Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Малоберцового нерва Метод Травма: Надежный Анализ для идентификации и испытания факторов, которые Ремонт нервно-мышечных синапсах

16.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54186

⸱

11 августа 2016 г.

 ,  , 
1Carilion Research Institute, Virginia Tech, 2Carilion School of Medicine, Virginia Tech, 3Department of Biological Sciences, Virginia Tech

В этой статье

Краткое содержание

Мы разработали метод повреждения нервов для надежного изучения реиннервации мышц и, следовательно, регенерации нервно-мышечных соединений у мышей. Этот метод включает в себя повреждение общего малоберцового нерва с помощью простой и легко воспроизводимой операции. Затем оценивается реиннервация мышц путем цельного монтажа разгибателя длинной мышцы пальца ноги.

Аннотация

Нервно-мышечного соединения (НМС) претерпевает пагубное структурные и функциональные изменения в результате старения, травм и болезней. Таким образом, крайне важно понять, клеточные и молекулярные изменения, связанные с поддержанием и ремонтом NMJs. Для этой цели мы разработали метод, позволяющий надежно и последовательно исследовать регенерации NMJs у мышей. Этот метод включает в себя повреждение нерва дробления общий малоберцовый нерв, как она проходит по боковой головки икроножной мышцы сухожилия возле колена. Использование 70 день старых самок мышей, мы показали, что моторные аксоны начинают reinnervate предыдущие постсинаптические цели в течение 7 дней после давки. Они полностью оккупировать свои прежние синаптические области на 12 дней. Для того, чтобы определить надежность этого метода травмы, мы сравнили цены реиннервация между отдельными 70-дневных самок мышей. Мы обнаружили, что количество reinnervated постсинаптических участков была одинаковой у мышей на 7, 9 и 12 дней после давки. Для того, чтобы определить, является лиэта травма анализ также может быть использован для сравнения молекулярных изменений в мышцах, мы исследовали уровни гамма-субъединицы мышечного никотиновых рецепторов (гамма-АХР) и мышечно-специфической киназы (салицилаты). Субъединица гамма-AChR и мускус, чтобы высоко активируются следующие денервации и вернуться к нормальному уровню после реиннервации НМС. Мы обнаружили тесную взаимосвязь между уровнями транскриптов этих генов и состояния иннервации мышц. Мы считаем, что этот метод ускорит наше понимание клеточных и молекулярных изменений, участвующих в восстановлении НМС и других синапсов.

Введение

У молодых взрослых и здоровых животных нервно-мышечное соединение (NMJ) представляет собой очень стабильную связь между пресинапсом, нервным окончанием α-моторного аксона, и постсинапсом, специализированной областью экстрафузального мышечного волокна, где никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (AChR) избирательно агрегируют1. Почти идеальное расположение пре- и постсинаптических аппаратов необходимо для правильной нейротрансмиссии, выживания α-моторных нейронов и мышечных волокон, а также двигательной функции. К сожалению, на функцию NMJ негативно влияет старение, такие заболевания, как боковой амиотрофический склероз (БАС), аутоиммунные заболевания и травмы мышц и периферических нервов2-5. Эти повреждения часто приводят к дегенерации пресинаптических нервных окончаний, в результате чего мышцы денервируются и значительно изменяются двигательные навыки. По этой причине идентификация молекул, которые функционируют для поддержания и восстановления NMJ, стала приоритетной задачей. Поскольку периферические нервы регенерируют и реиннервируют мишени, модели повреждения периферических нервов были использованы для идентификации молекулярных изменений, связанных с регенерацией NMJ.

