антител, добавить анти-CD8 FITC, и реагент обнаружения жизнеспособность клеток (ближней ИК люминесцентная активный краситель) в буфер FACS.
  7. Инкубировать в течение 20 мин в темноте при температуре 4 ° С. Промывают клетки с буфером FACS центрифугированием при 300 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С. После промывки, ресуспендируют осадок клеток в 100 мкл буфера FACS и проверить чистоту клеток с помощью проточной цитометрии.
  8. Ворота население живых клеток. Для проверки чистоты CD8 + Т - клеток, подтверждают , процент CD8 + Т - клеток.
    Примечание: На основании экспериментальных результатов, процент CD8 + клеток среди очищенных клеток составляет более примерно 90%.
  9. Добавить PBS к изолированным CD8 + Т - клеток. Центрифуга при 300 мкг в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Удалите супернатант. Ресуспендируют Выделенную CD8 + Т - клеток в концентрации 1 × 10 7 клеток / мл в PBS.
  10. Для того, чтобы пометить CD8 + T CELLS для анализа подавления в пробирке, разбавленные пролиферации клеток трекинга краситель в фиолетовую PBS с получением концентрации 5 мкМ при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приблизительные возбуждения и эмиссии пики пролиферации клеток отслеживания фиолетового красителя, используемого в исследовании, 405 и 450 нм соответственно.
  11. Хорошо перемешайте равные объемы клеточной пролиферации трекинга фиолетовой красителем (5 мкМ) и суспензию клеток (1 × 10 7 клеток / мл CD8 + Т - клеток) в 15 мл пробирку, и инкубируют при 20 мин при 37 ° С. Вихре трубку каждые 10 мин.
  12. Заполните трубу с холодной полной RPMI СМИ, и оставить трубку в течение 10 мин при комнатной температуре. Центрифуга при 300 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре. Жидкость над осадком сливают полностью, и клетки вновь суспендируют при концентрации 2 х 10 6 клеток / мл с предварительно нагреты полной среды RPMI. Инкубируйте клетки в течение 15 мин при комнатной температуре.

6. Настройка In Vitro Подавление Пробирной Использование CD4 + CD25 + T <к югу> р и CD8 + Т - клеток

  1. Для подготовки анти-CD3 / CD28 покрытием шарики, передают соответствующий объем магнитных шариков до 15 мл трубки (2,5 мкл / 1 × 10 5 клеток). Добавить равный объем PBS и перемешать. Промыть центрифугированием при 300 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С и отбросить супернатант. Развести магнитных шариков в полной среде (50 мкл / лунку).
  2. Алиготе 50 мкл клеток CD4 + CD25 + Т рег на лунку U-дно 96-луночного планшета (1 х 10 5 клеток / лунку). Добавляют 50 мкл CD8 + Т - клеток в качестве иммунокомпетентных Т (Т соответственно) клеток на лунку (1 × 10 5 клеток / лунку). Добавляют 50 мкл разведенной анти-CD3 / CD28 бусин покрытием в каждую лунку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом шаге этикетки и установить контрольные лунки следующим образом : "только не стимулированных CD8 + Т - клеток" без анти-CD3 / CD28 бисером покрытием; "Только CD8 + Т - клеток" анти-CD3 / CD28-покрытием бусин; Только "CD8 + Т - клеток"Анти-CD3 / CD28-покрытием бусин;". Т рег Клеточные только "анти-CD3 / CD28-покрытием бусин клетки Т - рег может быть разбавлен полной среды и культивировали совместно с Т соотв клеток в различном соотношении Т RESP клетки: Т рег - клетки (1: 0,25-1: 1).
  3. Добавьте 50 мкл или соответствующий объем носителя во все лунки до общего объема 200 мкл. Закройте планшет фольгой и инкубировать в СО 2 инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 72 ч.

