Здесь мы описываем простой метод внутримозгового и внутрисосудистого введения вирусных частиц или флуоресцентных микрогранул в мозг новорожденной мыши. Характер локализации вируса и наночастиц может быть обнаружен с помощью микроскопической оценки или гибридизации in situ.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Интрацеребровентрикулярное и внутрисосудистой инъекции вирусных частиц и флуоресцентных микрогранул в неонатальном мозга
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В исследовании на патогенезе вирусного энцефалита, метод инфекции имеет решающее значение. Первый из двух основных инфекционных путей в мозге является гематогенный путь, который включает в себя заражение эндотелиальных клеток и перицитов головного мозга. Во-вторых, интрацеребровентрикулярное (ICV) маршрут. После того, как в центральной нервной системе (ЦНС), вирусы могут распространяться на субарахноидальное пространство, мозговые оболочки и сосудистом сплетении через спинномозговую жидкость. В экспериментальных моделях, самые ранние этапы ЦНС вирусного распространения не хорошо охарактеризованы, и остается неясным, являются ли изначально заражены только определенные клетки. Здесь мы проанализировали распределение цитомегаловирус (ЦМВ) частиц во время острой фазы инфекции, называется первичной виремии после ICV или внутрисосудистого (IV) инъекции в неонатальном мозге мыши. В модели инъекции ICV, 5 мкл мышиного цитомегаловируса (MCMV) или флуоресцентные микросферы вводили в боковой желудочек в midpoiнт между ухом и глазом с помощью 10-мкл шприца с иглой 27 G. В модели инъекции IV, использовали 1 мл шприц с иглой 35 G. Трансиллюминаторе был использован для визуализации поверхностной височной (лица) вены у новорожденных мышей. Мы проникнуты 50 мкл MCMV или флуоресцентных микрогранул в поверхностной височной вены. Мозги были собраны в различные моменты времени после инъекции. MCMV геномы были обнаружены на месте с использованием метода гибридизации в. Флуоресцентные микросферы или зеленый флуоресцентный белок, экспрессирующие рекомбинантные частицы MCMV наблюдались методом флуоресцентной микроскопии. Эти методы могут быть применены ко многим другим патогенам для исследования патогенеза энцефалита.
Введение
При изучении вирусный энцефалит, начальное распределение вирусных частиц очень важно понять патогенез заболевания и выявить вирусные мишени в головном мозге. Большинство вирусов в размере от 20 до 300 нм, хотя Pandoravirus более чем 700 нм в размере 1. Распределение вирусных частиц в острой фазе инфекции может зависеть от размера частиц, распределение клеточных рецепторов или аффинности клеточных рецепторов на наличие вирусов. В моделях на животных, интрацеребровентрикулярное (ICV), внутрибрюшинного, прямой плацентарных, и внутривенно (IV), инфекций, были использованы для изучения патогенеза вирусного энцефалита. ICV-инокуляции вируса часто используется дл....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все экспериментальные протоколы были одобрены Animal Care комитета Хамамацу университета Медицинской школы путем.
1. Получение MCMV (Smith) и штамм рекомбинантного M32 с повышенной зеленого флуоресцентного белка (EGFP) -MCMV
- Генерировать рекомбинантный М32-EGFP-MCMV в соответствии с методом следующим образом (1.2 - 1.9) и , как описано ранее 8.
- Использование рекомбинантных вирусов, полученных из штамма Смита дикого типа MCMV (номер доступа: U68299). Вставьте EGFP (4361 пар оснований; п.н.) между 37,089 и 41,450 п.н. (M32 - M31 локуса) в геноме MCMV путем гомологичной рекомбинации.
- Amplify....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В исследованиях на патогенезе вирусного энцефалита, метод инфекции важно. Гематогенный путь представляет собой острую инфекцию эндотелиальных клеток и перицитов головного мозга, в то время как маршрут ICV представляет собой острую инфекцию распространяется через CSF через субарахноидальное пространство, достигая к мозговым оболочкам и сосудистом сплетении. Для анализа первого распределения частиц при остром энцефалите, гибридизация в выявлении геномы MCMV и непосредственное набл.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В моделях животных, ICV, внутрибрюшинного, прямой плацентарного и IV инфекций были использованы для изучения патогенеза вирусного энцефалита. Мы сосредоточили свое внимание на модели ICV и IV инъекций у новорожденных мышей для простоты процедур и в пользу непосредственного впрыска частиц в целевой области. Хотя внутрибрюшинного инфекция является простой способ, вирусные частицы распространяются системно посредством косвенного процесса 5,24. Прямая плацентарная инфекция является хорошим методом для изучения эм.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Авторы благодарят г-на Масааки Канету, г-жу Хироми Судзуки и г-жу Мицуэ Кавасиму (отделение регенеративной и инфекционной патологии, Медицинская школа Университета Хамамацу) за их превосходную техническую помощь. Эта работа была поддержана Японским обществом содействия науке, грант KAKENHI No 23590445.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Трис; трис(гидроксиметил)-аминометан | Sigma-Aldrich | T-6791 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H-1758 | |
| pEGFP-N1 вектор | Clontech | #6085-1 | |
| D-сорбит | Sigma-Aldrich | S-1876 | |
| SPHERO TM Флуоресцентный полистирол нильский красный 0.04 - 0.06 | Spherotech, Inc. | FP-00556-2 | |
| SPHERO TM Пенополистирол нильский красный 0.1 - 0.3 | Spherotech, Inc. | FP-0256-2 | |
| SPHERO TM Пенополистирол нильский красный 1.7 - 2.2 | Spherotech, inc. | FP-2056-2 | |
| 10% сыворотка для мышей | DAKO | X0910 | |
| C57BL/6 мышь | SLC, Inc. | ||
| Мышь ICR | SLC, Inc. | ||
| Модифицированные микролитровые шприцы (серия 7000) | Hamilton | ||
| Saito Medical | |||
| A Wee Sight Transilluminator | Phillips Healthcare | 1017920 | |
| O.C.T.Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| РНКаза A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Nonidet(R) P-40 | Nacalai | 25223-04 | |
| цитратный буфер (pH 6) x 10 | Sigma-Aldrich | C9999-100ml | |
| пепсин | Sigma-Aldrich | P6887 | |
| EDTA | dojindo | N001 | |
| Формамид | TCI | F0045 | |
| Декстрана сульфат натриевой соли | Sigma-Aldrich | 42867-5G | |
| Denhardt's Раствор (50x) | ThermoFishcer sceintific | 750018 | |
| дрожжевой тРНК (10 мг/мл) | ThermoFishcer sceintific | AM7119 | |
| SSC 20x | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| DAPI | ThermoFishcer sceintific | D1306 | |
| n-Hexane | Sigma-Aldrich | 296090 | |
| superfrost plus glass | ThermoFishcer sceintific | 12-55-18 | |
| Cytokeep II | Nippon Shoji Co. | ||
| FITC-конъюгированный изолектин Griffonia simplicifolia B4 | Vector laboratories, Inc. | L1104 | |
| Антимышь CD31 (PECAM-1) PE | ebioscience | 12-0311 | |
| ProLong Золото | ThermoFishcer sceintific | P36934 | |
| BIOREVO | KEYENCE | BZ-9000E |
Ссылки
- Philippe, N., et al. Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
- Passini, M. A., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