Модели повреждения периферических нервов часто включают в себя либо полное перерезание, либо раздавливание определенных нервных ветвей6. После разреза эндоневриальная трубка должна быть реформирована, что замедляет регенерацию аксонов и реиннервацию клеток-мишеней и тканей. Тяжесть этого типа травмы также приводит к тому, что аксоны отклоняются от своего первоначального пути, что приводит к тому, что они не достигают первоначальных целей. Это отличается от нервов, поврежденных в результате раздавливания, когда эндоневрий остается непрерывным, обеспечивая путь для эффективного и правильного восстановления регенерирующих аксонов. Это также позволяет аксонам находить и ренервировать своих исходных партнеров по мышечным волокнам. Независимо от модели травмы, существует ряд клеточных и молекулярных изменений, которые должны произойти для регенерации аксонов и реиннервации мишеней. После травмы сегмент нерва, расположенный проксимальнее мишени, разрушается и удаляется с помощью процесса, называемого Уоллеровой дегенерацией7. Этот процесс включает в себя перепрограммирование и дедифференцировку шванновских клеток в немиелинизирующие клетки, которые секретируют регенеративные факторы, очищают миелин и рекрутируют макрофаги к месту повреждения. Макрофаги, в свою очередь, завершают выведение миелина и аксонального мусора, которые в противном случае препятствовали бы росту регенерирующего аксона9. Параллельно моторные и сенсорные нейроны активируют механизмы, необходимые для содействия регенерации их разорванных аксонов. Как только регенерирующий аксон достигает цели, он должен превратиться из ростового конуса в нервное окончание, способное правильно передавать (для моторных аксонов) илипринимать (для сенсорных аксонов) информацию. В связи с этим альфа-моторные аксоны претерпевают ряд хорошо организованных изменений, кульминацией которых является то, что их конус роста дифференцируется в полностью функциональное пресинаптическое нервное окончание, которое почти идеально противостоит постсинаптическому участку на мышечном волокне-мишени.

Седалищный, большеберцовый и добавочный нервы были основным выбором для изучения регенерации аксонов и NMJ12-14. Тем не менее, существует ряд недостатков при использовании этих моделей для изучения клеточных и молекулярных изменений, связанных с регенерацией NMJ между животными и в различных условиях. Во-первых, седалищный нерв снабжает большую часть мышц задней конечности, при этом травма значительно ограничивает как движение, так и чувствительность. Таким образом, невозможно использовать этот метод для изучения влияния физических упражнений отдельно или в сочетании с другими факторами. Кроме того, седалищный нерв является довольно толстой структурой и, таким образом, требует большого сжимающего усилия, чтобы полностью травмировать все аксоны. Это, в свою очередь, может привести к полной транссекции более поверхностных аксонов, оставляя эндоневральную трубку более глубоких аксонов нетронутой, что приводит к значительной вариабельности скорости и точности регенерации среди этих аксонов. Полная перерезка этого нерва еще менее желательна, учитывая, что многие аксоны не смогут воссоединиться с теми же мышечными волокнами. Дело осложняется тем, что седалищный нерв обладает внутренней анатомической изменчивостью, как в количестве, так и в месте происхождения его концевых нервных ветвей. Поэтому очень трудно нанести поражение на одном и том же участке. В то время как большеберцовый нерв меньше и более подвержен раздавливанию, также нет легкодоступного ориентира, который мог бы служить местом поражения этой нервной ветви.

Добавочная ветвь нерва (часть черепно-мозгового нерва XI), которая снабжает грудино-ключично-сосцевидную мышцу, также была использована для изучения регенерации NMJ15. Этот нерв особенно привлекателен, потому что NMJ в грудино-ключично-сосцевидной мышце могут быть легче визуализированы у живых животных по сравнению с NMJ в других мышцах. Но, как и в случае с седалищным и большеберцовым нервами, нет конкретного ориентира, который можно было бы использовать для повреждения этого нерва в одном и том же месте, ограничивая его в качестве модели для сравнения регенерации NMJ среди отдельных животных экспериментальной когорты. Непостоянный участок поражения вносит вариабельность в скорость реиннервации NMJ. Из-за этих недостатков представленная здесь процедура использует повреждение другой ветви периферического нерва для исследования регенерирующих NMJ.

Общий малоберцовый нерв, также называемый общим малоберцовым нервом, содержит множество особенностей, которые делают его надежным нервом для изучения регенерации NMJ между животными и при различных методах лечения. Общий малоберцовый нерв имеет предсказуемое анатомическое течение, поскольку он проходит по сухожилию латеральной головки икроножной мышцы в колене, пересечение которого служит стабильным ориентиром для поражений. Доступ к нерву осуществляется через небольшой и минимально инвазивный разрез рядом, но анатомически отделенный от интересующих мышц. Представленные здесь результаты демонстрируют, что регенерирующие моторные аксоны начинают реформировать NMJ в мышце-разгибателе пальца (EDL) через 8 дней после раздавливания малоберцового нерва у 70-дневных молодых самок мышей. Важно отметить, что характер и скорость реиннервации постоянны у животных одного возраста и пола и, следовательно, обеспечивают надежную модель травмы, которая значительно ускорит наше понимание клеточных и молекулярных изменений, необходимых для поддержания и восстановления NMJ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами NIH и протоколов животных, утвержденных Tech Institutional Animal Care и использование комитета Вирджинии.