7. Анализ CD8 + Т - клеточной пролиферации и продукции цитокинов из CD8 + Т - клеток

  1. Для анализа продукции цитокинов, после 3-х дней культивирования отделяют супернатант каждой лунки в другую тарелку и выполнять твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).
    Примечание: Супернатант может быть аликвоты и хранили при -70 ° С. В этом эксперименте, анти-мышиного IFN-γ пластины покрытых антителами использовали для обнаружения IFN-gamma производства согласияING с протоколом производителя. Для того, чтобы определить , производство IFN-gamma пролиферирующих CD8 + Т - клеток на уровне одной клетки, внутриклеточное окрашивание цитокинов может быть выполнена.
  2. После того, как отделение надосадочной жидкости из каждой лунки, промойте пластину, содержащую клетки с FACS буфера и центрифуге при 300 мкг в течение 2 мин при температуре 4 ° С (3 раза).
  3. После промывки отбросить супернатант. Ресуспендируют осадок клеток с 50 мкл коктейля для антител окрашивания пролиферирующих CD8 + Т - клеток. Инкубировать в течение 20 мин в темноте при температуре 4 ° С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для приготовления коктейля антител, добавить анти-CD4 FITC, анти-CD8 PerCP-Cy5.5, и реагент обнаружения жизнеспособность клеток (ближней ИК люминесцентная активный краситель) в буфер FACS.
    Примечание: Антитела против различных маркеров , таких как CD44 или CD69 можно комбинировать с другими антителами , чтобы подтвердить активацию CD8 + Т - клеток. Следует помнить , что CD8 + Т - клетки уже были помечены пролиферации клеток отслеживания Violet красителя на шаге 5.10.
  4. Промыть два раза центрифугированием при 300 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С. После заключительной стадии промывки, отбросить супернатант, и зафиксировать клетки в течение 20 минут в темноте при 4 ° С со 100 мкл буфера для фиксации.
  5. Промыть два раза центрифугированием при 300 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С. Ресуспендируют клеток с 200 мкл буфера FACS и измеряют пролиферацию клеточной пролиферации трекинга фиолетовых красителя меченных CD8 + Т - клеток с помощью проточной цитометрии.
    1. Ворота популяция CD8 + Т - клеток среди живых клеток. Измерить процентное содержание разделенных и неразделенных клеток в соответствии с разбавлением клеточной пролиферации трекинга фиолетового красителя и клеточного разведения CD8 + Т -в соответствии со следующим уравнением. % Ингибирования = [(% от пролиферирующих CD8 + Т - клеток в отсутствие клеток Т - REG -% от пролиферирующих CD8 + Т - клеток в присутствии Т рег клеток) / (% от пролиферирующих CD8 + Т - клеток вотсутствие Т рег клеток)] х 100. Далее анализ данных с помощью проточной цитометрии программного обеспечения 25.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы получили мышей с персистирующей вирусной инфекцией, вводя их с 2 х 10 6 БОЕ LCMV CL13 внутривенно. Для того, чтобы исследовать фенотипические изменения в клетках рег Т и Т Conv ​​клеток при хронической вирусной инфекции, лимфоцитов селезенки , полученные от наивных и зараженных мышей окрашивали различными антителами и анализировали с помощью проточной цитометрии. На 16 - й пи, PD-1 в обоих повышающей регуляции Foxp3 - CD4 + Т -