1. Подготовка животных для хирургии

  1. Обезболить мышей смесью кетамина (90 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг) через подкожную паховой инъекции стерильный 1 мл инсулиновый шприц. Раствор носитель содержит смесь 0,9% солевой раствор, 17,4 мг / мл кетамина и 2,6 мг / мл ксилазина. Поместите животных обратно в клетках в ожидании лекарств, чтобы вступили в силу.
    Примечание: Если нагрузочной дозы не обеспечивает достаточное количество анестезии на время процедуры, дополнительные 25% от нагрузочной дозы могут быть введены.
  2. Монитор животных после инъекции, чтобы проверить наличие устойчивых дыхательных ставок и соответствующего снижения уровня возбуждения. Проверьте уровень возбуждения с задней ноги шнура, который не должен вызывать никакого ответа, когда достаточно наркозом.
    Примечание: Обычно это занимает 3-5мин для молодых взрослых мышей в среднем от 25 до 30 г. Если животное еще реагирует через 10 мин после инъекции 25% дополнительно анестетика нагрузочной дозы могут быть введены.
  3. Применяют вазелин и минеральное масло свет офтальмологическую мазь для глаз животного, чтобы предотвратить сухость кожи. Удалить животных из клетки и поместите на чистую ровную поверхность. Бритье нужную заднюю конечность от стопы к тазу с помощью электрического триммера волос, подвергая только латеральной конечности.
  4. Применение химического удаления волос на бритой месте в течение 1 мин. Вручную удалить волосы с помощью лабораторных салфеток. Очистите область с лишили волос лаборатории салфетку пропитанную в этаноле.

2. Хирургические процедуры

  1. Стерилизовать хирургические инструменты в автоклаве или другим соответствующим способом. Очистите место операции и хирургической доски с 80% этанол / H 2 0. Лечить хирургический сайт с proviodine. Поместите мышь на хирургической доске и выравнивают с ограничениями конечностей. Держатьцель задних конечностей в анатомически естественном положении с коленного сустава слегка вытянута без внутреннего или внешнего вращения.
  2. Поместите животное и доску под операционным микроскопом. Восток в надлежащее место разреза через пальпации поверхностных ориентиров, в частности костную коленного сустава и гребне между передней большеберцовой и икроножной мышц.
  3. Сделать примерно 3 см разрез через кожу с помощью скальпеля или пружинные ножницы при использовании общих щипцов для захвата. Сделать надрез перпендикулярно к нижележащему ходу общий малоберцовый нерв.
  4. Продолжить разрез через поверхностной фасции, обнажая двуглавой мышцы бедра и мышцы широкой латеральной. Отделить эти мышцы путем разрезания через присоединенную глубокой фасции. 1-2 см разрез должен быть достаточным.
  5. Втяните двуглавая мышца бедра каудально с использованием механических преднатяжителями, раскрывая общий малоберцовый нерв.
  6. Трассировка не нерв проксимально до ее интерсекция с сухожилием боковой головки икроножной мышцы обнаруживается. Примечание: Воздействие может потребоваться дополнительное манипулирование убранном кожи и мышц. Это пересечение используется в качестве стабильного ориентира для повреждения нерва.
  7. Возьмитесь нерв с тонким пинцетом, совместив советы параллельным образом к боковой границе икроножной сухожилия. Измельчите общий малоберцовый нерв, применяя устойчивый, жесткое давление на 5 сек.
  8. Подкреплять полный давка нерва путем визуального осмотра через хирургической области. Он появится полупрозрачная на месте повреждения. При использовании мыши, экспрессирующие флуоресцентных белков в периферических аксонов, флуоресценция исчезает с места повреждения.
  9. Удалить преднатяжителями и перестраивать мышцы в их анатомических позициях. Закройте место разреза с 6-0 шелковыми швами. 1-3 простых швами достаточно. Поместите выздоравливает мышь на грелку в чистой клетке.
  10. Мониторинг всех животных в течение 2 часов после оперыния для проверки дыхания и каких-либо неблагоприятных реакций на анестезию. Администрирование первоначальной дозы бупренорфина 0,05-0,10 мг / кг с помощью подкожной инъекции паховой сразу после восстановления после операции. Дайте 3 дополнительные дозы каждые 12 ч в течение следующих 48 часов. После полного выздоровления, возвращение мышей к средству по уходу за животными.

3. Выделение и Окрашивание разгибатель большого пальца (EDL) Мышцы

  1. Жертвоприношение животных с помощью изофлуран. Разлить 0,5 мл жидкого изофлуран в 50 мл пробирку, заполненную абсорбирующим labwipes. Поместите кэппированную трубку с животным в герметичном 2500 см 3 камеры. По крайней мере, 4 мин экспозиции достаточно. Испытание на потерю двустороннего Глазные, носок-пинча и ущемление хвоста рефлексы, чтобы гарантировать, что каждое животное находится в бессознательном состоянии, прежде чем приступать к перфузии.
  2. Транскардиальную заливать 16 животных сначала с 10 мл 0,1 М PBS, а затем 25 мл 4% параформальдегида в 0,1 М PBS (рН 7,4). Гепарин (30 единиц / 20г веса животного) могут быть добавлены с помощью PBS (10 ед / мл), чтобы предотвратить свертывание крови в небольших капиллярных коек, улучшение результатов перфузии.
  3. Удалите оболочку, покрывающую задние конечности, используя ножницы, чтобы вырезать трансверсально через кожу по окружности живота. Пил вниз кожу мимо задние конечности и ноги с помощью щипцов.
  4. Удалить поверхностные фасции задних конечностей, схватывая и шелушение с пинцетом. При использовании мыши, экспрессирующие флуоресцентных белков в периферических аксонов, после фиксировать всю мышей в течение ночи в 4% PFA в 50 мл пробирки. Промыть три раза PBS.
    Примечание: Фиксированный мыши могут быть сохранены в PBS при 4 ° С. Если нет, то пропустите этот шаг и перейдите к шагу 3.6 без почтовой фиксации животных.
  5. Рассеките из EDL мышцы 18 от мыши задних конечностей, будучи уверенным , что держать проксимального и дистального сухожилия , как нетронутыми , насколько это возможно.
  6. Выдержите EDL мышцы в блокирующем буфере (1X PBS, содержащим 0,5% Тритон Х-100, 3% бычьего сывороточного альбумина и 5% сыворотки козьего) в течение по крайней мере 1 часа.
  7. Для визуализации двигательных аксонов и их нервные окончания, место мышцы в пробирки, содержащие нейрофиламентов (1: 1000) и Synaptotagmin-2 (1: 250) антитела, разбавленного в блокирующем буфере в течение 3-х дней. Вымойте мышцы три раза 1x PBS и 10 мин каждый раз. Примечание: Пропустить этот шаг, если с помощью мыши, экспрессирующие флуоресцентные белки (XFP) в периферических аксонов.
  8. Пятно контралатеральной неповрежденной EDL в качестве положительного контроля для полного NMJ иннервации. Отрицательные контроли должны включать EDL, полученный через 4 дня после травмы, момент времени, когда НМС полностью денервированная, а также EDL окрашивали только вторичным антителом.
  9. Инкубируйте мышцы с соответствующими флуоресцентно меченых вторичных антител для обнаружения нейрофиламентов и Synaptotagmin-2 в течение 1 дня. Вымойте мышцы три раза 1x PBS и 10 мин каждый раз. Примечание: Этот шаг может быть выполнена вместе с шагом 3.10. Пропустить этот шаг, если с помощью мыши, экспрессирующие флуоресцентных белков в периферических аксонов.
  10. Для визуализации postsynaptic область НМС, инкубировать мышцы с 5 мкг / мл Alexa-555 с сопряженными альфа-бунгаротоксина разведенного в блокирующем буфере в течение по крайней мере 2 часов. Вымойте мышцы три раза 1x PBS и 10 мин каждый раз.
  11. Чтобы смонтировать целые мышцы на положительно заряженных стеклах, поместите мышцы непосредственно на слайде, добавьте несколько капель глицерина на основе монтажа среды на слайде и накрыть покровным. Нажмите покровное против скольжения, чтобы сгладить мышцы. Замочить от крепежных средств массовой информации по периметру слайд и покровное с использованием лабораторных салфеток. Нанесите лак для ногтей, чтобы запечатать края между покровным и горкой.