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Несмотря на то, лишь небольшое число клеток Т - рег существуют у мышей и человека, важно , чтобы понять их функцию , поскольку они играют ключевую роль в регуляции иммунного ответа и поддержания иммунной толерантности. Номерные и подавляющие функции Т рег клеток увеличивается во время хронической вирусной инфекции 15-20, а также прогрессирования рака 13,14. Это, вероятно, из-за продолжающейся стимуляции антигеном. Для оценки Т рег клетки функционировать при антигенн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.-J.H. имеет патент и получает патентные отчисления, связанные с траекторией PD-1. У других авторов нет финансовых конфликтов интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Программой фундаментальных научных исследований через Национальный исследовательский фонд Кореи (NRF), финансируемой Министерством образования (2015R1A6A3A01020610 to HJP) и грантом от Корейского проекта исследований и разработок в области технологий здравоохранения, Министерства здравоохранения, социального обеспечения и семейных дел, Республика Корея (HI15C0493 в SJH).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
FITC Rat Anti-Mouse CD4RM4-5BD Biosciences553047
Cytofix/CytopermBD Biosciences554714
U-образные планшетыBD Biosciences353077
Фиксирующий буферBD Biosciences554655
FITC Rat Anti-Mouse CD257D4BD Biosciences553072
Клеточный фильтр, 70 ммBD Biosciences352350
Клеточный фильтр, 40 ммBD Biosciences352340
Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1)29F.1A12BioLegend135217
Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4RM4-5Biolegend100547
APC Anti-Mouse/Rat Foxp3 FJK-16seBioscience17-5773
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer SeteBioscience00-5223
PerCP-Cyanine5.5 Anti-mouse CD8a53-6.7eBiosicence45-0081
Мышиный ИФН-гамма Платина ELISAeBiosicenceBMS606
RPMI 1640GE Life SciencesSH30027
PBS (1x)GE Life SciencesSH30256
ACK Лизирующий буферGibcoA10492-01
L-глутамин, 200 мМ растворGibco No 25030
Пенициллин-стрептомицин, 10 000 ЕД/млGibco 10378-016
LIVE/DEAD Исправимый набор для окрашиванияLife technologiesL-34975
CD8a+ Набор для изоляции Т-клеток, мышьMiltenyibiotec130-104-075
CD4+ CD25+ Набор для выделения регуляторных Т-клеток, мышьMiltenyibiotec130-091-041
Разделительные колонки MACS, колонкиLDMiltenyibiotec130-042-901
Разделительные колонки MACS, LS колонкиMiltenyibiotec130-042-401
EDTA, 0,5 М (pH 8,0)PromegaV4231
2-меркаптоэтанолSigma Life ScienceM7522
Фетальная бычья сывороткаThermo Fisher ScientificSH30919.03
CellTrace Фиолетовый набор для пролиферацииклетокThermo Fisher ScientificC34557
BD Canto II проточный цитометрBD Biosciences
FlowjoTreeStar
HematocytomerMarienfeld superior
для культуры тканей мертвых клеток в ближнем инфракрасном диапазоне