4. визуализации и анализа данных

  1. Для анализа структуры НМС, изображения мышца EDL с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопа, оборудованного для возбуждения 488, 555 и 633 нм свет и захватить испускаемого света с 20x и 40х.
  2. Для того, чтобы визуализировать всю NMJs, создать проекция максимальной интенсивности изображения в оптическом диапазоне секции на расстоянии от 1 до 2 мкм друг от друга, простирающуюся от минимальных до максимальных видимой области НМС. Создание максимальных прогнозов интенсивности с использованием коммерчески доступного программного обеспечения для обработки изображений.
  3. Для определения цены реиннервации, классифицировать NMJs как: 1) полностью денервированная = постсинаптическая сайт полностью лишен контакта с аксона, менее чем в 5% колокализации между аксоном и АХР. 2) Частично иннервированы = аксона частично перекрывает postsynapse, 5-95% колокализацию между аксоном и АХР. 3) Полный иннервации = почти идеальный прилегание между до и после синапса, более чем на 95% колокализация между аксоном и АХР. Исключить NMJs, которые лежат перпендикулярно плоскости изображения или не полностью визуализированы в изображении. Примечание: Во всех этих экспериментах, были исследованы по крайней мере 3 животных и 50 NMJs на животное. Результаты были признаны значительным использованием критерия Стьюдента с P значением менее 0,05.
  4. Для того, чтобы ослепить оператора, отдельные лица могут выполнятьхирургия и анализа изображений. Без знания групп лечения, анализатор может быть объективным с NMJ скоринга. В качестве альтернативы, изображения могут быть случайным образом и представлены оператору для анализа без знания исходного животного.

5. Количественная ПЦР

  1. Жертвоприношение животных с помощью изофлуран и цервикальной дислокации. Снять кожу и поверхностные фасции, охватывающую мышцы ног в соответствии с шагом 3.3. Рассеките передней большеберцовой мышцы и EDL в соответствии со стадией 3.4.
  2. Флэш заморозить всю передней большеберцовой мышцы и EDL в 1,5 мл трубки над жидким азотом. Удалите ткань из трубки и поместить в предварительно охлажденную ступку частично погруженной в жидкий азот. Измельчите замороженные мышцы в мелкий порошок, используя ступку и пестик.
  3. Растворите замороженный порошок мышц в коммерчески доступный реагент для экстракции РНК и выполнения экстракции РНК и геномную ДНК, удаление с коммерчески доступного набора в соответствии с I-изготовителяnstructions.
  4. Выполнение обратной транскрипции с коммерчески доступным обратной транскриптазы смеси в соответствии с инструкциями изготовителя.
  5. Выполните КПЦР с использованием коммерчески доступного набора с использованием соответствующих генов домашнего хозяйства (см таблицу материалов). Используйте имеющийся в продаже количественный ПЦР амплификатор для проведения ПЦР (смотри таблицу материалов).
  6. Заданное значение температуры отжига до 58 ° C. Настройте дополнительные параметры велосипедного спецификациям производителя Taq полимеразы / SYBR зеленый микс. Включите последний шаг кривой плавления в тепловой программе Cycler, состоящей из 0,5 ° C постепенным увеличением от 65 ° C до 95 ° C, чтобы проверить на специфичности праймера и праймера образование димеров.
  7. Определить относительные уровни экспрессии мРНК с помощью 2 - метод ΔΔCT 21 с использованием 18S РНК в качестве контрольного гена.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Общий малоберцовый нерв, также называемый общий малоберцовый нерв, возникает из седалищного нерва над подколенной ямки, где он качается вокруг головки малоберцовой кости к переднему аспекту ног (рис 1А). Там она разветвляется на поверхностных и глубоких малоберцовой нервов, а также поставляет dorsiflexors стопы и пальцев ног (передней большеберцовой, разгибатель большого пальца и Brevis и разгибателей halluces LONGUS мышцы), а также everters стопы (малоберцовой мышцы). Э...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Метод, представленный в этой рукописи предоставляет уникальные возможности для выявления механизмов, участвующих в восстановлении нервно-мышечных синапсах (НМС). Этот метод включает в себя дробление общий малоберцовый нерв, как она проходит через икроножной сухожилия возле колена. Покажем, что после всего лишь 5 сек сжатия нерва с пинцетом, полное вырождение отмечена 4 дня после травмы. У молодых взрослых мышей, альфа-моторные аксоны начинают reinnervate предыдущие сайты синаптические в длинный разгибатель пальцев (EDL)...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят сотрудников лаборатории Вальдеса за интеллектуальный вклад в эксперименты и комментарии к рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
КетаминVetOne501072
XylazineLloyd Inc. 003437 
Бупренорфин  Зоофарм1Z-73000-150910 
NairNair
Kim-wipesKimtech34155
Электрическая бритваBraintree ScientificCLP-64800
80% EtOH/H20
10% Proviodine
1 мл инсулиновый шприц
Весенние ножницыВаннас91500-09
No15 скальпельBraintree ScientificSSS 15
#5 ЩипцыDumont11252-00
6-0 шелковый шов на обратной режущейигле  Шовный материал экспресс752B 
Грелка для грызуновBraintree ScientificAP-R-18.5
Alexa 555 конъюгированные альфа-BTXМолекулярные зондыB35451
VectashieldVector LabsH-1000
Olympus Стерео Зум МикроскопOlympus562037192
Zeiss 700 Конфокальный микроскопZeiss
Перистальтический перфузионный насос с переменным расходомFisher Scientific13-876-3
Aurum Total RNA Mini KitBio-Rad7326820
Bio-Rad iScript RT SupermixBio-Rad1708840
SsoFast Evagreen SupermixBio-Rad1725200
Bio-Rad CFX96Bio-Rad1855196
Puralube Vet мазьPuralube1621
Антитела к синаптотагмину-2-Онлайн-ABIN401605
Антитела к антителам к нейрофиламенту-Онлайн-ABIN2475842

Ссылки

  1. Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Induction, assembly, maturation and maintenance of a postsynaptic apparatus. Nat. Rev. Neurosci. 2 (11), 791-805 (2001).
  2. Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease. Front. Neurosci. 8, 252(2014).
  3. Apel, P. J., Alton, T., et al. How age impairs the response of the neuromuscular junction to nerve transection and repair: An experimental study in rats. J Orthop Res. 27 (3), 385-393 (2009).
  4. Balice-Gordon, R. J. Age-related changes in neuromuscular innervation. Muscle Nerve Suppl. 5, S83-S87 (1997).
  5. Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Fox, M. A., Sanes, J. R. Shared resistance to aging and ALS in neuromuscular junctions of specific muscles. PloS one. 7 (4), e34640(2012).
  6. Nguyen, Q. T., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Pre-existing pathways promote precise projection patterns. Nat. Neurosci. 5 (9), 861-867 (2002).
  7. Küry, P., Stoll, G., Müller, H. W. Molecular mechanisms of cellular interactions in peripheral nerve regeneration. Curr Opin Neurol. 14 (5), 635-639 (2001).
  8. Gaudet, A. D., Popovich, P. G., Ramer, M. S. Wallerian degeneration: gaining perspective on inflammatory events after peripheral nerve injury. J Neuroinflammation. 8, 110(2011).
  9. Chen, P., Piao, X., Bonaldo, P. Role of macrophages in Wallerian degeneration and axonal regeneration after peripheral nerve injury. Acta Neuropathol. 130 (5), 605-618 (2015).
  10. Chen, Z. -L., Yu, W. -M., Strickland, S. Peripheral regeneration. Annu Rev Neurosci. 30, 209-233 (2007).
  11. Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions. Nat. Rev. Neurosci. 15 (11), 703-718 (2014).
  12. Geuna, S. The sciatic nerve injury model in pre-clinical research. J. Neurosci. Methods. 243, 39-46 (2015).
  13. Batt, J. A. E., Bain, J. R. Tibial nerve transection - a standardized model for denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice. J. Vis. Exp. (81), e50657(2013).
  14. Savastano, L. E., Laurito, S. R., Fitt, M. R., Rasmussen, J. A., Gonzalez Polo, V., Patterson, S. I. Sciatic nerve injury: a simple and subtle model for investigating many aspects of nervous system damage and recovery. J. Neurosci. Methods. 227, 166-180 (2014).
  15. Kang, H., Lichtman, J. W. Motor axon regeneration and muscle reinnervation in young adult and aged animals. J Neurosci. 33 (50), 19480-19491 (2013).
  16. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).
  17. Feng, G., Mellor, R. H., et al. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  18. Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).
  19. Bowen, D. C., Park, J. S., et al. Localization and regulation of MuSK at the neuromuscular junction. Dev Biol. 199 (2), 309-319 (1998).
  20. Gay, S., Jublanc, E., Bonnieu, A., Bacou, F. Myostatin deficiency is associated with an increase in number of total axons and motor axons innervating mouse tibialis anterior muscle. Muscle Nerve. 45 (5), 698-704 (2012).
  21. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), San Diego, Calif. 402-408 (2001).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Регенерация нервно-мышечного синапсатест с раздавливанием нервареиннервация двигательных аксоновэкспрессия гамма-АхРап-регуляция MuSKрегенерация периферических нервованализ синаптической реиннервацииопределение экспрессии генов методом количественной ПЦРхирургическое раздавливание нерва
Малоберцового нерва Метод Травма: Надежный Анализ для идентификации и испытания факторов, которые Ремонт нервно-мышечных синапсах
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.