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
  2. Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol. 155 (3), 1151-1164 (1995).
  3. Huang, C. T., et al. Role of LAG-3 in regulatory T cells. Immunity. 21 (4), 503-513 (2004).
  4. McHugh, R. S., et al. CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor. Immunity. 16 (2), 311-323 (2002).
  5. Takahashi, T., et al. Immunologic self-tolerance maintained by CD25(+)CD4(+) regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4. J Exp Med. 192 (2), 303-310 (2000).
  6. Manigold, T., et al. Foxp3+CD4+CD25+ T cells control virus-specific memory T cells in chimpanzees that recovered from hepatitis. C. Blood. 107 (11), 4424-4432 (2006).
  7. Andersson, J., et al. The prevalence of regulatory T cells in lymphoid tissue is correlated with viral load in HIV-infected patients. J Immunol. 174 (6), 3143-3147 (2005).
  8. Chen, X., et al. CD4(+)CD25(+)FoxP3(+) regulatory T cells suppress Mycobacterium tuberculosis immunity in patients with active disease. Clin Immunol. 123 (1), 50-59 (2007).
  9. Shafiani, S., Tucker-Heard, G., Kariyone, A., Takatsu, K., Urdahl, K. B. Pathogen-specific regulatory T cells delay the arrival of effector T cells in the lung during early tuberculosis. J Exp Med. 207 (7), 1409-1420 (2010).
  10. Belkaid, Y., Piccirillo, C. A., Mendez, S., Shevach, E. M., Sacks, D. L. CD4+CD25+ regulatory T cells control Leishmania major persistence and immunity. Nature. 420 (6915), 502-507 (2002).
  11. Grainger, J. R., et al. Helminth secretions induce de novo T cell Foxp3 expression and regulatory function through the TGF-beta pathway. J Exp Med. 207 (11), 2331-2341 (2010).
  12. cells in helminth infection: the regulators and the regulated. Trends Immunol. Taylor, M. D., van der Werf, N., Maizels, R. M. 33 (4), 181-189 (2012).
  13. You, Z. Tumor regulatory T cells potently abrogate antitumor immunity. J Immunol. 182 (10), 6160-6167 (2009).
  14. Curiel, T. J., et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med. 10 (9), 942-949 (2004).
  15. Dittmer, U., et al. Functional impairment of CD8(+) T cells by regulatory T cells during persistent retroviral infection. Immunity. 20 (3), 293-303 (2004).
  16. Robertson, S. J., Messer, R. J., Carmody, A. B., Hasenkrug, K. J. In vitro suppression of CD8+ T cell function by Friend virus-induced regulatory T cells. J Immunol. 176 (6), 3342-3349 (2006).
  17. Iwashiro, M., et al. Immunosuppression by CD4+ regulatory T cells induced by chronic retroviral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (16), 9226-9230 (2001).
  18. Suvas, S., Kumaraguru, U., Pack, C. D., Lee, S., Rouse, B. T. CD4+CD25+ T cells regulate virus-specific primary and memory CD8+ T cell responses. J Exp Med. 198 (6), 889-901 (2003).
  19. Suvas, S., Azkur, A. K., Kim, B. S., Kumaraguru, U., Rouse, B. T. CD4+CD25+ regulatory T cells control the severity of viral immunoinflammatory lesions. J Immunol. 172 (7), 4123-4132 (2004).
  20. Veiga-Parga, T., et al. On the role of regulatory T cells during viral-induced inflammatory lesions. J Immunol. 189 (12), 5924-5933 (2012).
  21. Wherry, E. J., et al. Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection. Immunity. 27 (4), 670-684 (2007).
  22. Jin, H. T., et al. Cooperation of Tim-3 and PD-1 in CD8 T-cell exhaustion during chronic viral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14733-14738 (2010).
  23. Punkosdy, G. A., et al. Regulatory T-cell expansion during chronic viral infection is dependent on endogenous retroviral superantigens. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3677-3682 (2011).
  24. Blackburn, S. D., et al. Coregulation of CD8+ T cell exhaustion by multiple inhibitory receptors during chronic viral infection. Nat Immunol. 10 (1), 29-37 (2009).
  25. Park, H. J., et al. PD-1 upregulated on regulatory T cells during chronic virus infection enhances the suppression of CD8+ T cell immune response via the interaction with PD-L1 expressed on CD8+ T cells. J Immunol. 194 (12), 5801-5811 (2015).
  26. Virgin, H. W., Wherry, E. J., Ahmed, R. Redefining chronic viral infection. Cell. 138 (1), 30-50 (2009).
  27. Penaloza-MacMaster, P., et al. Interplay between regulatory T cells and PD-1 in modulating T cell exhaustion and viral control during chronic LCMV infection. J Exp Med. 211 (9), 1905-1918 (2014).
  28. Chang, M., et al. The ubiquitin ligase Peli1 negatively regulates T cell activation and prevents autoimmunity. Nat Immunol. 12 (10), 1002-1009 (2011).
  29. Krishnamoorthy, N., et al. Early infection with respiratory syncytial virus impairs regulatory T cell function and increases susceptibility to allergic asthma. Nat Med. 18 (10), 1525-1530 (2012).
  30. Yadav, M., et al. Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo. J Exp Med. 209 (10), 1713-1722 (2012).
  31. Tai, X., et al. Basis of CTLA-4 function in regulatory and conventional CD4(+) T cells. Blood. 119 (22), 5155-5163 (2012).
  32. Rushbrook, S. M., et al. Regulatory T cells suppress in vitro proliferation of virus-specific CD8+ T cells during persistent hepatitis C virus infection. J Virol. 79 (12), 7852-7859 (2005).
  33. Sekiya, T., et al. The nuclear orphan receptor Nr4a2 induces Foxp3 and regulates differentiation of CD4. T cells. Nat Commun. 2 (269), (2011).
  34. Merianos, D. J., et al. Maternal alloantibodies induce a postnatal immune response that limits engraftment following in utero hematopoietic cell transplantation in mice. J Clin Invest. 119 (9), 2590-2600 (2009).
  35. Allakhverdi, Z., et al. Expression of CD103 identifies human regulatory T-cell subsets. J Allergy Clin Immunol. 118 (6), 1342-1349 (2006).
  36. Camisaschi, C., et al. LAG-3 expression defines a subset of CD4(+)CD25(high)Foxp3(+) regulatory T cells that are expanded at tumor sites. J Immunol. 184 (11), 6545-6551 (2010).
  37. Wang, R., et al. Expression of GARP selectively identifies activated human FOXP3+ regulatory T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13439-13444 (2009).
  38. Myers, L., et al. IL-2-independent and TNF-alpha-dependent expansion of Vbeta5+ natural regulatory T cells during retrovirus infection. J Immunol. 190 (11), 5485-5495 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CD3 CD28Foxp3in vitro

Похожие статьи